Regulační Účinek Melatoninu na Cytokinů Poruchy v Pristane-Indukovaný Lupus Myši

Abstrakt

Systémový lupus erythematodes (SLE) se vyvíjí v souvislosti s mnoha faktory životního prostředí. Podle našeho názoru je důležitější zkoumat účinek melatoninu na SLE související s životním prostředím. V této studii bylo k indukci SLE u samic BALB/C myší použito 0,5 ml pristanu. Melatonin (0, 01, 0, 1, 0 mg/kg) byl perorálně podáván bezprostředně po injekci pristanu po dobu 24 týdnů. IgM anti ssDNA a histonové protilátky byly detekovány po 0, 1, 2, 4, 8 týdnech pristane injekce. Hladiny IL-2, IL-6 a IL-13 byly detekovány po 24 týdnech. Byly také pozorovány renální léze. Výsledky ukázaly, že melatonin znepřátelil zvýšení hladiny IgM anti-ssDNA a histonů autoprotilátky. Melatonin by také mohl snížit produkci IL-6 a IL-13 a zvýšit produkci IL-2. Kromě toho by melatonin mohl snížit renální léze způsobené pristanem. Tyto výsledky naznačují, že melatonin má příznivý účinek na lupus indukovaný pristanem prostřednictvím regulace poruch cytokinů.

1. Úvod

Systémový lupus erythematodes (SLE nebo Lupus) je autoimunitní onemocnění, které může napadnout normální tělesnou tkání a buněk, což vede k zánětu a poškození tkáně . SLE se vyskytuje v jakémkoli věku a v jakémkoli pohlaví. Ženy však mají větší pravděpodobnost SLE než muži . Kromě toho byla také hlášena porucha v cytokinové síti u SLE, včetně IL-1, IL-2, IL-6, IL-13 a IFN -. Tyto cytokiny mají úzké vztahy s vývojem SLE, jako je produkce autoprotilátek a imunokomplexní nefritida. Existují však některé protichůdné výsledky o změnách některých cytokinů v různých zprávách.

v posledních letech byla stále větší pozornost věnována faktorům prostředí, které mohou být zapojeny do patogeneze SLE . Autoimunitní onemocnění jsou v průmyslových zemích stále častější a tato onemocnění mohou být ovlivněna faktory prostředí . Pristane je pravděpodobným kandidátem jako environmentální spouštěč SLE u vnímavé populace. Pokusy na zvířatech ukázaly, že pristane může vyvolat lupus-jako autoimunitní onemocnění příznaky u kmene myší (BALB/c), jako jsou vysoké hladiny autoprotilátek a imunitních-komplexní glomerulonefritidy . Některá epidemiologická šetření také prokázala, že všechny osoby s pristanem v krvi měly zřetelná autoimunitní onemocnění nebo příznaky autoimunitního onemocnění . Kromě toho se zdá, že pristane nalezený v minerálním oleji, žraločím oleji a mnoha potravinách je možnou expozicí prostředí, která může vyvolat SLE. Mohlo by tedy být vhodnější zkoumat environmentální faktory zapojené do SLE pomocí pristane indukovaného myšího modelu SLE.

Melatonin je syntetizován a vylučován hlavně epifýzou, která může dělat specifické receptory v a z centrálního nervového systému. Melatonin může nejen přímo ovlivnit zánět a imunitní buňky, ale má na něj také nepřímé vlivy prostřednictvím thalamencefalonu . Ještě důležitější je, že melatonin je považován za důležitou účinnou látku v neuroimunitně-endokrinním systému . Je schopen regulovat nerovnováhu cytokinové sítě u některých autoimunitních onemocnění, jako je revmatoidní artritida a adjuvantní artritida . Některé experimenty zkoumaly jeho účinky na myši MRL-lpr/lpr a ukázaly, že melatonin byl prospěšný pro spontánní SLE u samic myší . Vzhledem k tomu, že životní prostředí je v moderní společnosti důležitým faktorem SLE, více jsme se zajímali o účinky melatoninu na SLE související s životním prostředím.

pro zkoumání úlohy melatoninu v SLE, zejména v lupusu souvisejícím s životním prostředím, byly použity myši indukované pristanem. Byly také stanoveny účinky melatoninu na poruchy cytokinů a následující změny v modelu SLE indukovaném pristanem.

2. Materiály a metody

2.1. Zvířata

šedesát samic BALB / C myší ve věku dvou měsíců (g) bylo dodáno experimentálním zvířecím centrem Anhui Medical University. Všechny experimentální protokoly popsané v této studii byly schváleny etickou revizní komisí pro experimentování na zvířatech Ústav klinické farmakologie, Anhui Medical University.

2.2. Materiály

Melatonin byl zakoupen od Sigmy. Pristane, tepelně denaturované calf thymus DNA (ssDNA), celkem telecí brzlík histon (histon), concanavalin A (ConA), a lipopolysacharidů (LPS) byly také od Sigma. Byly zakoupeny Biotin-konjugované protilátky proti králíkům a myším IgM a avidin značený křenovou peroxidázou . Sady myši interleukin-2 ELISA a sady interleukin-6 ELISA byly zakoupeny od společnosti ADL. Sady Mouse interleukin-13 ELISA byly zakoupeny od společnosti BIOO.

2.3. Experimentální Protokoly

Šedesát samice BALB/c myši byly náhodně rozděleny do šesti skupin: normální kontrolní skupiny model group, prednison-léčba skupiny, která sloužila jako pozitivní kontrolní skupina, a melatonin (0.01, 0.1, 1.0 mg/kg) léčba skupiny, včetně melatoninu skupiny one (MT1), melatonin skupina dva (MT2), a melatonin skupina tři (MT3). Myším v normální kontrolní skupině byla podána intraperitoneální injekce 0.5 ml normálního fyziologického roztoku (NS) a ostatním skupinám byla podána intraperitoneální injekce 0,5 ml pristanu. Myši v normální kontrolní skupině a modelové kontrolní skupině dostávaly intragastrické podávání NS denně po první léčbě. Myším v pozitivní kontrolní skupině bylo podáno intragastrické podání 5 mg/kg prednisonu (Pre) denně. Myši ve skupině MT1 byly intragastricky léčeny 0, 01 mg / kg melatoninu, MT2 0, 1 mg/kg melatoninu a MT3 1, 0 mg/kg melatoninu. Séra byla odebrána z ocasní žíly před léčbou (0) a 2, 4 a 8 týdnů po léčbě, aby se změřila hladina autoprotilátek. Dvacet-čtyři týdny po pristane správy, všechny myši byly zabity, a sleziny byly odstraněny pro imunologické detekce; mezitím, nephric tkání byly analyzovány pomocí světelné mikroskopie.

2.4. Enzymoimunoanalýzy (Elisa), Anti-ssDNA a Histonů Protilátky

Anti-ssDNA a histonů IgM protilátky byly detekovány pomocí ELISA technika podobná té popsané . 96-jamkové Elisa destičky potažené 10 mg/L ssDNA nebo histonovými antigeny byly inkubovány přes noc ve 4. Následující den byly desky promyty PBS-Tween. Destičky byly inkubovány s blokujícím pufrem (PBS-2% bovinního sérového albuminu) přes noc na 4 a promyty PBS-Tweenem. Poté inkubovány přes noc při 4 s myší séra zředěného 1 : 250, desky byly znovu promyty, a pak inkubovány po dobu 2 hodin při 4 s biotin-konjugovanou-králík antimouse IgM protilátky ředěné 1 : 200. Následně byly destičky promyty a inkubovány po dobu 2 hodin při 4 s avidinem značeným křenovou peroxidázou v ředění 1 : 200. Destičky se pak znovu promyjí a do jamek se přidá 100 L substrátu —tetramethylbenzidinu (TMB) a roztoku peroxidu vodíku po dobu 30 minut při 37. Reakce byla ukončena přidáním 50 L 2 M H2SO4 na jamku. Intenzita žluté barvy byla odečtena při 490 nm ve čtečce mikrodestiček. Séra dalších osmi normálních myší BALB / c byla odebrána a detekována současně a průměrná hustota a SD byly vypočteny tak, aby sloužily jako kontrola. Průměrné indexy enzymů (EI) vzorků v různých skupinách byly vypočteny jako:

2,5. Kultura slezinných buněk a indukce cytokinů

Kultura slezinných buněk a indukce cytokinů byly modifikacemi metod popsaných v . Krátce, jednobuněčné suspenze byly připraveny z slezinu asepticky odebrán z myší a kultivovány ve 24-well kultivační destičky v konečné koncentrace buněk/ml. Buňky byly kultivovány v RPMI-1640 doplněném 10% fetální telecí sérum, 2 mM glutamin, 1 mM pyruvát sodný, 50 M 2-merkaptoethanolu, a 10 ml penicilin, streptomycin a antimykotický roztok/L (Sigma). Kultury byly stimulovány 3 mg / L ConA, 12 mg / L LPS nebo samotným médiem a inkubovány při 37 ve zvlhčeném vzduchu s 5% CO2. Supernatant byl sklizen při 48 h a konzervován při 20 pro cytokinové testy.

2.6. Cytokin Testy

koncentrace interleukinu-2 (IL-2), interleukin-6 (IL-6), interleukin-13 (IL-13) v supernatantu byly stanoveny pomocí vhodných komerčních Elisa pro myší formu těchto cytokinů. Intenzita každého vzorku byla odečtena při 450 nm v mikrodestičkovém spektrofotometru.

2.7. Histopatologické techniky

ledviny odebrané při obětování myší byly fixovány po dobu 24 hodin v neutrálním pufrovaném formalinu před vložením parafinu. Řezy byly barveny hematoxylinem a Eosinem a Jones silver methenamine a pak zkoumány pod světelným mikroskopem pro závažnost renální léze. Glomerulonefritida, renální tubulární léze a intersticiální zánět byly pozorovány, a stupeň závažnosti histologických lézí charakteristické lupus nefritida byla vyhodnocena jako chybějící (), mírné (), střední (), a těžká ().

2.8. Statistická analýza

výsledky byly vyjádřeny jako SD. Statistická analýza byla provedena pomocí obousměrného t-testu studenta s minimální úrovní významnosti

3. Výsledky

3.1. Účinky Melatoninu na Hladiny IgM Anti-ssDNA a Histonů Protilátek v Séru

hladiny IgM anti-ssDNA a histonů protilátky byly významně odlišné mezi pristane-injekce a melatonin experimentálních skupin (obr. 1(a) a 1(b)).

()

(b)

(a)
(b)

Obrázek 1

séra myší v každé skupině byly odebrány před zahájením léčby (0), 2, 4, a 8 týdnů později, a hladiny IgM anti-ssDNA a Antihistone protilátky byly detekovány pomocí ELISA. EI byla vypočtena podle vzorce. (a) hladina IgM anti-ssDNA protilátky v každé skupině, (b) hladina IgM Antihistonové protilátky v každé skupině. Údaje byly uvedeny v průměru±SD (n=6-8). P * <.05, P * * <.01 versus séra při 0 wk, ∆P<.05, p p <.01 versus séra u modelových kontrolních myší.

Dva týdny po jedné intraperitoneální injekci pristane, úroveň anti-ssDNA IgM protilátek v séru se začal zvyšovat samozřejmě, dosáhl vrcholu ve 4 wk, pak začala klesat, a nakonec se vrátil k normálu v 8 wk. Ve skupině MT1 se hladina anti-ssDNA IgM protilátek v séru také zvýšila a dosáhla vrcholu při 4 wk, ale poté se ve srovnání s kontrolní skupinou modelu snížila zřetelněji (). V MT2 skupiny, úroveň anti-ssDNA IgM protilátek v séru zvýšila během prvních čtyř týdnů, ale mnohem nižší než u modelu group (), a zůstal normální v ostatních obdobích. Ve skupině MT3 se hladina anti-ssDNA IgM protilátek nezvýšila (Obrázek 1(a)).

Antihistonové protilátky v séru se po injekci zvýšily o 1 wk, dosáhly vrcholu při 4 wk, poté postupně klesaly a vrátily se k normálu při 8 wk. Ve skupině MT1 byly hladiny Antihistonových protilátek v séru významně nižší než hladiny modelové kontrolní skupiny () a byly zpět k normálu při 4 wk. Ve skupinách MT2 a MT3 se hladiny protilátek během prvních čtyř týdnů zvýšily, ale mnohem nižší než u modelové skupiny (), a v ostatních obdobích zůstaly normální (Obrázek 1(b)).

3.2. Účinky Melatoninu na Cytokiny Výroby

získat lepší vhled do vlivu melatoninu na cytokinů v SLE, produkce Th1-typ a Th2 typu cytokinů tím, že splenocytes stimulovány ConA nebo LPS byl testován v průběhu myší lupus. Výsledky ukázaly, že produkce IL-2, IL-6 a IL-13 se změnila u myší SLE indukovaných pristanem (Obrázek 2). Produkce SPLENOCYTŮ IL-2 z myší v kontrolní skupině modelu byla nižší než u normálních myší (), zatímco produkce SPLENOCYTŮ IL-6 a IL-13 z myší v kontrolní skupině modelu byla vyšší než u normálních myší (). V MT2 a MT3 skupin, IL-2 úrovně bylo na normální úrovni a vyšší než u modelu myší zřejmě (), zatímco IL-6 a IL-13 byly hladiny nižší než u modelu myší samozřejmě (, ) (Obrázek 2).

()

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Obrázek 2

Všechny myši byly obětovány na konci 24 týdnů, a sleziny lymfocytů byly nasazeny v 1×106 buněk na jamku. Koncentrace IL-2 ve splenických lymfocytech byly stimulovány po dobu 48 hodin 3 mg/L ConA. Koncentrace IL-6 a IL-13 ve splenických lymfocytech byly stimulovány po dobu 48 hodin 12 mg / L LPS. Koncentrace IL-2, IL-6 a IL-13 V supernatantech kultury byly detekovány pomocí ELISA. Údaje byly uvedeny v průměru± SD (n=4-5). P * * <.01, P * <.05 versus normální kontrolní skupina, ∆P<.05, p p <.01 versus kontrolní skupina modelu.

3.3. Účinky Melatoninu na Renální Histopatologické Změny

renální histopatologické změny myší jsou uvedeny v Tabulce 1 a na Obrázku 3.

()

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Obrázek 3

Ledviny shromažďovány v době, kdy oběti byly obarveny s H&E na histologické vyšetření. a) normální kontrolní skupina (he×200). b) kontrolní skupina modelu (he×200). c) modelová kontrolní skupina (he×400). d) skupina MT (HE×200).

jak je znázorněno na obrázku 3(a), renální abnormality nebyly pozorovány u normálních myší. Objem a počet buněk glomerulů byly normální. Glomerulární kapilární stěna byla tenká. V tubulu nebyl pozorován žádný proteinový odlitek. Infiltrace lymfocytů a proliferace fibroblastů nebyly pozorovány u renálních intersticiálních buněk.

, Jak je znázorněno na Obrázcích 3(b) a 3(c) a Tabulky 1, většina pristane-injekčně myších bylo zjištěno, renální abnormality v rozmezí od mírné až těžké vzory. Některé glomeruly vykazovaly glomerulární atrofii s dilatací kapilár a zesílením kapilárních stěn. Některé citace odhalily tvorbu trombu. Bylo také pozorováno mezangiální rozšíření a zvýšení buněčných vrstev. Glomerulární stěna kapsle byla tlustá a prostor mezi stěnou kapsle a endoteliálními buňkami zmizel v těžce postiženém glomerulu. Některé renální tubuly vykazovaly dilataci a proliferaci epiteliálních buněk. Proteinové odlitky byly vidět v tubulu. U renálních intersticiálních buněk byla pozorována infiltrace zánětlivých buněk, jako jsou monocyty, lymfocyty a plazmocyty s fokální agregací. Byly také pozorovány proliferace intersticiálních fibroblastů.

u myší léčených melatoninem došlo k určitým zlepšením různého stupně (obrázek 3(d) a tabulka 1). Glomerulární atrofie a zesílení kapilárních stěn byly změněny na mírný nebo střední stupeň. Zlepšilo se také mezangiální rozšíření. Prostor mezi stěnou kapsle a endoteliálními buňkami byl menší než u normálních myší, ale došlo ke zlepšení ve srovnání s neléčenou modelovou skupinou. Byla také pozorována mírná infiltrace lymfocytů. Některé renální tubuly vykazovaly mírnou dilataci a několik proteinových odlitků. Nicméně všechny změny byly méně závažné než u modelových myší.

4. Diskuse

v této studii byly pozorovány imunitní poruchy myší primovaných pristanem a účinky melatoninu. Od anti-DNA a histonů protilátky byly citlivé na SLE , jsme zkoumali změny IgM anti-ssDNA a Antihistone protilátky a nalézt vysoké hladiny autoprotilátek v pristane-u myší s injekcí. Renální léze byly také nalezeny u myší. Tyto výsledky byly v souladu s předchozími zprávami. Také jsme zjistili, že melatonin znepřátelil zvýšení hladiny IgM anti-ssDNA a histonů autoprotilátky, a melatonin může snížit renální léze způsobené pristane. Pristane je peritoneální dráždivá látka. Je dobře známo, že IgM třídy jsou produkovány B1 (CD5+) B-buňky, podskupiny a podskupiny B1 je vysoce obohacený v peritoneální dutině a je rozšířen v BALB/c myších , zvýšit možnost, že IgM anti-ssDNA a Antihistone protilátky vyvolané jsem.p. pristane jsou odvozeny z podmnožinou . Předchozí studie uváděly, že melatonin měl účinky na první protilátkovou imunitní odpověď (IgM, IgG). Některé studie ukázaly, že melatonin měl obousměrnou modulaci na lymfocytech . Mysleli jsme si tedy, že melatonin může zlepšit příznaky SLE modulací nadprodukce B buněk.

síť cytokinů hraje důležitou roli ve vývoji SLE. V některých experimentech in vitro by melatonin mohl inhibovat imunitní účinky některých cytokinů a T lymfocytů . Pozorovali jsme tedy účinky melatoninu na narušení sítě cytokinů. IL-6 je myšlenka jako zánětlivý cytokin, který je vylučován různé tkáně buněk, včetně makrofágů a Th2-buněk. Úroveň IL-6 má pozitivní korelaci s indexem aktivity SLE. Naše výsledky ukázaly, že hladina IL-6 byla zvýšena po injekci pristanu, zatímco melatonin mohl snížit produkci IL-6. Zvyšující se hladina IL-6 by mohla způsobit, že B buňky vylučují více protilátek a podporují rozvoj nefritidy . Takže downregulace produkce IL-6 melatoninem je užitečná při inhibici tvorby protilátek a renálních lézí.

IL-2 je vylučován Th1-buňkami a IL-13 je vylučován Th2-buňkami. V dokumentech o změnách IL-2 a IL-13 jsou některé protichůdné výsledky. V tomto modelu SLE indukovaném pristanem jsme zkoumali hladiny těchto dvou cytokinů. Naše výsledky ukázaly, že hladiny IL-2 v pristane-injekčně myší byla nižší než u normální myši, zatímco hladina IL-13 v pristane-injekčně myší byla vyšší než u normálních myší. Zjistili jsme také, že melatonin může snížit produkci IL-13, ale zvýšit produkci IL-2. Mnoho zpráv ukázalo, že hladina IL-2 se snížila v SLE, zejména v aktivní fázi, a že IL-2 může snížit regulaci aktivace B lymfocytů . Některé výzkumy ukázaly, že melatonin může regulovat hladinu IL-2/IL-2 receptorů, což může být mechanismus inhibičního účinku melatoninu na produkci IL-2. IL-13, jeden z nejdůležitějších cytokinů v lupusu, byl považován za aktivační faktor B-buněk, který vedl k nadměrné produkci mnoha autoprotilátek . IL-13 má vztah k renálním lézím SLE . Takže downregulace produkce IL-13 melatoninem je také užitečná při inhibici tvorby protilátek a renálních lézí.

klesající hladina cytokinu typu Th1 a zvyšující se hladiny cytokinu typu Th2 také naznačily, že u lupusu indukovaného pristine došlo k posunu od Th1 k Th2. Některé zprávy ukázaly, že exogenní melatonin může aktivovat T buňky a významně podporovat cytokiny typu Th1, které se podílejí na regulaci imunitních poruch . Naše výsledky ukázaly, že melatonin může upregulovat cytokiny typu Th1 a downregulovat cytokiny typu Th2. A to naznačovalo, že melatonin může modulovat narušení cytokinové sítě u myší SLE regulací nerovnováhy Th1 / Th2.

prednison, který je běžným lékem pro SLE, byl v této studii podáván jako pozitivní lék. Zjistili jsme, že prednison má regulační účinek na SLE indukovanou pristanem. Ve srovnání s prednisonem měl melatonin podobný nebo malý předchozí účinek na příznaky SLE. Jak je známo, nežádoucí účinky prednisonu jsou častější a závažnější než melatonin. Mysleli jsme si tedy, že melatonin může být potenciálním lékem pro SLE.

Na závěr, pristane-indukovaný lupus zobrazuje porucha imunitního systému, jako je vysoká hladina autoprotilátek a nerovnováha cytokinové sítě, která indukuje následoval zánět ledvin. Změny jsou podobné lidskému lupusu a pristane je běžný v životním prostředí; tento model je tedy vhodný ke studiu účinků melatoninu na SLE související s životním prostředím. Na druhé straně jsme také prokázali, že podávání melatoninu inhibovalo změny v lupusu indukovaném pristanem. A to naznačuje, že melatonin měl příznivý účinek na lupus související s životním prostředím. Mechanismy mohou zahrnovat jeho modulaci poruch v imunitním systému, zejména v síti cytokinů. Pro lepší pochopení regulačního procesu a klíčového faktoru pro jeho působení na autoimunitní onemocnění by však měly být nezbytné další studie.