Effet régulateur de la mélatonine sur les Perturbations des cytokines chez les Souris Lupiques induites par le Pristane

Résumé

Le lupus érythémateux disséminé (LED) se développe en relation avec de nombreux facteurs environnementaux. À notre avis, il est plus important d’étudier l’effet de la mélatonine sur le LED lié à l’environnement. Dans la présente étude, 0,5 ml de pristane ont été utilisés pour induire le LED chez des souris BALB/c femelles. La mélatonine (0,01, 0,1, 1,0 mg / kg) a été administrée par voie orale immédiatement après l’injection de pristane pendant 24 semaines. Des anticorps IgM anti-adNSS et histones ont été détectés après 0, 1, 2, 4, 8 semaines d’injection de pristane. Les niveaux d’IL-2, d’IL-6 et d’IL-13 ont été détectés après 24 semaines. Des lésions rénales ont également été observées. Les résultats ont montré que la mélatonine antagonisait les niveaux croissants d’anticorps anti-adNSS et d’histones IgM. La mélatonine pourrait également diminuer la production d’IL-6 et d’IL-13 et augmenter la production d’IL-2. De plus, la mélatonine pourrait diminuer les lésions rénales causées par le pristane. Ces résultats suggèrent que la mélatonine a un effet bénéfique sur le lupus induit par le pristane en régulant les perturbations des cytokines.

1. Introduction

Le lupus érythémateux disséminé (LED ou lupus) est une maladie auto-immune qui peut attaquer les tissus et les cellules normaux du corps, entraînant une inflammation et des lésions tissulaires. Le LED survient à tout âge et dans n’importe quel sexe. Cependant, les femmes sont plus susceptibles d’avoir un LED que les hommes. En outre, une perturbation du réseau de cytokines a également été rapportée dans le SLE, y compris l’IL-1, l’IL-2, l’IL-6, l’IL-13 et l’IFN-. Ces cytokines ont des relations étroites avec le développement du LED, telles que la production d’auto-anticorps et la néphrite du complexe immunitaire. Mais il existe des résultats contradictoires sur les changements de certaines cytokines dans différents rapports.

Au cours des dernières années, une attention de plus en plus grande a été accordée aux facteurs environnementaux pouvant être impliqués dans la pathogenèse du LED. Les maladies auto-immunes sont de plus en plus courantes dans les pays industrialisés et ces maladies peuvent être influencées par des facteurs environnementaux. Pristane est un candidat probable en tant que déclencheur environnemental du LED dans la population sensible. Des expériences sur des animaux ont montré que le pristane pouvait induire des symptômes de maladie auto-immune de type lupus chez une souche de souris (BALB / c), tels que des niveaux élevés d’auto-anticorps et de glomérulonéphrite du complexe immunitaire. Certaines études épidémiologiques ont également prouvé que toutes les personnes atteintes de pristane dans leur sang présentaient des maladies auto-immunes distinctes ou des symptômes de maladie auto-immune. En outre, le pristane présent dans l’huile minérale, l’huile de requin et de nombreux aliments semble être une exposition environnementale possible pouvant déclencher le LED. Il pourrait donc être plus approprié de rechercher les facteurs environnementaux impliqués dans le LED en utilisant un modèle murin de type LED induit par le pristane.

La mélatonine est synthétisée et sécrétée principalement par la glande pinéale qui peut produire des récepteurs spécifiques dans et hors du système nerveux central. La mélatonine peut non seulement affecter directement l’inflammation et les cellules immunitaires, mais elle a également des influences indirectes par le biais du thalamencéphale. Plus important encore, la mélatonine est considérée comme une substance active importante dans le système neuro-immunitaire-endocrinien. Il est capable de réguler le déséquilibre du réseau de cytokines dans certaines maladies auto-immunes telles que la polyarthrite rhumatoïde et l’arthrite adjuvante. Certaines expériences ont étudié ses effets sur les souris LMR-lpr / lpr et ont montré que la mélatonine était bénéfique pour le LED spontané chez les souris femelles. Étant donné que l’environnement est un facteur important du LED dans la société moderne, nous nous sommes davantage intéressés aux effets de la mélatonine sur le LED lié à l’environnement.

Pour étudier le rôle de la mélatonine dans le LED, en particulier dans le lupus lié à l’environnement, des souris induites par le pristane ont été utilisées. Les effets de la mélatonine sur les perturbations des cytokines et les changements suivants dans le modèle de LED induit par le pristane ont également été déterminés.

2. Matériaux et méthodes

2.1. Animaux

Soixante souris femelles BALB/c âgées de deux mois (g) ont été fournies par le Centre des animaux expérimentaux de l’Université médicale d’Anhui. Tous les protocoles expérimentaux décrits dans cette étude ont été approuvés par le Comité d’évaluation Éthique de l’expérimentation Animale de l’Institut de Pharmacologie Clinique de l’Université Médicale d’Anhui.

2.2. Matériaux

La mélatonine a été achetée chez Sigma. Le pristane, l’ADN du thymus de veau dénaturé à la chaleur (adNSS), l’histone totale du thymus de veau (histone), la concanavaline A (ConA) et les lipopolysaccharides (LPS) proviennent également de Sigma. Des anticorps IgM conjugués au lapin et à la souris anti-biotine et de l’avidine marquée à la peroxydase de raifort ont été achetés chez. Les kits ELISA interleukine-2 de souris et les kits ELISA interleukine-6 ont été achetés auprès d’ADL. Des kits ELISA interleukine-13 de souris ont été achetés auprès de BIOO.

2.3. Protocoles expérimentaux

Soixante souris femelles BALB / c ont été divisées au hasard en six groupes: groupe témoin normal, groupe modèle, groupe de traitement à la prednisone qui a servi de groupe témoin positif et groupes de traitement à la mélatonine (0,01, 0,1, 1,0 mg / kg), y compris le groupe de mélatonine un (MT1), le groupe de mélatonine deux (MT2) et le groupe de mélatonine trois (MT3). Les souris du groupe témoin normal ont reçu une injection intrapéritonéale de 0.5 ml de solution saline normale (NS) et les autres groupes ont reçu une injection intrapéritonéale de 0,5 ml de pristane. Les souris du groupe témoin normal et du groupe témoin modèle ont reçu une administration intragastrique de NS par jour après le premier traitement. Les souris du groupe témoin positif ont reçu une administration intragastrique de 5 mg / kg de prednisone (Pre) par jour. Les souris du groupe MT1 ont été traitées par voie intragastrique avec 0,01 mg / kg de mélatonine, MT2 0,1 mg / kg de mélatonine et MT3 1,0 mg / kg de mélatonine. Des sérums ont été prélevés dans la veine de la queue avant le traitement (0) et 2, 4 et 8 semaines après le traitement pour mesurer le taux d’auto-anticorps. Vingt-quatre semaines après l’administration de pristane, toutes les souris ont été tuées et les spléens ont été retirés pour des détections immunologiques; pendant ce temps, les tissus néphriques ont été examinés par microscopie optique.

2.4. Des tests Immunosorbants enzymatiques (ELISA) pour les Anticorps Anti-ADNSS et Histones

Les anticorps anti-adNSS et histones IgM ont été détectés par une technique ELISA similaire à celle décrite dans. des plaques ELISA à 96 puits recouvertes d’antigènes d’adNSS ou d’histones à 10 mg/L ont été incubées pendant une nuit à 4. Le lendemain, les assiettes ont été lavées avec du PBS-Tween. Les plaques ont été incubées avec du tampon bloquant (PBS-2% d’albumine sérique bovine) pendant une nuit à 4 et lavées avec du Tween PBS. Après une nuit d’incubation à 4 avec du sérum murin dilué à 1:250, les plaques ont été lavées à nouveau puis incubées pendant 2 heures à 4 avec des anticorps IgM antimouse de lapin conjugués à la biotine dilués à 1:200. Ensuite, les plaques ont été lavées et incubées pendant 2 heures à 4 avec de l’avidine marquée au raifort peroxydase en dilution 1:200. Les plaques ont ensuite été lavées à nouveau et 100 L de substrat—tétraméthylbenzidine (TMB) et de solution de peroxyde d’hydrogène ont été ajoutés aux puits pendant 30 minutes à 37. La réaction est terminée par addition de 50 L de 2 M H2SO4 par puits. L’intensité de la couleur jaune a été lue à 490 nm dans un lecteur de microplaques. Les sérums de huit autres souris BALB/ c normales ont été collectés et détectés en même temps, et la densité moyenne et l’écart-type ont été calculés pour servir de témoin. Les indices moyens enzymatiques (EI) des échantillons des différents groupes ont été calculés comme suit :

2,5. La culture de cellules spléniques et l’induction de cytokines

La culture de cellules spléniques et l’induction de cytokines sont des modifications des méthodes décrites dans. Brièvement, des suspensions unicellulaires ont été préparées à partir de spléens prélevés aseptiquement sur des souris et cultivées dans des plaques de culture à 24 puits à une concentration finale de cellules / ml. Les cellules ont été cultivées dans du RPMI-1640 additionné de 10% de sérum de veau fœtal, de 2 mM de glutamine, de 1 mm de pyruvate de sodium, de 50 M de 2-mercaptoéthanol et de 10 ml de pénicilline, de streptomycine et de solution antimycotique / L (Sigma). Les cultures ont été stimulées avec 3 mg /L de ConA, 12 mg /L de LPS ou du milieu seul et incubées à 37 dans de l’air humidifié avec 5% de CO2. Le surnageant a été récolté à 48 h et conservé à 20 pour des dosages de cytokines.

2.6. Essais de cytokines

Les concentrations d’interleukine-2 (IL-2), d’interleukine-6 (IL-6) et d’interleukine-13 (IL-13) dans le surnageant ont été déterminées à l’aide d’ELISA commerciaux appropriés pour la forme murine de ces cytokines. L’intensité de chaque échantillon a été lue à 450 nm dans un spectrophotomètre à microplaques.

2.7. Techniques histopathologiques

Les reins prélevés en sacrifiant des souris ont été fixés pendant 24 heures dans du formol tamponné neutre avant l’incorporation de paraffine. Des coupes ont été colorées à l’hématoxyline et à l’Éosine et à la méthénamine de Jones Silver, puis examinées au microscope optique pour déterminer la gravité de la lésion rénale. Une glomérulonéphrite, des lésions tubulaires rénales et une inflammation interstitielle ont été observées, et le degré de gravité des lésions histologiques caractéristiques de la néphrite lupique a été évalué comme absent (), léger (), modéré () et sévère ().

2.8. Les résultats de l’analyse statistique

ont été exprimés en SD. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide du test t bidirectionnel de Student avec comme niveau minimal de signification

3. Résultats

3.1. Effets de la mélatonine sur les taux d’Anticorps IgM Anti-adNSS et Histones dans les Sérums

Les taux d’anticorps IgM anti-adNSS et histones étaient significativement différents entre les groupes de traitement par injection de pristane et de mélatonine (, Figures 1(a) et 1(b)).

(a)

(d)

(a)
(b)

Figure 1

Les sérums de souris de chaque groupe ont été collectés avant le traitement (0), 2, 4 et 8 semaines plus tard, et des taux d’anticorps anti-ssDNA et antihistoniques IgM ont été détectés par ELISA. L’EI a été calculé selon la formule. (a) le niveau d’anticorps anti-adNSS IgM dans chaque groupe, (b) le niveau d’anticorps antihistone IgM dans chaque groupe. Les données ont été données en moyenne ± écart-type (n = 6-8). P* <.05, P** <.01 par rapport aux sérums à 0 semaine, ∆P <.05,∆∆P <.01 versus sérums chez des souris témoins modèles.

Deux semaines après une seule injection intrapéritonéale de pristane, le taux d’anticorps IgM anti-adNSS dans les sérums a commencé à augmenter de manière évidente, a atteint son pic à 4 semaines, puis a commencé à diminuer et est finalement revenu à la normale à 8 semaines. Dans le groupe MT1, le taux d’anticorps IgM anti-adNSS dans les sérums a également augmenté et atteint son pic à 4 semaines, mais a ensuite diminué de manière plus évidente par rapport au groupe témoin modèle (). Dans le groupe MT2, le taux d’anticorps IgM anti-adNSS dans les sérums a augmenté au cours des quatre premières semaines, mais beaucoup plus bas que celui du groupe modèle (), et est resté normal dans les autres périodes. Dans le groupe MT3, le taux d’anticorps IgM anti-adNSS n’a pas augmenté (Figure 1(a)).

Les anticorps antihistoniques dans les sérums ont augmenté de 1 semaine après l’injection, ont atteint un pic à 4 semaines, puis ont diminué progressivement et sont revenus à la normale à 8 semaines. Dans le groupe MT1, les taux d’anticorps antihistoniques dans les sérums étaient significativement inférieurs à ceux du groupe témoin modèle () et revenaient à la normale à 4 semaines. Dans les groupes MT2 et MT3, les taux d’anticorps ont augmenté au cours des quatre premières semaines, mais beaucoup plus bas que le groupe modèle (), et sont restés normaux dans les autres périodes (Figure 1 (b)).

3.2. Effets de la mélatonine sur la production de cytokines

Pour mieux comprendre l’influence de la mélatonine sur les cytokines du LED, la production de cytokines de type Th1 et de type Th2 par des splénocytes stimulés par ConA ou LPS a été mesurée au cours du lupus murin. Les résultats ont montré que la production d’IL-2, d’IL-6 et d’IL-13 changeait chez les souris SLE induites par le pristane (Figure 2). La production d’IL-2 de splénocytes de souris du groupe témoin modèle était inférieure à celle de souris normales (), tandis que la production d’IL-6 et d’IL-13 de splénocytes de souris du groupe témoin modèle était supérieure à celle de souris normales (). Dans les groupes MT2 et MT3, les niveaux d’IL-2 étaient jusqu’au niveau normal et plus élevés que ceux des souris modèles évidemment (), tandis que les niveaux d’IL-6 et d’IL-13 étaient inférieurs à ceux des souris modèles évidemment (,) (Figure 2).

(a)

(d)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figure 2

Toutes les souris ont été sacrifiées au bout de 24 semaines et les lymphocytes spléniques ont été ensemencés à 1×106 cellules/ puits. Les concentrations d’IL-2 dans les lymphocytes spléniques ont été stimulées pendant 48 h avec 3 mg/L de ConA. Les concentrations d’IL-6 et d’IL-13 dans les lymphocytes spléniques ont été stimulées pendant 48 h avec 12 mg/L de LPS. Les concentrations d’IL-2, d’IL-6 et d’IL-13 dans les surnageants de culture ont été détectées par ELISA. Les données ont été données en moyenne ± écart-type (n = 4-5). P** <.01, P* <.05 par rapport au groupe témoin normal, ∆P <.05, ∆∆P <.01 par rapport au groupe témoin du modèle.

3.3. Effets de la mélatonine sur les modifications histopathologiques rénales

Les modifications histopathologiques rénales des souris sont présentées dans le tableau 1 et la figure 3.

(a)

(d)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 3

Les reins prélevés au moment du sacrifice ont été colorés avec H & E pour un examen histologique. a) Groupe témoin normal (HE×200). b) Groupe témoin modèle (HE×200). c) Groupe témoin modèle (HE×400). d) Groupe MT (HE×200).

Comme le montre la figure 3(a), aucune anomalie rénale n’a été observée chez des souris normales. Le volume et le nombre de cellules des glomérules étaient normaux. La paroi capillaire glomérulaire était mince. Aucune fonte protéique n’a été observée dans le tubule. L’infiltration des lymphocytes et la prolifération des fibroblastes n’ont pas été observées dans l’interstitiel rénal.

Comme le montrent les figures 3(b) et 3(c) et le tableau 1, la plupart des souris injectées au pristane ont révélé des anomalies rénales allant de modèles légers à sévères. Certains glomérules ont montré une atrophie glomérulaire avec dilatation des capillaires et épaississement des parois capillaires. Certaines cites ont révélé la formation de thrombus. L’élargissement mésangial et l’augmentation des couches cellulaires ont également été observés. La paroi de la capsule glomérulaire était épaisse et l’espace entre la paroi de la capsule et les cellules endothéliales a disparu dans le glomérule gravement affecté. Certains tubules rénaux ont montré une dilatation et une prolifération des cellules épithéliales. Des moulages de protéines ont été observés dans les tubules. Une infiltration de cellules inflammatoires telles que les monocytes, les lymphocytes et les plasmacytes avec agrégation focale a été observée dans l’interstitiel rénal. Des proliférations de fibroblastes interstitiels ont également été observées.

Il y a eu quelques améliorations de différents degrés chez les souris traitées à la mélatonine (Figure 3(d) et tableau 1). L’atrophie glomérulaire et l’épaississement des parois capillaires ont été modifiés à un degré léger ou modéré. L’élargissement mésangial a également été amélioré. L’espace entre la paroi de la capsule et les cellules endothéliales était plus petit que celui des souris normales, mais il y avait une amélioration par rapport au groupe modèle non traité. Une légère infiltration de lymphocytes a également été observée. Certains tubules rénaux ont montré une légère dilatation et quelques coulées de protéines. Néanmoins, tous les changements étaient moins sévères que chez les souris modèles.

4. Discussion

Dans cette étude, les perturbations immunitaires des souris primées au pristane et les effets de la mélatonine ont été observés. Étant donné que les anticorps anti-ADN et histones étaient sensibles dans le LED, nous avons étudié les modifications des anticorps anti-ssDNA et antihistoniques IgM et avons trouvé des niveaux élevés d’auto-anticorps chez les souris injectées au pristane. Des lésions rénales ont également été trouvées chez les souris. Ces résultats concordaient avec les rapports précédents. Nous avons également constaté que la mélatonine antagonisait les niveaux croissants d’auto-anticorps IgM anti-adNSS et histones, et que la mélatonine pouvait réduire les lésions rénales causées par le pristane. Le pristane est un irritant péritonéal. Il est bien connu que la classe des IgM est produite par le sous-ensemble de lymphocytes B B1 (CD5 +), et que le sous-ensemble B1 est fortement enrichi dans la cavité péritonéale et est expansé chez les souris BALB / c, ce qui soulève la possibilité que les anticorps anti-adNSS et antihistones IgM induits par le pristane i.p. sont dérivés du sous-ensemble. Des études antérieures ont rapporté que la mélatonine avait des effets sur la première réponse immunitaire en anticorps (IgM, IgG). Certaines études ont indiqué que la mélatonine avait une modulation bidirectionnelle sur les lymphocytes. Nous avons donc pensé que la mélatonine pourrait améliorer les symptômes du LED en modulant la surproduction de cellules B.

Le réseau de cytokines joue un rôle important dans le développement du LED. Dans certaines expériences in vitro, la mélatonine pourrait inhiber les effets immunitaires de certaines cytokines et lymphocytes T. Nous avons donc observé les effets de la mélatonine sur la perturbation du réseau de cytokines. L’IL-6 est considérée comme une cytokine inflammatoire sécrétée par une variété de cellules tissulaires, y compris les macrophages et les cellules Th2. Le niveau d’IL-6 a une corrélation positive avec l’indice d’activité du LED. Nos résultats ont montré que le taux d’IL-6 était augmenté après l’injection de pristane, tandis que la mélatonine pouvait diminuer la production d’IL-6. L’augmentation du taux d’IL-6 pourrait amener les lymphocytes B à sécréter plus d’anticorps et favoriser le développement de la néphrite. Ainsi, la régulation négative de la production d’IL-6 par la mélatonine est utile pour inhiber la production d’anticorps et les lésions rénales.

L’IL-2 est sécrétée par les cellules Th1 et l’IL-13 est sécrétée par les cellules Th2. Il y a des résultats contradictoires dans les documents sur les changements de l’IL-2 et de l’IL-13. Donc, dans ce modèle de LED induite par le pristane, nous avons étudié les niveaux des deux cytokines. Nos résultats ont révélé que le taux d’IL-2 chez les souris injectées au pristane était inférieur à celui des souris normales, tandis que le taux d’IL-13 chez les souris injectées au pristane était supérieur à celui des souris normales. Nous avons également constaté que la mélatonine pouvait diminuer la production d’IL-13 mais augmenter la production d’IL-2. De nombreux rapports ont montré que le taux d’IL-2 diminuait dans le LED, en particulier au stade actif, et que l’IL-2 pouvait réguler à la baisse l’activation des lymphocytes B. Certaines recherches ont montré que la mélatonine pouvait réguler le niveau des récepteurs IL-2 / IL-2, qui pourrait être le mécanisme de l’action inhibitrice de la mélatonine sur la production d’IL-2. L’IL-13, l’une des cytokines les plus importantes du lupus, était considérée comme un facteur d’activation des cellules B qui entraînait la production excessive de nombreux auto-anticorps. L’IL-13 a une relation avec les lésions rénales du LED. Ainsi, la régulation négative de la production d’IL-13 par la mélatonine est également utile pour inhiber la production d’anticorps et les lésions rénales.

La diminution du taux de cytokine de type Th1 et l’augmentation du taux de cytokine de type Th2 indiquent également qu’il y a eu un déplacement de Th1 vers Th2 dans le lupus induite par la vierge. Certains rapports ont montré que la mélatonine exogène pouvait activer les cellules T et favoriser de manière significative les cytokines de type Th1, qui participent à la régulation des perturbations immunitaires. Nos résultats ont montré que la mélatonine pouvait réguler à la hausse les cytokines de type Th1 et à la baisse les cytokines de type Th2. Et cela a indiqué que la mélatonine pourrait moduler la perturbation du réseau de cytokines chez les souris SLE en régulant le déséquilibre Th1 / Th2.

La prednisone, qui est un médicament courant pour le LED, a été utilisée comme médicament positif dans cette étude. Nous avons constaté que la prednisone avait un effet régulateur sur le LED induit par le pristane. Par rapport à la prednisone, la mélatonine a eu un effet similaire ou un peu antérieur sur les symptômes du LED. Comme nous le savons, les effets indésirables de la prednisone sont plus fréquents et plus graves que la mélatonine. Ainsi, nous avons pensé que la mélatonine pourrait être un médicament potentiel pour le LED.

En conclusion, le lupus induit par le pristane présente des perturbations du système immunitaire, telles qu’un niveau élevé d’auto-anticorps et un déséquilibre du réseau de cytokines, ce qui induit la néphrite suivie. Les changements sont similaires au lupus humain, et le pristane est commun dans l’environnement; ce modèle est donc approprié pour étudier les effets de la mélatonine sur le LED lié à l’environnement. D’autre part, nous avons également démontré que l’administration de mélatonine inhibait les modifications du lupus induit par le pristane. Et cela a suggéré que la mélatonine avait un effet bénéfique sur le lupus lié à l’environnement. Les mécanismes pourraient impliquer sa modulation des perturbations du système immunitaire, en particulier dans le réseau des cytokines. Cependant, d’autres études devraient être nécessaires pour une meilleure compréhension du processus de régulation et du facteur clé de son action sur les maladies auto-immunes.