a Melatonin szabályozó hatása a citokin zavarokra a Pristane által kiváltott Lupus egerekben

absztrakt

a szisztémás lupus erythematosus (SLE) számos környezeti tényezővel összefüggésben alakul ki. Véleményünk szerint fontosabb megvizsgálni a melatonin hatását a környezettel kapcsolatos SLE-re. Ebben a vizsgálatban 0,5 ml pristane-t alkalmaztak az SLE indukálására nőstény balb/c egerekben. A melatonint (0,01, 0,1, 1,0 mg/ttkg) közvetlenül a pristane injekció után, 24 héten keresztül orálisan adták be. IgM anti ssdns és hiszton antitesteket mutattak ki 0, 1, 2, 4, 8 hetes pristane injekció után. Az IL-2, IL-6 és IL-13 szinteket 24 hét után mutatták ki. Vese elváltozásokat is megfigyeltek. Az eredmények azt mutatták, hogy a melatonin antagonizálta az IgM anti ssdns és a hiszton autoantitestek növekvő szintjét. A Melatonin csökkentheti az IL – 6 és IL-13 termelést, és növelheti az IL-2 termelést. Emellett a melatonin csökkentheti a pristane által okozott vese elváltozásokat. Ezek az eredmények arra utaltak, hogy a melatonin jótékony hatással van a pristane által kiváltott lupusra a citokinek zavarainak szabályozása révén.

1. Bevezetés

a szisztémás lupus erythematosus (SLE vagy Lupus) egy autoimmun betegség, amely megtámadhatja a szervezet normális szöveteit és sejtjeit, gyulladást és szövetkárosodást okozva . Az SLE bármely életkorban és nemben fordul elő. A nők azonban nagyobb valószínűséggel rendelkeznek SLE-vel, mint a férfiak . Emellett a citokinhálózat zavaráról is beszámoltak az SLE-ben , beleértve az IL-1, IL-2, IL-6, IL-13 és IFN-t. Ezek a citokinek szoros kapcsolatban állnak az SLE kialakulásával, mint például az autoantitestek termelése és az immun-komplex nephritis. De vannak ellentmondásos eredmények egyes citokinek változásairól a különböző jelentésekben.

az utóbbi években egyre nagyobb figyelmet fordítottak azokra a környezeti tényezőkre, amelyek szerepet játszhatnak az SLE patogenezisében . Az autoimmun betegségek egyre gyakoribbak az iparosodott országokban, és ezeket a betegségeket környezeti tényezők befolyásolhatják . A Pristane valószínűleg az SLE környezeti kiváltó tényezője a fogékony populációban. Állatkísérletek azt mutatták, hogy a pristane lupus-szerű autoimmun betegség tüneteit indukálhatja egy egér törzsben (BALB/c), mint például az autoantitestek magas szintje és az immunkomplex glomerulonephritis . Néhány epidemiológiai vizsgálat azt is bizonyította, hogy a pristane-val rendelkező személyek vérében különálló autoimmun betegségek vagy autoimmun betegség tünetei voltak . Ezenkívül az ásványi olajban, a cápaolajban és számos élelmiszerben található pristane lehetséges környezeti expozíciónak tűnik, amely kiválthatja az SLE-t. Tehát megfelelőbb lehet az SLE-ben részt vevő környezeti tényezők kutatása pristane-indukált SLE-szerű egér modell alkalmazásával.

a melatonint elsősorban a tobozmirigy szintetizálja és szekretálja, amely specifikus receptorokat hozhat létre a központi idegrendszerben és azon kívül. A Melatonin nemcsak közvetlenül befolyásolhatja a gyulladást és az immunsejteket, hanem közvetett hatással van rá a thalamencephalonon keresztül . Ennél is fontosabb, hogy a melatonint fontos hatóanyagnak tekintik a neuro-immun-endokrin rendszerben . Képes szabályozni a citokin hálózat egyensúlyhiányát néhány autoimmun betegségben, például a rheumatoid arthritisben és az adjuváns ízületi gyulladásban . Néhány kísérlet az MRL-lpr/LPR egerekre gyakorolt hatását vizsgálta, és kimutatta, hogy a melatonin jótékony hatással van a spontán SLE-re nőstény egerekben . Mivel a környezet fontos tényező az SLE-ben a modern társadalomban, jobban érdekelt minket a melatonin hatása a környezettel kapcsolatos SLE-re.

a melatonin SLE-ben betöltött szerepének vizsgálatához, különösen a környezettel kapcsolatos lupusban, pristane-indukált egereket használtunk. Meghatározták a melatonin citokin zavarokra gyakorolt hatását, valamint a pristane-indukálta SLE Modell következő változásait is.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Állatok

hatvan két hónapos ( g) nőstény balb/c egeret szállítottak az Anhui Orvostudományi Egyetem kísérleti Állatközpontja. Az ebben a tanulmányban leírt összes kísérleti protokollt az Anhui Orvostudományi Egyetem Klinikai Farmakológiai Intézetének állatkísérletekkel foglalkozó etikai felülvizsgálati Bizottsága hagyta jóvá.

2.2. Anyagok

a melatonint a Sigma-tól vásárolták. A pristane, a hő-denaturált borjú thymus DNS (ssdns), a teljes borjú thymus hiszton (hiszton), a concanavalin A (ConA) és a lipopoliszacharidok (LPS) szintén a Sigma-ból származnak. Biotin-konjugált nyúl-anti-egér IgM antitesteket és torma-peroxidáz-jelölt avidint vásároltak . Az egér interleukin-2 ELISA készleteket és az interleukin-6 ELISA készleteket az ADL-től vásárolták. Az egér interleukin-13 ELISA készleteket a BIOO-tól vásárolták.

2.3. Kísérleti protokollok

hatvan nőstény balb / c egeret véletlenszerűen hat csoportra osztottunk: normál kontrollcsoport, modellcsoport, prednizon-kezelési csoport, amely pozitív kontrollcsoportként szolgált, és melatonin (0,01, 0,1, 1,0 mg/kg) kezelési csoportok, beleértve az első melatonin csoportot (MT1), a második melatonin csoportot (MT2) és a harmadik melatonin csoportot (MT3). A normál kontrollcsoport egerei intraperitoneális injekciót kaptak 0.5 ml normál sóoldatot (NS), a többi csoport pedig 0,5 ml pristane intraperitoneális injekciót kapott. A normál kontrollcsoport és a modell kontrollcsoport egerei az első kezelés után napi NS intragasztrikus adagolást kaptak. A pozitív kontrollcsoportba tartozó egereknek napi 5 mg/kg prednizon (Pre) intragasztrikus adagolást adtak. Az MT1 csoportban lévő egereket intragasztrikusan 0,01 mg/kg melatoninnal, MT2 0,1 mg/kg melatoninnal és MT3 1,0 mg/kg melatoninnal kezelték. A szérumokat a farokvénából a kezelés előtt (0) és a kezelés után 2, 4 és 8 héttel gyűjtötték össze az autoantitestek szintjének mérésére. Huszonnégy héttel a pristane beadása után minden egeret megöltek, és a lépeket eltávolították immunológiai detektálás céljából; eközben a nephrikus szöveteket fénymikroszkóppal vizsgálták.

2.4. Enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálatokat (Elisa) végeztek Anti-ssdns és hiszton antitestek kimutatására

Anti-ssdns és hiszton IgM antitesteket az alábbiakban leírtakhoz hasonló Elisa technikával . 96-kút ELISA lemezeket 10 mg/L ssdns-sel vagy hiszton antigénekkel bevonva egy éjszakán át inkubáltuk 4-nél. A következő napon a lemezeket PBS-Tween-vel mostuk. A lemezeket blokkoló pufferrel (PBS-2% bovine szérum albumin) inkubáltuk egy éjszakán át 4-kor, majd PBS-Tween-nel mossuk. Miután egy éjszakán át 4-en inkubáltuk 1 : 250-re hígított egérszérummal, a lemezeket ismét megmossuk, majd 2 órán át 4-en inkubáltuk 1 : 200-ra hígított biotin-konjugált nyúl antimouse IgM antitestekkel. Ezt követően a lemezeket 2 órán át 4 órán át torma peroxidázzal jelölt avidinnel 1 : 200 hígításban inkubáltuk. A lemezeket ezután ismét megmossuk, és 100 Liter szubsztrát-tetrametil-benzidin (TMB) és hidrogén-peroxid oldatot adunk a kutakhoz 30 percig 37-en. A reakciót 50 Liter 2 M H2SO4 hozzáadásával fejeztük be. A sárga szín intenzitását 490 nm-en olvastuk egy mikrolemez-olvasóban. A többi nyolc normál BALB/c egér szérumát egyidejűleg gyűjtöttük össze és detektáltuk, és kiszámítottuk az átlagos sűrűséget és az SD-t, hogy kontrollként szolgáljon. A különböző csoportokban lévő minták átlagos enzimindexeit (ei) a következőképpen számítottuk ki:

2,5. Lép sejttenyészet és citokin indukció

Lépsejttenyészet és citokinek indukciója az alábbiakban leírt módszerek módosításai voltak . Röviden, egysejtű szuszpenziókat állítottunk elő az egerekből aszeptikusan eltávolított lépekből, és 24 lyukú tenyésztési lemezeken tenyésztettük sejt/ml végső koncentrációban. A sejteket rpmi-1640-ben tenyésztettük, kiegészítve 10% magzati borjú szérummal, 2 mM glutaminnal, 1 mM nátrium-piruváttal, 50 M 2-merkaptoetanollal és 10 ml penicillinnel, sztreptomicinnel és antimikotikus oldattal/L-vel (Sigma). A tenyészeteket 3 mg/L ConA-val, 12 mg/L LPS-vel vagy önmagában közepes táptalajjal stimuláltuk, és 37-en inkubáltuk párásított levegőben 5% CO2-vel. A felülúszót 48 órán át szüreteltük, majd 20-kor tartósítottuk citokin-vizsgálatokhoz.

2.6. Citokin vizsgálatok

az interleukin-2 (IL-2), az interleukin-6 (IL-6) és az interleukin-13 (IL-13) koncentrációját a felülúszóban a citokinek egérformájához megfelelő kereskedelmi Elisa-k alkalmazásával határoztuk meg. Az egyes minták intenzitását 450 nm-en olvastuk mikrolemez spektrofotométerben.

2.7. Hisztopatológiai technikák

az egerek feláldozása során összegyűjtött veséket 24 órán át semleges pufferolt formalinban rögzítettük a paraffin beágyazása előtt. A szakaszokat hematoxilinnel, eozinnal és Jones silver methenaminnal festettük, majd fénymikroszkóppal megvizsgáltuk a vese elváltozásának súlyosságát. Glomerulonephritist, renális tubuláris elváltozásokat és interstitialis gyulladást figyeltek meg, és a lupus nephritisre jellemző szövettani elváltozások súlyosságának mértékét úgy értékelték, hogy hiányzik (), enyhe (), közepes () és súlyos ().

2.8. Statisztikai elemzés

az eredményeket SD-ben fejeztük ki. A statisztikai elemzést a hallgató kétirányú t-tesztjével végeztük, a szignifikancia minimális szintje

3. Eredmények

3.1. A Melatonin hatása az IgM Anti-ssdns és hiszton antitestek szintjére a szérumokban

az IgM anti-ssdns és hiszton antitestek szintje szignifikánsan különbözött a pristane injekcióval kezelt és a melatoninnal kezelt csoportok között(1.A) és 1. b) ábra).

(a)

(b)

a)
b)

ábra 1

mindegyik csoportban az egerek szérumát a kezelés előtt (0), 2, 4 és 8 héttel később gyűjtöttük össze, és az IgM anti-ssdns és Antihiszton antitestek szintjét ELISA-val detektáltuk. Az EI-t a képlet szerint számítottuk ki. (a) az IgM anti-ssdns antitest szintje az egyes csoportokban, (b) az IgM Antihiszton antitest szintje az egyes csoportokban. Az adatokat átlagban (n=6-8) adták meg. P * <.05, P * * <.01 a szérummal szemben 0 hétnél, 6398>o.05, 6.o<.01 versus Szérumok modell kontroll egerekben.

két héttel a pristane egyetlen intraperitoneális injekciója után az anti-ssdns IgM antitestek szintje a szérumokban nyilvánvalóan növekedni kezdett, elérte a csúcsot 4 hétnél, majd csökkenni kezdett, végül 8 hétnél normalizálódott. Az MT1 csoportban az anti-ssdns IgM antitestek szintje a szérumokban szintén emelkedett, és elérte a csúcsot 4 wk-nál, de aztán nyilvánvalóbban csökkent a modell kontrollcsoporthoz képest (). Az MT2 csoportban az anti-ssdns IgM antitestek szintje a szérumokban az első négy hétben emelkedett, de jóval alacsonyabb, mint a modellcsoporté (), és más időszakokban normális maradt. Az MT3 csoportban az anti-ssdns IgM antitestek szintje nem emelkedett(1 (A) ábra).

az Antihiszton antitestek a szérumokban az injekció beadása után 1 wk-ra emelkedtek, a csúcsot 4 wk-nál érték el, majd fokozatosan csökkentek, és 8 wk-nál visszatértek a normális szintre. Az MT1 csoportban az Antihiszton antitestek szintje a szérumokban szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a modell kontrollcsoporté (), és 4 hétkor visszatért a normális szintre. Az MT2 és MT3 csoportokban az antitestek szintje emelkedett az első négy hétben, de jóval alacsonyabb volt, mint a modellcsoportban (), és a többi időszakban normális maradt (1.b) ábra).

3.2. A Melatonin hatása a citokinek termelésére

a melatonin citokinekre gyakorolt hatásának jobb megismerése érdekében az SLE-ben a Th1-típusú és Th2-típusú citokinek termelését ConA-val vagy LPS-vel stimulált splenocyták vizsgálták az egér lupus során. Az eredmények azt mutatták, hogy az IL-2, IL-6 és IL-13 termelése megváltozott a pristane által indukált SLE egerekben (2.ábra). A modell kontrollcsoportban lévő egerekből származó IL-2 splenocyták termelése alacsonyabb volt, mint a normál egereké (), míg a modell kontrollcsoportban lévő egerekből származó IL-6 és IL-13 splenocyták termelése magasabb volt, mint a normál egereké (). Az MT2 és MT3 csoportokban az IL-2 szintek a normál szintig emelkedtek és magasabbak voltak, mint a modell egereknél (), míg az IL-6 és IL-13 szintek alacsonyabbak voltak, mint a modell egereknél (,) (2.ábra).

(a)

(b)

(c)

a)
b)
c)

ábra 2

minden egeret feláldoztunk a 24. hét végén, és a lép limfocitákat 1 db 106 sejt/kútnál vetettük be. Az IL-2 koncentrációját a lép lymphocytákban 48 órán keresztül stimulálták 3 mg/L ConA-val. Az IL-6 és az IL-13 koncentrációkat a lép lymphocytákban 48 órán keresztül stimulálták 12 mg/L LPS-sel. Az IL-2, IL-6 és IL-13 koncentrációkat a tenyészet felülúszóiban ELISA-val detektálták. Az adatokat átlagban adtuk meg 6 SD (n=4-5). P * * <.01, P * <.05 a normál kontrollcsoporthoz képest, 6 P<.05, 6.o<.01 kontra modell kontroll csoport.

3.3. A Melatonin hatása a vese kórszövettani elváltozásaira

az egerek vese kórszövettani elváltozásait az 1.táblázat és a 3. ábra mutatja.

(a)

(b)

(c)

(d)

a)
b)
c)
d)

ábra 3

az áldozat idején összegyűjtött veséket h&E-vel festettük szövettani vizsgálat céljából. (a) normál kontroll csoport (HE 600). (B) modell kontroll csoport (he 600). (c) modell kontroll csoport (he 600). d) MT csoport (HE 200).

amint azt a 3. A) ábra mutatja, normál egerekben nem észleltek veseműködési rendellenességeket. A glomerulusok térfogata és sejtszáma normális volt. A glomeruláris kapilláris fal vékony volt. A tubulusban nem volt fehérje öntvény. Lymphocyták infiltrációját és fibroblasztok proliferációját nem figyelték meg a renalis interstitialis-ban.

amint azt a 3.b) és 3. c) ábra, valamint az 1. táblázat mutatja, a legtöbb pristane-injekcióval beadott egér veseműködési rendellenességet mutatott az enyhétől a súlyosig. Néhány glomerulus glomeruláris atrófiát mutatott a kapillárisok dilatációjával és a kapilláris falak megvastagodásával. Néhány cites feltárta a trombusképződést. Mesangialis kiszélesedést és sejtrétegek növekedését is megfigyelték. A glomeruláris kapszula fala vastag volt, és a kapszula fala és az endothel sejtek közötti tér eltűnt a súlyosan érintett glomerulusban. Néhány vesetubulus kitágult és a hámsejtek elszaporodtak. Fehérje öntvényeket láttak a tubulusban. Gyulladásos sejtek, például monociták, lymphocyták és plazmacyták infiltrációját figyelték meg fokális aggregációval a renalis interstitialis-ban. Intersticiális fibroblasztok proliferációját is megfigyelték.

a melatoninnal kezelt egerekben különböző mértékű javulás volt megfigyelhető(3.d) Ábra és 1. táblázat). A glomeruláris atrófia és a kapilláris falak megvastagodása enyhe vagy közepes mértékben megváltozott. A mezangiális szélesítés szintén javult. A kapszula fala és az endothelsejtek közötti tér kisebb volt, mint a normál egereknél, de javulás volt tapasztalható a nem kezelt modellcsoporthoz képest. Enyhe lymphocyták infiltrációt is megfigyeltek. Néhány vesetubulus enyhe tágulást mutatott, és néhány protein öntést. Ennek ellenére az összes változás kevésbé volt súlyos, mint a modell egereknél.

4. Megbeszélés

ebben a vizsgálatban a pristane-nal kezelt egerek immunrendszeri zavarait és a melatonin hatását figyelték meg. Mivel az anti-DNS és hiszton antitestek érzékenyek voltak az SLE – ben, megvizsgáltuk az IgM anti-ssdns és Antihiszton antitestek változásait, és magas szintű autoantitesteket találtunk a pristane-injekcióval beadott egerekben. Vese elváltozásokat is találtak az egerekben. Ezek az eredmények összhangban voltak a korábbi jelentésekkel. Azt is megállapítottuk, hogy a melatonin antagonizálta az IgM anti-ssdns és a hiszton autoantitestek növekvő szintjét, és a melatonin csökkentheti a pristane által okozott vese elváltozásokat. A Pristane peritoneális irritáló hatású. Jól ismert, hogy az IgM osztályt a B1 (CD5+) B-sejt részhalmaz termeli , és a B1 részhalmaz erősen dúsul a peritoneális üregben , és balb/c egerekben expandálódik, ami növeli annak lehetőségét, hogy az IgM anti-ssdns és az I.P. pristane által indukált Antihiszton antitestek származnak az alhalmazból . Korábbi tanulmányok arról számoltak be, hogy a melatonin hatással volt az első antitest immunválaszra (IgM, IgG) . Egyes tanulmányok azt mutatták, hogy a melatonin kétirányú modulációval rendelkezik a limfocitákon . Tehát úgy gondoltuk, hogy a melatonin javíthatja az SLE tüneteit a B-sejtek túltermelésének modulálásával.

a citokinek hálózata fontos szerepet játszik az SLE fejlődésében. Egyes in vitro kísérletekben a melatonin gátolhatja egyes citokinek és T-limfociták immunhatását . Tehát megfigyeltük a melatonin hatását a citokinek hálózatának zavarára. Az IL-6-ot gyulladásos citokinnek tekintik, amelyet számos szöveti sejt választ ki, beleértve a makrofágokat és a Th2-sejteket. Az IL-6 szint pozitív korrelációt mutat az SLE aktivitási indexével. Eredményeink azt mutatták, hogy az IL-6 szintje nőtt a pristane injekció után, míg a melatonin csökkentheti az IL-6 termelést. Az IL-6 növekvő szintje miatt a B-sejtek több antitestet szekretálhatnak, és elősegíthetik a nephritis kialakulását . Tehát az IL – 6 termelés melatonin általi downregulációja segít az antitestek termelésének és a vese elváltozásainak gátlásában.

az IL-2-t a Th1-sejtek, az IL-13-at pedig a Th2-sejtek választják ki. Az IL-2 és IL-13 változásairól szóló dokumentumokban ellentmondásos eredmények találhatók. Tehát ebben a pristane által indukált SLE modellben a két citokin szintjét vizsgáltuk. Eredményeink azt mutatták, hogy az IL-2 szintje a pristane-injektált egerekben alacsonyabb volt, mint a normál egerekben, míg az IL-13 szintje a pristane-injektált egerekben magasabb volt, mint a normál egerekben. Azt is megállapítottuk, hogy a melatonin csökkentheti az IL-13 termelést, de növeli az IL-2 termelést. Számos jelentés kimutatta, hogy az IL-2 szintje csökkent az SLE-ben, különösen az aktív stádiumban, és hogy az IL-2 képes szabályozni a B-limfociták aktiválódását . Egyes kutatások kimutatták , hogy a melatonin szabályozhatja az IL-2/IL-2 receptorok szintjét, amely a melatonin gátló hatásának mechanizmusa lehet az IL-2 termelésre. Az IL-13, a lupus egyik legfontosabb citokinje, úgy vélték, hogy egy B-sejt aktiváló faktor, amely sok autoantitest túlzott termelését eredményezte . Az IL-13 kapcsolatban áll az SLE vese elváltozásaival . Tehát az IL-13 termelés melatonin általi downregulációja szintén segít az antitestek termelésének és a vese elváltozásainak gátlásában.

a Th1-típusú citokin csökkenő szintje és a Th2-típusú citokin növekvő szintje azt is jelezte, hogy a Th1-ről a Th2-re eltolódott az érintetlen indukált lupusban. Egyes jelentések azt mutatták, hogy az exogén melatonin aktiválhatja a T-sejteket, és jelentősen elősegítheti a Th1 típusú citokineket, amelyek részt vesznek az immunzavarok szabályozásában . Eredményeink azt mutatták, hogy a melatonin fel tudja szabályozni a Th1 típusú citokineket, és le tudja szabályozni a Th2 típusú citokineket. Ez azt jelezte, hogy a melatonin modulálhatja a citokin hálózat zavarát az SLE egerekben a Th1/Th2 egyensúlyhiányának szabályozásával.

a prednizont , amely az SLE gyakori gyógyszere, pozitív gyógyszerként szolgálták ebben a vizsgálatban. Megállapítottuk, hogy a prednizon szabályozó hatással volt a pristane által kiváltott SLE – re. A prednizonhoz képest a melatonin hasonló vagy kissé korábbi hatással volt az SLE tüneteire. Mint tudjuk, a prednizon mellékhatásai gyakoribbak és súlyosabbak, mint a melatonin. Ezért úgy gondoltuk, hogy a melatonin potenciális gyógyszer lehet az SLE számára.

összefoglalva, a pristane által indukált lupus az immunrendszer zavarait mutatja, mint például az autoantitestek magas szintje és a citokinhálózat egyensúlyhiánya, ami az ezt követő nephritist indukálja. A változások hasonlóak az emberi lupushoz, és a pristane gyakori a környezetben; ezért ez a modell alkalmas a melatonin környezeti vonatkozású SLE-re gyakorolt hatásainak tanulmányozására. Másrészt azt is kimutattuk, hogy a melatonin beadása gátolta a pristane által kiváltott lupus változásait. Ez arra utal, hogy a melatonin jótékony hatással volt a környezeti eredetű lupusra. A mechanizmusok magukban foglalhatják az immunrendszer zavarainak modulációját, különösen a citokinek hálózatában. Azonban további vizsgálatokra van szükség a szabályozási folyamat és az autoimmun betegségekre gyakorolt hatás kulcsfontosságú tényezőjének jobb megértéséhez.