プリスタン誘発性狼瘡マウスのサイトカイン障害に対するメラトニンの調節効果

概要

全身性エリテマトーデス（sle）は、多くの環境要因との関連で発症する。 メラトニンが環境関連ＳＬＥに及ぼす影響を調べることがより重要であると考えた。 本研究では、0.5mlのプリスタンは、女性BALB/cマウスでSLEを誘導するために使用されました。 メラトニン（0.01、0.1、1.0mg/kg）は、プリスタン注射直後に24週間経口投与された。 IgM抗ssDNAおよびヒストン抗体は、0、1、2、4、8週間のプリスタン注射後に検出された。 ＩＬ−２、ＩＬ−６およびＩＬ−１ ３のレベルは、２ ４週間後に検出された。 腎病変も認めた。 その結果，メラトニンはＩｇｍ抗ｓｓｄｎａおよびヒストン自己抗体のレベルの増加にきっ抗することが分かった。 メラトニンはまた、IL-6およびIL-13産生を減少させ、IL-2産生を増加させることができる。 その上、melatoninはpristaneによって引き起こされる腎臓の損害を減すことができます。 これらの結果から，メラトニンはサイトカイン障害を調節することによりプリスタン誘発性ループスに有益な効果を有することが示唆された。

1. はじめに

全身性エリテマトーデス（SLEまたはループス）は、身体の正常な組織および細胞を攻撃し、炎症および組織損傷をもたらす自己免疫疾患である。 SLEは、任意の年齢および任意の性別で発生します。 しかし、女性は男性よりもSLEを持つ可能性が高くなります。 さらに、サイトカインネットワークの障害は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１ ３、およびＩＦＮ−を含むＳＬＥにおいても報告されている。 これらのサイトカインは、自己抗体産生や免疫複合体腎炎などのSLEの発症と密接な関係を持っています。 しかし、異なる報告におけるいくつかのサイトカインの変化についていくつかの矛盾した結果がある。

近年、SLEの病因に関与する可能性のある環境要因にますます注意が払われています。 自己免疫疾患は、先進国でますます一般的になってきており、これらの疾患は、環境要因の影響を受ける可能性があります。 Pristaneは敏感な人口のSLEの環境の制動機として本当らしい候補者です。 動物実験では、プリスタンが高レベルの自己抗体や免疫複合糸球体腎炎などのマウス株（BALB/c）においてループス様自己免疫疾患症状を誘発することが示された。 いくつかの疫学的調査はまた、血液中のプリスタンを有するすべての人が、別個の自己免疫疾患または自己免疫疾患の症状を有することを証明した。 さらに、鉱物油、サメ油、および多くの食品に含まれるプリスタンは、SLEを引き起こす可能性のある環境暴露の可能性があるようです。 したがって，プリスタン誘導ＳＬＥ様マウスモデルを用いてＳＬＥに関与する環境因子を研究することがより適切であると考えられる。

メラトニンは、主に松果体によって合成され、分泌され、中枢神経系の内外で特定の受容体を作ることができます。 メラトニンは炎症や免疫細胞に直接影響を与えるだけでなく、視床を介して間接的に影響を与えます。 さらに重要なのは、メラトニンは神経免疫内分泌系における重要な活性物質とみなされていることである。 それは慢性関節リウマチおよびアジュバント関節炎のようなある自己免疫疾患のcytokineネットワークの不均衡を調整ことはできます。 いくつかの実験では、mrl-lpr/lprマウスに対するその効果を調べ、メラトニンは雌マウスの自発的なSLEに有益であることを示した。 環境は現代社会におけるSLEの重要な要因であるため、メラトニンが環境関連SLEに及ぼす影響にもっと興味がありました。

sleにおけるメラトニンの役割、特に環境関連ループスにおける役割を調べるために、プリスタン誘導マウスを使用した。 サイトカイン障害およびプリスタン誘発ＳＬＥモデルの以下の変化に及ぼすメラトニンの影響も決定した。

2. 材料および方法

2.1. 動物

二ヶ月齢六十雌BALB/cマウス（g）は、安徽医科大学の実験動物センターによって供給されました。 本研究に記載された全ての実験プロトコールは、安徽医科大学臨床薬理研究所の動物実験のための倫理レビュー委員会によって承認された。

2.2. 材料

メラトニンはシグマから購入しました。 プリスタン，熱変性子牛胸腺ＤＮＡ（ｓｓｄｎａ），全子牛胸腺ヒストン（ｈｉｓｔｏｎｅ），コンカナバリンＡ（Ｃｏｎａ），リポ多糖類（ＬＰＳ）もＳｉｇｍａから得た。 ビオチン共役ウサギ-抗マウスIgM抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼ標識アビジンから購入した。 マウスインターロイキン−２ＥＬＩＳＡキットおよびインターロイキン−６ＥＬＩＳＡキットをＡＤＬから購入した。 Ｍｏｕｓｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ ３ｅｌｉｓａキットをＢＩＯＯから購入した。

2.3. 実験プロトコル

六十女性BALB/cマウスは、ランダムに六つのグループに分けられた：正常対照群、モデル群、陽性対照群を務めたプレドニゾン治療群、およびメラトニン（0.01、0.1、1.0mg/kg）治療群（MT1）、メラトニン群二（MT2）、およびメラトニン群三（MT3）を含む。 正常対照群のマウスに0の腹腔内注射を与えた。5mlの正常な生理食塩水（NS）、および他のグループに0.5mlのプリスタンの腹腔内注射を与えた。 正常対照群およびモデル対照群のマウスは、最初の治療後に一日あたりのNSの胃内投与を受けた。 陽性対照群のマウスには、一日あたり5mg/kgのプレドニゾン（Pre）の胃内投与を与えた。 MT1グループのマウスは、0.01mg/kgのメラトニン、MT2 0.1mg/kgのメラトニン、およびMT3 1.0mg/kgのメラトニンで胃内処理した。 自己抗体のレベルを測定するために、治療前（０）および治療後２、４、および８週間に尾静脈から血清を採取した。 プリスタン投与から二十四週間後、すべてのマウスを殺し、脾臓を免疫学的検出のために除去した。

2.4. 抗ｓｓＤＮＡおよびヒストン抗体に対する酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅｌｉｓａ）＜１ ７ ４ ５＞＜９ ６ ９ ２＞抗ｓｓＤＮＡおよびヒストンＩｇｍ抗体を、ｅｌｉｓａ法により、記載のものと同様の方法で検出した。 10mg/L ssDNAまたはヒストン抗原でコーティングされた96ウェルELISAプレートは、4で一晩インキュベートしました。 次の日に、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した。 プレートをブロッキング緩衝液（ＰＢＳ−２％ウシ血清アルブミン）と共に４時に一晩インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した。 １：２ ５ ０に希釈したマウス血清を用いて４で一晩インキュベートした後、プレートを再び洗浄し、次いで１：２ ０ ０に希釈したビオチン抱合ウサギ抗マウスＩｇｍ抗体を用いて４で２時間インキュベートした。 その後、プレートを洗浄し、1：200希釈でワサビペルオキシダーゼ標識アビジンで2時間4でインキュベートした。 次いで、プレートを再び洗浄し、１ ０ ０Ｌの基質−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）および過酸化水素溶液を３ ７で３ ０分間ウェルに加えた。 反応は、ウェル当たり50Lの2M H2SO4を添加することによって終了した。 黄色の色の強度は、マイクロプレートリーダーで490nmで読み取られました。 他の８匹の正常なＢＡＬＢ／ｃマウスの血清を収集し、同時に検出し、平均密度およびＳＤを計算して対照とした。 異なるグループの試料の平均酵素指数（Ｅ Ｉ）は、＜８ ８ ５＞＜８ ６ ５ ４＞２． 脾臓細胞培養およびサイトカインの誘導

脾臓細胞培養およびサイトカインの誘導は、に記載の方法の改変であった。 簡単に説明すると、マウスから無菌的に除去された脾臓から単細胞懸濁液を調製し、細胞／ｍｌの最終濃度で２ ４ウェル培養プレート中で培養した。 細胞を、１ ０％ウシ胎仔血清、２ｍ Ｍグルタミン、１ｍ Ｍピルビン酸ナトリウム、５ ０Ｍ２−メルカプトエタノール、および１ ０ｍ ｌペニシリン、ストレプトマイシンおよび抗真菌溶液／Ｌ（Ｓｉｇｍａ）を補充したＲＰＭＩ−１ ６ ４ ０中で培養した。 培養物を、３ｍｇ／ＬのＣｏｎａ、１ ２ｍｇ／ＬのＬＰＳ、または培地単独で刺激し、５％のＣＯ２で加湿空気中３ ７でインキュベートした。 上清を４ ８時間で採取し、サイトカインアッセイのために２ ０時間で保存した。

2.6. サイトカインアッセイ

上清中のインターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-6（IL-6）、およびインターロイキン-13（IL-13）の濃度は、これらのサイトカインのマウス形 各試料の強度を、マイクロプレート分光光度計で４ ５ ０ｎｍで読み取った。

2.7. 病理組織学的技術

マウスを犠牲にしながら収集された腎臓は、パラフィン埋め込みの前に中性緩衝ホルマリンで24時間固定されました。 切片をヘマトキシリンとエオシンとＪｏｎｅｓ銀メテナミンで染色し，腎病変の重症度を光学顕微鏡で調べた。 糸球体腎炎，腎尿細管病変，間質性炎症を認め，ループス腎炎に特徴的な組織学的病変の重症度を不在（），軽度（），中等度（），重度（）と評価した。

2.8. 統計分析

結果をSDとして表現した。 統計的分析は、有意性の最小レベルとして

3を有するStudentの双方向t検定を用いて行った。 結果

3.1. 血清中のIgm抗ssDNAおよびヒストン抗体のレベルに対するメラトニンの影響

IgM抗ssDNAおよびヒストン抗体のレベルは、プリスタン注射群とメラトニン治療群で有意に異なっていた（図1（a）および図1（b））。

プリスタンの単回腹腔内注射の二週間後、血清中の抗ssDNA IgM抗体のレベルは明らかに増加し始め、4週でピークに達し、その後減少し始め、最終的に8週で正常 MT1群では、血清中の抗ssDNA IgM抗体のレベルも増加し、4週でピークに達したが、その後、モデル対照群（）に比べてより明らかに減少した。 MT2群では、血清中の抗ssDNA IgM抗体のレベルは、最初の四週間の間に増加したが、モデル群（）のそれよりもはるかに低く、他の期間に正常なままであった。 MT3群では、抗ssDNA IgM抗体のレベルは上昇しなかった（図1(a)）。

血清中の抗ヒストン抗体は、注射後1週間で増加し、4週間でピークに達した後、徐々に減少し、8週間で正常に戻った。 MT1群では、血清中の抗ヒストン抗体のレベルは、モデル対照群（）のそれよりも有意に低く、4週で正常に戻っていた。 ＭＴ２群およびＭＴ３群では、抗体のレベルは最初の４週間の間に増加したが、モデル群（）よりもはるかに低く、他の期間では正常のままであった（図１（ｂ））。

3.2. サイトカイン産生に及ぼすメラトニンの影響

sleのサイトカインに及ぼすメラトニンの影響についてのより良い洞察を得るために、ConAまたはLPSで刺激された脾細胞によるTh1型およびTh2型サイトカインの産生をマウスループスの過程でアッセイした。 その結果、プリスタン誘導sleマウスでは、IL-2、IL-6、IL-13の産生が変化することが示されました(図2)。 モデル対照群のマウスからの脾細胞のIL-2産生は正常マウス（）からの産生よりも低かったが、モデル対照群のマウスからの脾細胞のIL-6およびIL-13産生は正常マウス（）からの産生よりも高かった。 MT2およびMT3群では、IL-2レベルは正常レベルまでであり、モデルマウスのそれよりも明らかに高かった（）が、IL-6およびIL-13レベルはモデルマウスのそれよりも明らかに低かった（、）（図2）。

(a)

(b)
(b)
(b))

(c)
(c))

(a)(b)
(b)(c)
(c)(b)
(b)(c)
(c)
(c))

フィギュア2

すべてのマウスを24週間の終わりに屠殺し、脾臓リンパ球を1×106細胞/ウェルに播種した。 脾臓リンパ球におけるIL-2濃度は、48mg/L ConAで3時間刺激された。 脾臓リンパ球におけるIL-6およびIL-13濃度は、48mg/L LPSで12時間刺激された。 培養上清中のＩＬ−２、ＩＬ−６、およびＩＬ−１ ３濃度をＥＬＩＳＡによって検出した。 データは平均±ＳＤ（ｎ＝４〜５）で与えた。 <01,P*<.05対正常対照群、≤P<。05、∆ ∆p<。01対モデル対照群。

3.3. 腎組織病理学的変化に対するメラトニンの影響

マウスの腎組織病理学的変化を表1および図3に示す。

(a)
(a)
(a))

(b)

(c)
(c)
(c))

(d)
(d)

((a)
(a)
(b)(c)
(c)(d)
(d)
(d))

フィギュア3

犠牲時に採取した腎臓は、組織学的検査のためにH&Eで染色した。 （ａ）正常対照群（Ｈ Ｅ×２ ０ ０）。 （ｂ）モデル対照群（Ｈ Ｅ×２ ０ ０）。 （ｃ）モデル対照群（Ｈ Ｅ×４ ０ ０）。 （ｄ）Ｍ ｔグループ（Ｈ Ｅ×２ ０ ０）。

図3(a)に示すように、正常マウスでは腎異常は見られなかった。 糸球体の体積と細胞数は正常であった。 糸球体毛細血管壁は薄かった。 尿細管には蛋白質キャストは見られなかった。 腎間質ではリンパ球の浸潤と線維芽細胞の増殖は認められなかった。

図3(b)および3(c)および表1に示すように、ほとんどのプリスタン注射マウスは軽度から重度のパターンの腎異常を明らかにした。 いくつかの糸球体は毛細血管拡張と毛細血管壁の肥厚を伴う糸球体萎縮を示した。 いくつかのcitesは血栓形成を明らかにした。 メサンギウムの広がりと細胞層の増加も観察された。 糸球体カプセル壁は厚く，重度の影響を受けた糸球体ではカプセル壁と内皮細胞との間の空間は消失した。 腎尿細管の中には拡張と上皮細胞の増殖を示したものもあった。 尿細管には蛋白質キャストが見られた。 腎間質には単球，リンパ球，形質細胞などの炎症細胞の浸潤が見られた。 間質線維芽細胞の増殖も観察された。

メラトニン投与マウスでは、程度の異なるいくつかの改善があった（図3（d）および表1）。 糸球体萎縮と毛細血管壁の肥厚は軽度または中等度に変化した。 メサンギウムの広がりも改善した。 カプセル壁と内皮細胞の間の空間は正常マウスよりも小さかったが，非処理モデル群に比べて改善があった。 軽度のリンパ球浸潤も認めた。 いくつかの腎尿細管は軽度の拡張といくつかのタンパク質キャストを示した。 それにもかかわらず、すべての変化はモデルマウスのそれよりも重篤ではなかった。

4. ディスカッション

本研究では、プリスタンプライミングマウスの免疫障害とメラトニンの効果が観察されました。 ＳＬＥでは抗ＤＮＡ抗体とヒストン抗体が感受性であったため，Ｉｇｍ抗ｓｓｄｎａ抗体と抗ヒストン抗体の変化を調べ，プリスタン注射マウスで高レベルの自己抗体を見出した。 マウスにも腎病変が認められた。 これらの結果は、以前の報告と一致していた。 また，メラトニンはＩｇｍ抗ｓｓｄｎａおよびヒストン自己抗体のレベルの上昇にきっ抗し，メラトニンはプリスタンによる腎病変を軽減することが分かった。 プリスタンは腹膜刺激剤である。 IgMクラスはB1(CD5+)B細胞サブセットによって産生され、B1サブセットは腹腔内で高度に濃縮され、BALB/cマウスで拡張され、I.p.pristaneによって誘導されるIgM抗ssDNAおよび抗ヒストン抗体がサブセットに由来する可能性があることはよく知られている。 以前の研究では、メラトニンが最初の抗体免疫応答（IgM、IgG）に影響を及ぼすことが報告されていました。 いくつかの研究では、メラトニンはリンパ球に双方向変調を有することが示された。 そこで，メラトニンはＢ細胞の過剰産生を調節することによりＳＬＥ症状を改善できると考えた。

サイトカインネットワークは、SLEの開発に重要な役割を果たしています。 いくつかのin vitro実験では、メラトニンはいくつかのサイトカインおよびTリンパ球の免疫効果を阻害する可能性がある。 サイトカインネットワークの乱れに及ぼすメラトニンの影響を観察した。 IL-6は、マクロファージやTh2細胞を含む様々な組織細胞によって分泌される炎症性サイトカインと考えられている。 IL-6レベルはSLEの活性指数に正の相関を有する。 我々の結果は、メラトニンはIL-6産生を減少させることができるが、IL-6のレベルは、プリスタン注射後に増加したことを示した。 IL-6のレベルの上昇は、B細胞がより多くの抗体を秘密にし、腎炎の発症を促進する可能性がある。 従ってmelatoninによるIL-6生産のdownregulationは抗体の生産および腎臓の損害の禁止で有用です。＜８ ８ ５＞＜９ ６ ９ ２＞ＩＬ−２はＴｈ１細胞によって分泌され、ＩＬ−１ ３はＴｈ２細胞によって分泌される。 IL-2およびIL-13の変化に関する文書にはいくつかの矛盾した結果がある。 そこで，このプリスタン誘導ＳＬＥモデルでは，二つのサイトカインのレベルを調べた。 我々の結果は、プリスタン注入マウスのIL-2のレベルは、正常マウスのそれよりも低かったが、プリスタン注入マウスのIL-13のレベルは、正常マウスのそれよりも高かったことを明らかにした。 我々はまた、メラトニンはIL-13産生を減少させるが、IL-2産生を増加させることができることを見出した。 多くの報告は、IL-2のレベルは、特に活性段階で、SLEで減少し、IL-2は、Bリンパ球の活性化をダウンレギュレートすることができることを示した。 いくつかの研究は、メラトニンがIL-2/IL-2受容体のレベルを調節することができることを示し、これはIL-2産生に対するメラトニンの阻害作用の機 ループスにおける最も重要なサイトカインの一つであるIL-13は、多くの自己抗体の過剰産生をもたらしたB細胞活性化因子であると考えられていた。 IL-13は、SLEの腎病変との関係を有する。 従ってmelatoninによるIL-13生産のdownregulationは抗体の生産および腎臓の損害の禁止でまた有用です。

th1型サイトカインのレベルの減少とTh2型サイトカインのレベルの増加はまた、自然のままで誘導された狼瘡でTh1からTh2に向かってシフトがあったことを示した。 いくつかの報告では、外因性メラトニンがT細胞を活性化し、免疫障害の調節に関与するTh1型サイトカインを有意に促進することが示された。 我々の結果は、メラトニンがTh1型サイトカインをアップレギュレートし、Th2型サイトカインをダウンレギュレートできることを示した。 そして、それはメラトニンがTh1/Th2の不均衡を調節することにより、SLEマウスにおけるサイトカインネットワークの障害を調節することができ

本研究では、SLEの一般的な薬剤であるプレドニゾンが陽性薬剤として提供された。 プレドニゾンはプリスタン誘発性ＳＬＥに対して調節効果を有することを見出した。 プレドニゾンと比較して，メラトニンはＳＬＥ症状に対して同様または少し前の効果を有した。 私たちが知っているように、プレドニゾンの有害反応は、メラトニンよりも一般的で深刻です。 したがって，メラトニンはＳＬＥの潜在的な薬剤であると考えた。

結論として、プリスタン誘発性狼瘡は、自己抗体の高レベルやサイトカインネットワークの不均衡などの免疫系に障害を示し、続いて腎炎を誘導する。 この変化はヒト狼瘡に類似しており、プリスタンは環境中で一般的であるため、このモデルは環境関連SLEに対するメラトニンの影響を研究するのに適 一方，メラトニンの投与はプリスタン誘発性ループスの変化を阻害することを示した。 そしてそれはメラトニンが環境関連の狼瘡に有益な効果を持っていたことを示唆しました。 このメカニズムは、特にサイトカインネットワークにおける免疫系の障害の変調を伴う可能性がある。 しかし、調節プロセスと自己免疫疾患に対するその作用の重要な要因をよりよく理解するためには、さらなる研究が必要であるべきである。