製剤化されたΒ-シフルスリンは、鳥種間で毒性に広い相違を示す

要約

鳥に対するピレスロイド系殺虫剤の毒性は無視できると一般的に仮定されているが、いくつかの種が試験されている。 製剤化されたβ−シフルスリンの経口急性毒性を、カナリア（Ｓｅｒｉｎｕｓ ｓ ｐ．）、光沢のあるカウバード（Molothrus bonariensis）、および耳の鳩（Zenaida auriculata）。 単回投与は、強制給餌によって成人に投与された。 おおよその致死量50()およびそれらの信頼区間は、おおよそのD-最適設計によって決定された。 カナリアは、試験した他の２種（ｍｇ／ｋｇおよびｍｇ／ｋｇ、ｒｅｓｐ．). カナリアについて得られたものは，ピレスロイドについての文献で入手可能な典型的な毒性値よりもかなり低かった。 この研究は、最小限の数の鳥を使用した最新の上下試験設計を使用して、潜在的に有毒な殺虫剤でより広い範囲の種を試験する必要性を強調してい

1. はじめに

農薬の広範な使用は、農業生態系における鳥の人口減少と死亡率に寄与している。 殺虫剤の様々なカテゴリーの中で、殺虫剤は、典型的には、それらの上昇した固有の毒性および曝露の可能性が高いため、急性効果のリスクが高い。 中毒による大量死亡の文書化されたケースと鳥に対する殺虫剤の負の影響を報告する様々な研究は、野生の鳥種に対する殺虫剤によってもたらされるリ アルゼンチンで注目された鳥の大量死亡の1つのケースは、有機リン殺虫剤であるモノクロトフォスによって引き起こされたスウェインソンのタカの1995年から1996年の死亡であった。 このイベントの後、アルゼンチンではmonocrotophosの登録がキャンセルされ、ピレスロイド系殺虫剤が重要性と人気を博しました。

殺虫剤の中で、ピレスロイドは、哺乳類および鳥類に対する相対的な安全性、低用量での高い殺虫効力、および速い生分解のために広く使用されている神経毒性合成殺虫剤の一種である。 昆虫軸索ナトリウムチャネルは、哺乳動物チャネルよりもピレスロイドエステルに対して100倍敏感である。 これらの理由から、ピレスロイドは徐々に現場で有機塩素、有機リン酸、およびカルバメート系殺虫剤に取って代わってきました。 ピレスロイドに関するいくつかの研究は脊椎動物（例えば）で行われており、大部分はげっ歯類（例えば）で行われている。 哺乳動物に対するピレスロイドの神経毒性は、立体化学的配置およびピレスロイド構造に依存する。 対照的に、鳥に対するピレスロイドの毒性はほとんど知られていないが、おそらくこのクラスの殺虫剤は一般的に鳥に対する毒性は無視できると考えられているためである。

ベータシフルスリン(cyano-(4-fluoro-3-phenoxyphenil)-methyl-3-(2,2-dichloroethenyl)-2,2-dimethyl-cyclopropanecarboxylate綿、トウモロコシ、ヒマワリおよび大豆の穀物のいろいろ害虫を制御するのに使用される殺虫剤の公式の有効成分はあります。 他のピレスロイドと同様に、β-シフルスリンは、興奮性刺激のすべての着信パルスによってニューロンで誘発される内側のナトリウム電流の延長の結果、神経膜のナトリウムチャネルの画分と立体選択的相互作用を提示する。 Β-シフルスリンは、4つのジアステレオマーの混合物であり、ジアステレオマー IIおよびIVが物質の化学的および物理的性質を支配し、決定する。 Β-シフルスリンはII型ピレスロイドであり、α炭素上に特徴的なシアノ基を有する。 タイプIIピレスロイドはタイプIピレスロイドより大きい殺虫性の有効性そして高い毒性を示します。 タイプIIのエステルはタイプIのエステルより延長された期間の間ナトリウムチャネルを開いた保ちます。 哺乳類におけるII型ピレスロイドの中毒の主な徴候には、コレオアテトーシスおよび唾液分泌（CS）が含まれる。

農薬マニュアルに記載されている鳥へのβ-シフルスリンのLD50は、ニホンウズラの>2000mg/kgである。 その”ECOTOX”データベース（http://cfpub.epa.gov/ecotox/）のUSEPAは同じ値を与えますが、北部のbobwhiteに関連付けられています。 しかし、車両や製剤に関する詳細のない報告書に引用された未発表の情報は、caのLD50を与えた。 カナリア諸島のβ-シフルトリンの100mg/kg、および>2000mg/kgの北部ボブホワイトおよびマガモアヒルのより一般的な値。 カナリア諸島のこの値は、もし本当なら、ピレスロイドが鳥に無毒であるという一般的な知恵に疑問を投げかけます。 本研究では、カナリアへのβ-シフルスリンのLD50の客観的な独立した確証と二つの新規および野生種、光沢のあるカウバード（Molothrus bonariensis）と耳の鳩（Zenaida auriculata）に商業的に製剤化されたβ-シフルスリンの急性経口毒性を決定するために持っていた。

2. 材料および方法

2.1. サイトおよび一般的な研究条件

この研究は、パラナ農業実験ステーション（31°50’53″S、60°32’19″W）のINTA（Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria）の研究施設で行われました。 研究は、ペンの6グループ（各3×2×3m）と24個の個々のテストケージ（各0.5×0.5×0.5m）と順化領域を含む20×10mの鳥小屋で行われました。 投与中の光周期および試験室の平均温度を記録した（表２および３）。 換気は屋外の環境の範囲内の温度そして湿気の屋内条件を維持するために制御されました。

2.2. 鳥類の選定、捕獲、飼育

野鳥、光沢のあるカウバード、耳の鳩は、周辺の畑での多数に基づいて選定され、その入手可能性、豊富さ、捕獲の成功を保証しました。 光沢のあるカウバードは、ミストネットと餌トラップを持つ耳の鳩で捕獲されました。 飼育下のカナリアが使用されていた。 健康な成鳥は、少なくとも14日間実験条件に順応する前に、性別によって重み付けされ、グループ化された。 各ペンには少なくとも3つの1.5mの止まり木が置かれていた。 光沢のあるカウバードは、食虫植物認定商業食品を供給され、耳の鳩は、小麦とヒマワリの種のミックスを提供され、カナリア、商業種子ミックスと挽いた卵を提供されました。 人間の消費のためのボトル入りの水は、すべての種にad libitumを提供しました。 この研究の学術的監督を提供するINTAまたは地元の大学（Universidad Nacional del Litoral）に構成された動物ケア委員会がないため、米国農務省のデンバー野生生物研究センターのガイ

2.3. 化学および用量＜５ ９ ０ ０＞＜８ ０ ５ １＞試験用量（ｍｇ β−シフルスリン／体重ｋｇ）を得るために、本発明者らは、市販の製剤（Ｂｕｌｌｄｏｃｋ ｏ ｆ Ｂａｙｅｒ Ｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅ）、１ ２.５ｇ ａ．ｉ．／１ ０ ０ｍｌの未報告の不活性成分の懸濁液 我々は、標識濃度が正しく報告され、β-シフルスリンの必要な用量に対応する製剤化された製品の必要な量を鳥に投与されたと仮定した。 ピレスロイド毒性は投与ビヒクルによって大きく影響され得ることが知られている。 野生の鳥は製剤化された製品に曝されるため、可能であれば追加のビヒクルなしで、カナリアのいくつかの用量の希釈剤として蒸留水を用いて製剤を試験することを選択した（表3の脚注の希釈を参照）。

投与量は、表3に示すように、おおよそのD-最適設計の各段階の標準式に従って、体重キログラム当たりa.i.ミリグラムで計算した。 投与量は、投与の１ ２時間以内に測定された個々の体重に基づいて計算した（表１）。 逆流を防ぐために、より高い用量（カナリアの場合は>0.17mL、光沢のあるカウバードの場合は>0.45mL、耳の鳩の場合は>1.0mL）を分割し、15分で分離された四つのアリコートで投与した。 この分割投与量は、限界試験ではすべての種、完全試験の最初の段階では1つのカナリア、完全試験のすべての段階ではすべての光沢のあるカウバードと耳の鳩について行われた（表1）。 投与量は、カナリア諸島では16mL/kg BW（体重）、光沢のあるカウバードでは27mL/kg BW、耳の鳩では26mL/kg BWを超えたことはありません。 処方された試験化学物質は、gavageによって与えられた。 カテーテルをワセリンで潤滑し，導入時の不快感を軽減した。 用量の一部または全部を逆流させ、その用量を生き残った個人は、逆流が用量を変更し、LD50の正しい近似を妨げるという事実のために他の人に代わ 光沢のあるカウバードの四十から六パーセント、耳の鳩の33％とカナリアの16％は、線量の前に絶食されているにもかかわらず、逆流しました。

2.4. 手順

急性経口毒性試験は、経済協力開発機構のガイドライン223草案に従って実施した。 この手順では、使用される鳥の数を最小限に抑え、広範な統計的検証が行われます。

まず、各種の五人を2000mg/kgの試験化学物質の限界用量で処理した。 この限界用量での死亡率に続いて、LD50は、近似D-最適設計（完全試験；図1）を用いて順次段階で推定された。 カナリアでは、カナリアLD50の初期推定値（前述の文献値および限界試験の結果に基づいて250mg/kg）を確認し、改善するために、完全試験の第一段階を実 より高いレベルの精度を得るために、追加のステージが追加されました。

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フィギュア1

使用される方法論の図。

鳥類を各試験に無作為に割り当て、投与後14日間観察した。 死亡率、臨床症状、研究の開始と終了の間の体重の変化、逆流、死亡までの時間（時間単位）、および回復が記録された。

試験動物と対照動物の両方を剖検によって調べ、巨視的な違いを決定した。 全臓器の大きさ，位置および外観および完全なｇ．ｉ．トラクトを調べた。 また、肝臓および心臓を秤量し、これらの器官の質量の損失または増加（肝腫大、壊死、肥大など）に関連する病理を検出するために、それらの相対重量を計算した（1）。).

2.5. 統計分析

すべての段階からの結合されたデータにプロビットモデルを適合させます(STAT-SAS6.1)LD50推定値、信頼区間、および線量-応答曲線の傾きを得る。 初期および最終体重および心臓および肝臓の相対体重の両方を、ｓｐｓｓ ｖ．

3. 結果

3.1. リミットテスト

リミットテストで得られた最初のLD50推定値は、光沢のあるカウバードと耳の鳩の両方で2247mg/kgであった。 対照的に、すべての治療されたカナリアは死亡し、したがって、限界試験でLD50の初期推定値を得ることは不可能であった（表2）。

3.2. フルテスト

カナリア諸島では、各連続段階で推定されたLD50値は、それぞれ68mg/kg、110mg/kgおよび170mg/kgであった。 追加の段階（第3段階と同様に、LD50の信頼区間を減少させるために行われた）の間に、最高用量を受けた4人のうち2人が逆流し、このため、結果には含 光沢のあるカウバードおよび耳の鳩の場合、第二段階で投与された用量は、限界試験で同様の結果のために同じであったが、死亡率は異なっていた（表3）。 第二段階後のLD50推定値は、それぞれ光沢のあるカウバードと耳の鳩のための1589mg/kgと2338.6mg/kgであった。 各種のすべての段階の組み合わせデータにプロビットモデルを当てはめることによって得られた最終的なLD50推定値は、カナリアでは170±41mg/kg、光沢のあるカウバードでは2234±544mg/kg、耳の鳩では2271±433mg/kgであった。 線量-応答曲線を図2に示します。

フィギュア2

線量応答曲線。

臨床徴候には、フリルの外観、唾液分泌（一定のえん下運動および頭の揺れによって証明される）、活動の減少、衰弱、喘鳴、労働呼吸、体の振戦、バランスの喪失および/または痙攣が含まれていた。 徴候は投薬直後に現れ、数分から数時間続いた。 臨床的徴候を生じさせない用量や、痙攣を含む中毒の徴候を有する個体の回復を可能にする他の用量があった（表2および3）。 すべての回復は、投与後最初の24時間以内であった。 投与前および14日間の投与後の重みを表4に示す。 投与前と投与後14日の生存者の体重との間に有意差はなかったが、14日後の体重が投与前の体重（）よりも高かった完全な試験の第三段階のカナリアを除いて、投与前の体重と投与後14日の体重との間に有意差はなかった。 死亡までの最大時間は1であった。カナリア諸島では75時間、耳の鳩では3時間、光沢のあるカウバードでは5時間。 カナリアのみが投与量の増加に伴って死亡までの時間が短くなる傾向を示した（図3）。

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フィギュア3

用量の関数としての死亡時間（死亡を引き起こした用量のみが示される）。

死亡したすべての鳥は、前肢と後肢の硬さを示した。 殺虫剤製剤に起因するｇ．ｉ．トラクトの異なる部分に白色の厚い液体を観察した。 処置個体と対照個体の臓器間の巨視的差は検出されなかった。 心臓および肝臓（および）の相対重量はいずれも変化しなかった（すべての症例において）。

4. ディスカッション

カナリア諸島で得られたLD50値は、欧州委員会のβ-シフルスリンに関する報告書に記載されている値に近似しており、この種の中 光沢のあるカウバード（別の通行人種）と耳の鳩で得られた製剤化されたβ-シフルスリンのLD50値は、bobwhiteウズラと日本のウズラで報告された値に近く、β-シフルスリンが実質的に非毒性またはクラスIIIであることを確認している。 これらの感受性の違いを系統発生のみに帰する前に、いくつかの注意が必要である。 投与手順の変化は、我々の結果に望ましくない変化をもたらした可能性がある。 これらは、以下で詳細に説明される。

カナリア諸島と他の試験された鳥との間でβ-シフルスリンに対する感受性が異なるのは、毒性作用部位の特性、腸吸収、代謝、および/またはこの物質の排除の違いによるものである可能性がある。 例えば、ウズラへのcypermethrinの低い激しい毒性はcypermethrinの致命的な効果へのウズラのCNSの抗力が高い、多数のプロダクトへのより大きい広範な新陳代謝、および排泄物の急速な除去によって説明されました。 同様の生理学的メカニズムは、β-シフルスリンに対する感受性が低いことを説明する光沢のあるカウバードと耳の鳩で発生する可能性があります。 さらに，毒性作用および代謝差の部位における感受性の有意差および異なる主な解毒経路および酵素活性の両方が，これらの殺虫剤に対する差動応答において主要な役割を果たす可能性がある。 一方，本研究に含まれる三つの鳥の体の大きさの違いは，結果に影響を与えた可能性がある。 Mineauらによって行われたアロメトリック研究に基づいて。 カナリアの体の大きさが他の二つの種と比較して小さいことは、より高い感度に寄与している可能性がある。

実験設定と我々の手順に関連する要因は、この研究の結果に影響を与えた可能性があります。 温度とピレスロイドの毒性効果との関係は、昆虫、両生類および哺乳類を含む動物のいくつかのグループについて示されている。 我々の研究では、試験の各段階の時の周囲温度に変動が認められた（表3）。 しかし、光沢のあるカウバードの場合、変動がわずかに高かったとしても、異なる温度の連続した段階からのデータを組み合わせてLD50を得たため、結果に影響を与えることはまずありません。 さらに、様々な用量容積および分割投与は、実験動物間の変動性を増加させた可能性がある。 私たちの研究では、カナリアは、他の二つの種（表1）に使用されたものよりもはるかに下のボリュームを投与しました。 Wolansky et al. 別の合成ピレスロイドであるビフェントリンの用量で送達されるコーン油の量を増加させることは、ラットにおける農薬の時間経過および効力を変 投薬の代理店としてオイルの使用は非常に親油性殺虫剤がテストされているとき避けるべきです。 従って私達はきちんとした公式と投薬によって可能であればこの問題を避け、投薬の解決の殺虫剤の相対的な集中を変えないことを望みます。 アリコートの数（表1）と試験における死亡率（表3）を比較すると、正確な投与計画はおそらく我々の試験結果に大きな影響を与えなかったことを示唆している。 最後に、有効成分ではなく製剤化された材料（不明なinertを含む）を試験したため、カナリアが有効成分または製剤のいずれかに敏感であるかどうかを確 しかし、a.iのために引用された値との類似性。 欧州連合および他の二つの種における製剤の毒性の相対的な欠如（有効成分のみでウズラまたはマガモで得られたものと同様のLD50値を有する）は、ピレスロイドに対する感受性の違いを示唆しており、製剤材料に含まれるinertsに対する感受性の違いを示唆していない。

3種の鳥類で高用量に反応して観察される臨床症状は、Sheetsらによって記載されているものと一致しています。 β-シフルスリンで処理したラットおよびQadriらによって観察されたラットでは。 ニワトリでペルメトリンとシペルメトリンを試験した。 これらの症状は，活動の低下，全身の振戦，唾液分泌，動揺呼吸，平flat化姿勢，および振付アテトーシスであった。 神経中毒症状は、摂取後短時間で観察され、数時間まで持続し、神経系からのピレスロイドの除去が迅速であることを示している。 すべての種からの生存者は、少なくとも14日間の観察期間の終わりまでに体重の損失を示さなかった（表4）。 さらに、カナリアの体重は、完全なテストの第三段階の間に有意に増加した。 Ｓｉｎｇｈらは，アルビノラットのβ-シフルスリンによる急性治療後に体重の増加を観察した。 これらの著者らは、体重の増加は、制御されたものと比較して、処理された群の過剰な食物および水分摂取および食物変換効率の増加によるものであ

すべての死亡は投与後24時間以内に発生したが、おそらく血液、肝臓、筋肉、脳のピークレベルが治療の最初の日に達したためである。 光沢のあるカウバードと耳の鳩の死までの時間は、日本のウズラのMumtazとMenzerによってfenvalerateで得られたものと非常によく似ていた（4-8時間）。 急速な回復は、哺乳動物のピレスロイドによる中毒の特徴である。 3種の鳥類では、LD50に近づく用量を与えられた個体でさえ、迅速に回復した（表3）。 Pascual et al. 私たちと同じように鳩の逆流の高い頻度を報告しました。 逆流はカナリアではそれほど頻繁ではなく、逆流する生理学的能力の違いを示唆していた。 逆流した個体は他の個体に置換されていたので、この研究では結果は逆流の影響を受けなかった。

急性および亜急性の研究では、高用量のピレスロイドが肝肥大を引き起こすことが示されており、死亡が起こらない場合、これらの変化は可逆的であることが示されている。 それにもかかわらず、Yavasoglu et al. ラットでシペルメトリンを用いた人は、肝臓の健康または機能の変化の間接的な尺度として、相対的な肝臓重量（）は、用量の効果を示さなかった。 ラットおよびモルモットの心筋に対するピレスロイドの効果に関するin vitro研究があるが、心臓質量の損失または増加に関連する効果はここでは検出されなかった。

結論として、種内または種間の感受性の違いを悪化させる可能性のある要因があったが（例えば、投与量の変化、複数の投与スキーム、周囲温度の変化、体）、ベータシフルスリンに対するカナリアの高感度が確証された。 一方、製剤化されたβ-シフルスリンは、光沢のあるカウバードおよび耳の鳩に対して実質的に非毒性であることが判明した。 これらの結果は、鳥に対するピレスロイド（およびおそらく他の農薬）の毒性について一般化する前に、より広い範囲の種を試験する必要性を強調する。 特にβ-シフルスリンの場合、一般的には適用率が低い（トムリンによると7.5–20g a.i./ha）分野で使用されるが、鳥に対する安全性を完全に評価するためには、この農薬の毒性の潜在的な変動を考慮する必要がある。 本症例では，種感受性アプローチは，他の種の鳥類，特に小さな体の種がピレスロイドに対してより高い感受性を示すことを示唆している。 今後の研究は、カナリアがベータシフルトリンに敏感である理由を説明し、カナリアが他のピレスロイドにも敏感であるかどうかを判断するために必要であり、さらに重要なことに、カナリアに系統発生的に関連する野生生物種もピレスロイドに高い感度を示すかどうかを決定するために必要である。

謝辞

著者らは、この論文に資金を提供し、支援したEnvironment CanadaとInstituto Nacional de Tecnología Agropecuaria(INTA)に感謝します。 また、彼らは彼の本質的な統計的協力のための博士ブライアン*コリンズに感謝し、彼女のレビューのための博士ジュリー*ブロドゥール、INTAスタッフ、および材料の; 最後に、以前のドラフトに有用なコメントを提供した二つの匿名の審判。