Regulerende Effekt Av Melatonin På Cytokin Forstyrrelser I Pristane-Indusert Lupus Mus

Abstract

Systemisk lupus erythematosus (SLE) utvikler seg i forhold til mange miljøfaktorer. Etter vår mening er det viktigere å undersøke effekten av melatonin på miljørelatert SLE. I den foreliggende studien ble 0,5 ml pristan brukt til å indusere SLE hos KVINNELIGE BALB / c-mus. Melatonin (0,01, 0,1, 1,0 mg/kg) ble gitt oralt umiddelbart etter pristane-injeksjon i 24 uker. IgM anti ssDNA og histon antistoffer ble påvist etter 0, 1, 2, 4, 8 uker pristane injeksjon. NIVÅENE AV IL-2, IL-6 OG IL-13 ble påvist etter 24 uker. Nyrelesjoner ble også observert. Resultatene viste at melatonin antagoniserte de økende nivåene Av IgM anti ssDNA og histon autoantistoffer. Melatonin kan også redusere IL – 6-OG IL-13-produksjonen og øke IL-2-produksjonen. Dessuten kan melatonin redusere nyrelesjonene forårsaket av pristane. Disse resultatene antydet at melatonin har en gunstig effekt på pristane-indusert lupus gjennom å regulere cytokin-forstyrrelsene.

1. Innledning

Systemisk lupus erythematosus (Sle Eller Lupus) Er en autoimmun sykdom som kan angripe kroppens normale vev og celler, noe som resulterer i betennelse og vevskader . SLE forekommer i alle aldre og i alle kjønn. Imidlertid er kvinner mer sannsynlig Å ha SLE enn menn . Dessuten er forstyrrelser i cytokinnettverket også rapportert i SLE, INKLUDERT IL-1, IL-2, IL-6, IL-13 og IFN-. Disse cytokiner har nære relasjoner til utviklingen AV SLE som autoantistoffer produksjon og immun-kompleks nefritt. Men det er noen motstridende resultater om endringene av noen cytokiner i ulike rapporter.

de siste årene har mer og mer oppmerksomhet blitt betalt til miljøfaktorer som kan være involvert i patogenesen AV SLE . Autoimmune sykdommer blir stadig vanligere i industrialiserte land, og disse sykdommene kan påvirkes av miljøfaktorer . Pristane er en sannsynlig kandidat som en miljøutløser AV SLE i utsatt befolkning. Dyreforsøk viste at pristane kunne indusere lupus-lignende autoimmune sykdomssymptomer i en stamme av mus (BALB/c), for eksempel høye nivåer av autoantistoffer og immunkompleks glomerulonephritis . Noen epidemiologiske undersøkelser viste også at alle personer med pristane i blodet hadde forskjellige autoimmune sykdommer eller symptomer på autoimmun sykdom . I tillegg synes pristane funnet i mineralolje, haiolje og mange matvarer å være en mulig miljøeksponering som kan utløse SLE. Så det kan være mer hensiktsmessig å undersøke miljøfaktorer involvert I SLE ved å bruke pristane-indusert SLE-lignende murine-modell.

Melatonin syntetiseres og utskilles hovedsakelig av pinealkjertelen som kan gjøre spesifikke reseptorer inn og ut av sentralnervesystemet. Melatonin kan ikke bare direkte påvirke betennelse og immunceller, men har også indirekte påvirkninger på det gjennom thalamencephalon . Enda viktigere er melatonin ansett som et viktig aktivt stoff i det nevro-immun-endokrine systemet . Det er i stand til å regulere ubalansen i cytokinnettverk i noen autoimmune sykdommer som revmatoid artritt og adjuvant leddgikt . Noen eksperimenter undersøkte effektene på MRL-lpr / lpr-mus og viste at melatonin var gunstig for spontan SLE hos kvinnelige mus . Siden miljø er en viktig faktor I SLE i det moderne samfunn, var vi mer interessert i effekten av melatonin på miljørelatert SLE.

for å undersøke melatonins rolle i SLE, spesielt i miljørelatert lupus, ble pristane-induserte mus brukt. Effekten av melatonin på cytokinforstyrrelsene og følgende endringer i pristanindusert sle-modell ble også bestemt.

2. Materialer og Metoder

2.1. Dyr

Seksti kvinnelige BALB / c mus i alderen to måneder (g) ble levert Av Experimental Animal Center Of Anhui Medical University. Alle eksperimentelle protokoller beskrevet i denne studien ble godkjent Av Ethics Review Committee For Animal Experimentation Ved Institutt For Klinisk Farmakologi, Anhui Medical University.

2.2. Materialer

Melatonin ble kjøpt Fra Sigma. Pristan, varmenaturert kalv thymus DNA (ssDNA), total kalv thymus histon (histon), concanavalin A (ConA) og lipopolysakkarider (lp) var også Fra Sigma. Biotin-konjugerte kanin-anti-mus IgM antistoffer og pepperrot peroxidase-merket avidin ble kjøpt fra . Mus interleukin-2 ELISA kits og interleukin-6 ELISA kits ble kjøpt fra ADL. Mus interleukin-13 ELISA kits ble kjøpt FRA BIOO.

2.3. Eksperimentelle Protokoller

Seksti KVINNELIGE BALB/c-mus ble tilfeldig delt inn i seks grupper: normal kontrollgruppe, modellgruppe, prednison-behandlingsgruppe som fungerte som positiv kontrollgruppe, og melatonin (0,01, 0,1, 1,0 mg/kg) behandlingsgrupper inkludert melatonin gruppe en (MT1), melatonin gruppe to (MT2) og melatonin gruppe tre (MT3). Musene i normal kontrollgruppe fikk en intraperitoneal injeksjon på 0.5 ml normal saltvann( NS), og de andre gruppene fikk en intraperitoneal injeksjon på 0,5 ml pristan. Musene i normal kontrollgruppe og modellkontrollgruppe fikk intragastrisk administrering AV NS per dag etter den første behandlingen. Musene i positiv kontrollgruppe fikk intragastrisk administrering av 5 mg/kg prednison (Pre) per dag. Musene I MT1-gruppen ble intragastrisk behandlet med 0,01 mg/kg melatonin, MT2 0,1 mg / kg melatonin og MT3 1,0 mg/kg melatonin. Sera ble samlet fra halevenen før behandling (0) og 2, 4 og 8 uker etter behandling for å måle nivået av autoantistoffer. Tjuefire uker etter pristanadministrasjon ble alle mus drept, og milt ble fjernet for immunologiske deteksjoner; i mellomtiden ble nephrisk vev undersøkt ved lysmikroskopi.

2.4. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISAs) for Anti-ssDNA Og Histon Antistoffer

anti-ssDNA og histon IgM antistoffer ble påvist VED EN ELISA teknikk lik DEN som er beskrevet i . 96-brønns elisa-plater belagt med 10 mg / L ssdna eller histonantigener ble inkubert over natten ved 4. Dagen etter ble platene vasket med PBS-Tween. Platene ble inkubert med blokkeringsbuffer (PBS-2% bovint serumalbumin) over natten på 4 og vasket MED PBS-Tween. Etter inkubert over natten ved 4 med murint serum fortynnet til 1 : 250, ble platene vasket igjen og deretter inkubert i 2 timer ved 4 med biotin-konjugert kanin Antimouse IgM antistoffer fortynnet til 1 : 200. Deretter ble platene vasket og inkubert i 2 timer ved 4 med pepperrotperoksidase-merket avidin i 1 : 200 fortynning. Platene ble deretter vasket igjen, og 100 L substrat —tetrametylbenzidin (TMB) og hydrogenperoksidoppløsning ble tilsatt til brønnene i 30 minutter ved 37. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av 50 L av 2 M H2SO4 per brønn. Intensiteten av den gule fargen ble lest ved 490 nm i en mikroplateleser. Sera av andre åtte normale BALB / c-mus ble samlet og oppdaget samtidig, og gjennomsnittlig tetthet og SD ble beregnet for å fungere som kontroll. De gjennomsnittlige enzymindeksene (EI) av prøvene i forskjellige grupper ble beregnet som:

2.5. Miltcellekultur Og Induksjon Av Cytokin

Miltcellekultur og induksjon av cytokiner var modifikasjoner av metodene som beskrevet i . Kort sagt ble enkeltcellesuspensjoner fremstilt fra milter aseptisk fjernet fra mus og dyrket i 24-brønnskulturplater ved en endelig konsentrasjon av celler / ml. Cellene ble dyrket I RPMI-1640 supplert med 10% føtalt kalveserum, 2 mM glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 50 M 2-merkaptoetanol og 10 ml penicillin, streptomycin og antimykotisk oppløsning/L (Sigma). Kulturer ble stimulert med 3 mg/L ConA, 12 mg / L LPS eller medium alene og inkubert ved 37 i fuktig luft med 5% CO2. Supernatanten ble høstet ved 48 h og bevart ved 20 for cytokinanalyser.

2.6. Cytokinanalyser

konsentrasjonene av interleukin-2 (IL-2), interleukin-6 (IL-6) og interleukin-13 (IL-13) i supernatanten ble bestemt ved bruk av egnede Kommersielle ELISAs for den murine formen av disse cytokinene. Intensiteten til hver prøve ble lest ved 450 nm i et mikroplatespektrofotometer.

2.7. Histopatologiske Teknikker

nyrene samlet mens ofre mus ble fikset i 24 timer i nøytral bufret formalin før parafin embedding. Seksjonene ble farget Med Hematoksylin Og Eosin og Jones silver methenamine og deretter undersøkt under et lysmikroskop for alvorlighetsgraden av nyrelesjonen. Glomerulonephritis, renale tubulære lesjoner og interstitial betennelse ble observert, og graden av alvorlighetsgrad av histologiske lesjoner karakteristisk for lupus nefritt ble evaluert som fraværende (), mild (), moderat () og alvorlig ().

2.8. Statistisk Analyse

Resultatene ble uttrykt SOM SD. Statistisk analyse ble utført Ved Bruk Av Studentens toveis t-test med som minimal signifikansnivå

3. Resultater

3.1. Effekter Av Melatonin på Nivåer Av IgM Anti-ssDNA Og Histonantistoffer I Sera

nivåene Av IgM anti-ssDNA og histonantistoffer var signifikant forskjellige mellom pristaninjeksjons-og melatoninbehandlingsgruppene (Figur 1(A) Og 1(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 1

sera av mus i hver gruppe ble samlet før behandling (0), 2, 4 og 8 uker senere, og nivåer Av IgM anti-ssDNA og Antihistone antistoffer ble detektert AV ELISA. EI ble beregnet i henhold til formelen. (a) Nivået Av IgM anti-ssDNA antistoff i hver gruppe, (b) nivået Av IgM Antihistone antistoff i hver gruppe. Data ble gitt i gjennomsnittlig±SD (n=6-8). P * <.05, P * * <.01 mot sera ved 0 uker, ∆p<.05, ∆ ∆ p<.01 versus sera i modell kontroll mus.

To uker etter en enkelt intraperitoneal injeksjon av pristane begynte nivået av anti – Ssdna IgM-antistoffer i sera å øke åpenbart, nådde topp ved 4 wk, deretter begynte å synke, og til slutt tilbake til normal ved 8 wk. I MT1-gruppen økte Nivået av anti-ssDNA IgM-antistoffer i sera også og nådde topp ved 4 wk, men deretter redusert mer åpenbart sammenlignet med modellkontrollgruppen (). I MT2-gruppen økte Nivået av Anti-Ssdna IgM-antistoffer i sera i løpet av de første fire ukene, men mye lavere enn modellgruppen (), og forblev normalt i andre perioder. I MT3-gruppen økte ikke nivået av anti-ssDNA IgM-antistoffer (Figur 1 (a)).

Antihistonantistoffer i sera økte 1 wk etter injeksjon, nådde topp ved 4 wk, deretter redusert gradvis, og returnerte til normal ved 8 wk. I MT1-gruppen var Nivåene Av Antihistonantistoffer i sera signifikant lavere enn for modellkontrollgruppen () og var tilbake til normal ved 4 uker. I MT2-og MT3-grupper økte antistoffnivåene i løpet av de første fire ukene, men mye lavere enn modellgruppen (), og forblev normale i de andre periodene (Figur 1(b)).

3.2. Effekter Av Melatonin På Cytokin Produksjon

for å få en bedre innsikt i påvirkning av melatonin på cytokiner I SLE, produksjon Av th1-type og Th2-type cytokiner ved splenocytter stimulert Med ConA eller LPS ble analysert i løpet av murine lupus. Resultatene viste at PRODUKSJONEN AV IL-2, IL-6 og IL-13 endret seg i pristane-induserte sle-mus (Figur 2). IL-2 produksjon av splenocytter fra mus i modellkontrollgruppen var lavere enn fra normale mus (), MENS IL-6 og IL-13 produksjon av splenocytter fra mus i modellkontrollgruppen var høyere enn fra normale mus (). I MT2-og MT3-grupper VAR IL-2-nivåene opp til det normale nivået og høyere enn for modellmus åpenbart (), MENS IL-6 og IL-13-nivåene var lavere enn for modellmusene åpenbart (, ) (Figur 2).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c))

Figur 2

alle mus ble ofret ved slutten av 24 uker, og miltlymfocytter ble sådd ved 1×106 celler/brønn. Il-2-konsentrasjoner i miltlymfocytter ble stimulert i 48 timer med 3 mg/L ConA. Il-6 og IL-13 konsentrasjoner i miltlymfocytter ble stimulert i 48 timer med 12 mg / L LPS. Il-2, IL-6 og IL-13 konsentrasjoner i kultur supernatanter ble påvist AV ELISA. Data ble gitt i gjennomsnittlig± SD (n=4-5). P * * <.01, P * <.05 versus Normal kontrollgruppe, ∆p<.05, ∆ ∆ p<.01 versus Modell kontrollgruppe.

3.3. Effekter Av Melatonin På Histopatologiske Endringer I Nyrene

histopatologiske endringer i nyrene hos mus er vist I Tabell 1 Og figur 3.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d))

Figur 3

nyrene samlet på ofringstidspunktet ble farget Med H&E For histologisk undersøkelse. (A) Normal kontrollgruppe(se×200). (b) modellkontrollgruppe (han×200). (c) modell kontrollgruppe (HAN×400). (d) MT-gruppen (HAN×200).

som vist i Figur 3 (a) ble det ikke sett nyreavvik hos normale mus. Volumet og celletallet av glomeruli var normalt. Glomerulær kapillærvegg var tynn. Ingen proteinstøping ble sett i tubuli. Lymfocytter infiltrasjon og proliferasjon av fibroblaster ble ikke sett i renal interstitiell.

som vist i Figur 3(b) og 3(c) Og Tabell 1, viste de fleste pristaninjiserte mus nyreavvik som varierte fra milde til alvorlige mønstre. Noen glomeruli viste glomerulær atrofi med kapillær dilatasjon og fortykkelse av kapillærvegger. Noen citerer avslørte trombusdannelse. Mesangial utvidelse og cellelag økende ble også observert. Glomerulær kapselvegg var tykk, og rommet mellom kapselvegg og endotelceller forsvant i alvorlig påvirket glomerulus. Noen nyretubuli viste dilatasjon og epitelcelleproliferasjon. Protein kaster ble sett i tubuli. En infiltrasjon av inflammatoriske celler som monocytter, lymfocytter og plasmacytter med fokal aggregering ble sett i renal interstitiell. Proliferasjoner av interstitielle fibroblaster ble også observert.

det var noen forbedringer av forskjellig grad i melatoninbehandlede mus(Figur 3 (d) Og Tabell 1). Glomerulær atrofi og fortykkelse av kapillærvegger ble endret i mild eller moderat grad. Mesangial utvidelse ble også forbedret. Rommet mellom kapselvegg og endotelceller var mindre enn for normale mus, men det var en forbedring sammenlignet med den ikke-behandlede modellgruppen. Liten lymfocyttinfiltrasjon ble også observert. Noen nyretubuli viste mild dilatasjon og noen få proteinkaster. Likevel var alle endringene mindre alvorlige enn i modellmus.

4. Diskusjon

i denne studien ble immunforstyrrelser av pristanprimerte mus og effekten av melatonin observert. Siden anti-DNA og histonantistoffer var sensitive i SLE, undersøkte vi endringene Av IgM anti-ssDNA og Antihistonantistoffer og fant høye nivåer av autoantistoffer i pristaninjiserte mus. Nyrelesjoner ble også funnet i musene. Disse resultatene var i samsvar med tidligere rapporter. Vi fant også at melatonin antagoniserte de økende nivåene Av IgM anti-ssDNA og histon autoantistoffer, og melatonin kunne redusere nyresår forårsaket av pristane. Pristane er en peritoneal irriterende. Det er velkjent At IgM-klassen produseres Av b1 (CD5+) b-celle-undergruppen, Og b1-undergruppen er sterkt beriket i bukhulen og utvides I BALB / c-mus , noe som øker muligheten For At IgM anti-ssDNA og Antihistonantistoffer indusert av i.p. pristan er avledet fra undergruppen . Tidligere studier rapporterte at melatonin hadde effekter på den første antistoffimmunresponsen (IgM, IgG) . Noen studier indikerte at melatonin hadde toveis modulering på lymfocytter . Så vi trodde at melatonin kunne forbedre sle-symptomene ved å modulere overproduksjonen Av B-celler.

Cytokiner nettverk spiller en viktig rolle i utviklingen AV SLE. I noen in vitro-eksperimenter kan melatonin hemme immuneffektene av noen cytokiner og T-lymfocytter . Så vi observert effekten av melatonin på forstyrrelsen av cytokiner-nettverket. IL-6 antas som et inflammatorisk cytokin som utskilles av en rekke vevsceller, inkludert makrofager og Th2-celler. IL – 6 nivå har positiv korrelasjon til aktivitetsindeksen FOR SLE. Våre resultater viste at NIVÅET AV IL-6 ble økt etter pristane injeksjon, mens melatonin kunne redusere IL – 6 produksjon. Det økende NIVÅET AV IL-6 kan føre Til At b-celler hemmeligholder flere antistoffer og fremmer utviklingen av nephritis . Så nedreguleringen AV IL – 6-produksjonen av melatonin er nyttig for å hemme antistoffproduksjonen og nyresår.

IL-2 utskilles Av Th1-celler, OG IL-13 utskilles Av Th2-celler. Det er noen motstridende resultater i dokumentene om endringene AV IL-2 OG IL-13. Så i denne pristane-induserte sle-modellen undersøkte vi nivåene av de to cytokinene. Våre resultater viste at NIVÅET AV IL-2 i pristane-injiserte mus var lavere enn i normale mus, mens NIVÅET AV IL-13 i pristane-injiserte mus var høyere enn i normale mus. Vi fant også at melatonin kunne redusere IL-13-produksjonen, men økte IL-2-produksjonen. Mange rapporter viste at NIVÅET AV IL-2 gikk ned i SLE, spesielt i det aktive stadiet, OG AT IL-2 kunne nedregulere b-lymfocyttaktiveringen . Noen undersøkelser viste at melatonin kunne regulere NIVÅET AV IL-2 / IL-2 reseptorer , som kan være mekanismen for den hemmende virkningen av melatonin på IL-2-produksjon. IL-13, en av de viktigste cytokinene i lupus, ble antatt å være En b-celle aktiverende faktor som resulterte i overdreven produksjon av mange autoantistoffer . IL-13 har forhold til nyresår av SLE . Så nedreguleringen AV IL – 13-produksjonen av melatonin er også nyttig for å hemme antistoffproduksjonen og nyresår.

det avtagende nivået Av th1-type cytokin og de økende nivåene Av th2-type cytokin indikerte også at Det var et skifte Fra Th1 Mot Th2 i uberørt indusert lupus. Noen rapporter viste at eksogen melatonin kunne aktivere T-cellene og betydelig fremme th1-type cytokiner, som deltar i regulering av immunforstyrrelsene . Våre resultater viste at melatonin kunne oppregulere th1-type cytokiner og nedregulere Th2-type cytokiner. Og det indikerte melatonin kunne modulere forstyrrelsen av cytokinnettverk i sle-musene ved å regulere ubalansen I Th1 / Th2.

Prednison , som er et vanlig stoff for SLE, ble servert som det positive stoffet i denne studien. Vi fant at prednison hadde en regulatorisk effekt på pristanindusert SLE. Sammenlignet med prednison hadde melatonin en lignende eller litt tidligere effekt på sle-symptomene. Som vi har kjent, er bivirkningene av prednison mer vanlige og alvorlige enn melatonin. Dermed trodde vi melatonin kan være et potensielt stoff for SLE.

avslutningsvis viser pristanindusert lupus forstyrrelser i immunsystemet, slik som høyt nivå av autoantistoffer og ubalanse av cytokinnettverk, som induserer fulgt nefritt. Endringene er lik den menneskelige lupus, og pristane er vanlig i miljøet; dermed er denne modellen hensiktsmessig å studere effekten av melatonin på miljørelatert SLE. På den annen side viste vi også at administrasjonen av melatonin hemmet endringene i pristane-indusert lupus. Og det foreslo melatonin hadde en gunstig effekt på miljørelatert lupus. Mekanismene kan innebære sin modulering av forstyrrelser i immunsystemet, spesielt i cytokiner nettverk. Imidlertid bør videre studier være nødvendige for en bedre forståelse av reguleringsprosessen og nøkkelfaktoren for virkningen på autoimmune sykdommer.