regulacyjny wpływ melatoniny na zaburzenia cytokin u myszy tocznia indukowanego Pristanem

Streszczenie

toczeń rumieniowaty układowy (SLE) rozwija się w związku z wieloma czynnikami środowiskowymi. Naszym zdaniem ważniejsze jest zbadanie wpływu melatoniny na SLE związane ze środowiskiem. W niniejszym badaniu do indukcji SLE u samic myszy BALB / c użyto 0,5 ml preparatu pristane. Melatoninę (0,01; 0,1; 1,0 mg/kg mc.) podawano doustnie bezpośrednio po wstrzyknięciu produktu pristane przez 24 tygodnie. Po 0, 1, 2, 4, 8 tygodniach iniekcji pristane wykryto przeciwciała przeciw ssDNA IgM i histonów. Poziomy IL-2, IL-6 i IL-13 wykryto po 24 tygodniach. Obserwowano również zmiany w nerkach. Wyniki wykazały, że melatonina antagonizowała rosnące poziomy przeciwciał IgM anty ssDNA i autoprzeciwciał histonowych. Melatonina może również zmniejszać produkcję IL – 6 i IL-13 oraz zwiększać produkcję IL-2. Poza tym melatonina może zmniejszyć zmiany w nerkach spowodowane przez Pristan. Wyniki te sugerują, że melatonina ma korzystny wpływ na toczeń wywołany pristanem poprzez regulację zaburzeń cytokin.

1. Wprowadzenie

toczeń rumieniowaty układowy (SLE lub toczeń) jest chorobą autoimmunologiczną, która może atakować prawidłową tkankę i komórki organizmu, powodując zapalenie i uszkodzenie tkanek . SLE występuje w każdym wieku i każdej płci. Jednak kobiety są bardziej narażone na SLE niż mężczyźni . Poza tym odnotowano również zaburzenia w sieci cytokin w SLE, w tym IL-1, IL-2,IL-6, IL-13 i IFN -. Cytokiny te mają ścisły związek z rozwojem SLE, takich jak wytwarzanie autoprzeciwciał i immuno-złożone zapalenie nerek. Ale istnieją pewne sprzeczne wyniki dotyczące zmian niektórych cytokin w różnych raportach.

w ostatnich latach coraz więcej uwagi poświęcono czynnikom środowiskowym, które mogą być zaangażowane w patogenezę SLE . Choroby autoimmunologiczne stają się coraz bardziej powszechne w krajach uprzemysłowionych, a na choroby te mogą mieć wpływ czynniki środowiskowe . Pristane jest prawdopodobnym kandydatem jako środowiskowy WYZWALACZ SLE w podatnej populacji. Eksperymenty na zwierzętach wykazały, że pristane może wywoływać objawy autoimmunologiczne podobne do tocznia u szczepu myszy (BALB / c), takie jak wysoki poziom autoprzeciwciał i złożone immunologicznie kłębuszkowe zapalenie nerek . Niektóre badania epidemiologiczne wykazały również, że wszystkie osoby z pristanem we krwi miały wyraźne choroby autoimmunologiczne lub objawy choroby autoimmunologicznej . Ponadto, Pristan znaleźć w oleju mineralnym, olej z rekina, i wiele żywności wydaje się być możliwe narażenie środowiska, które mogą powodować SLE. Więc może to być bardziej odpowiednie do badania czynników środowiskowych zaangażowanych w SLE za pomocą pristane wywołane SLE-jak mysi model.

Melatonina jest syntetyzowana i wydzielana głównie przez szyszynkę, która może wytwarzać specyficzne receptory w ośrodkowym układzie nerwowym i poza nim. Melatonina nie tylko może bezpośrednio wpływać na stan zapalny i komórki odpornościowe, ale także ma na nią pośredni wpływ poprzez talamencefalon . Co ważniejsze, melatonina jest uważana za ważną substancję czynną w układzie neuro-immunologiczno-endokrynologicznym . Jest w stanie regulować nierównowagę sieci cytokin w niektórych chorobach autoimmunologicznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów i adiuwantowe zapalenie stawów . Niektóre eksperymenty badały jego wpływ na myszy MRL-lpr / LPR i wykazały, że melatonina była korzystna dla spontanicznego SLE u samic myszy . Ponieważ środowisko jest ważnym czynnikiem w SLE we współczesnym społeczeństwie, byliśmy bardziej zainteresowani wpływem melatoniny na SLE związane ze środowiskiem.

aby zbadać rolę melatoniny w SLE, zwłaszcza w toczniu związanym ze środowiskiem, zastosowano myszy indukowane pristanem. Określono również wpływ melatoniny na zaburzenia cytokin i następujące zmiany w modelu SLE indukowanym przez Pristan.

2. Materiały i metody

2.1. Zwierzęta

Sześćdziesiąt samic myszy BALB / c w wieku dwóch miesięcy (g) zostało dostarczonych przez Experimental Animal Center Uniwersytetu Medycznego w Anhui. Wszystkie protokoły eksperymentalne opisane w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. oceny etycznej eksperymentów na zwierzętach Instytutu Farmakologii Klinicznej Anhui Medical University.

2.2. Materiały

Melatonina została zakupiona od Sigmy. Pristan, denaturowane termicznie DNA grasicy cielęcej (ssDNA), Histon grasicy całkowitej (Histon), konkanawalina A (ConA) i lipopolisacharydy (LPS) również pochodzą z Sigma. Zakupiono przeciwciała IgM sprzężone z biotyną z królików i myszy oraz awidynę znakowaną peroksydazą chrzanową . Zestawy Elisa interleukin-2 myszy i zestawy ELISA interleukin-6 zostały zakupione od ADL. Mysi interleukin-13 zestawów ELISA zakupiono od firmy BIOO.

2.3. Protokoły eksperymentalne

Sześćdziesiąt samic myszy BALB/c podzielono losowo na sześć grup: normalną grupę kontrolną, grupę modelową, grupę leczoną prednizonem, która służyła jako pozytywna grupa kontrolna, oraz grupy leczone melatoniną (0,01; 0,1; 1,0 mg/kg), w tym grupę melatoniną pierwszą (MT1), grupę melatoniną drugą (MT2) i grupę melatoniną trzecią (MT3). Myszy z prawidłowej grupy kontrolnej otrzymały wstrzyknięcie dootrzewnowe w dawce 0.5 ml soli fizjologicznej (ns), a pozostałym grupom podano wstrzyknięcie dootrzewnowe 0,5 ml produktu pristane. Myszy z prawidłowej grupy kontrolnej i modelowej grupy kontrolnej otrzymywały dożylne podawanie NS dziennie po pierwszym leczeniu. Myszom z pozytywnej grupy kontrolnej podawano do żołądka prednizon (Pre) w dawce 5 mg/kg mc.na dobę. Myszy z grupy MT1 były leczone wewnątrzgastrycznie melatoniną w dawce 0,01 mg/kg mc., melatoniną w MT2 w dawce 0,1 mg/kg mc., a melatoniną w MT3 w dawce 1,0 mg/kg mc. Surowice Pobrano z żyły ogonowej przed leczeniem (0) oraz 2, 4 i 8 tygodni po leczeniu w celu zmierzenia poziomu autoprzeciwciał. Dwadzieścia cztery tygodnie po podaniu produktu pristane wszystkie myszy zabito, a śledziony usunięto w celu wykrycia immunologicznego; w międzyczasie tkanki nefryczne zbadano za pomocą mikroskopu świetlnego.

2.4. Enzymatyczne testy Immunosorbentów (Elisa) dla przeciwciał anty-ssDNA i histonów

przeciwciała anty-ssDNA i histonów IgM zostały wykryte techniką ELISA podobną do tej opisanej w . 96-studzienkowe płytki ELISA pokryte antygenami ssDNA lub histonowymi o stężeniu 10 mg/l inkubowano przez noc w 4. Następnego dnia talerze zostały umyte PBS-Tween. Płytki inkubowano z buforem blokującym (PBS-2% albuminy surowicy bydlęcej) przez noc w temperaturze 4 i przemyto PBS-Tween. Po inkubacji przez noc w temperaturze 4 z surowicą mysią rozcieńczoną do 1 : 250, płytki przemyto ponownie, a następnie inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 4 z przeciwciałami antymouse IgM sprzężonymi z biotyną-królik rozcieńczonymi do 1 : 200. Następnie płytki przemyto i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 4 z awidyną znakowaną peroksydazą chrzanową w rozcieńczeniu 1: 200. Płytki następnie przemyto ponownie i 100 L substratu —tetrametylobenzydyny (TMB) i roztworu nadtlenku wodoru dodano do studzienek przez 30 minut w 37. Reakcję zakończono przez dodanie 50 L 2 m H2SO4 na studzienkę. Intensywność koloru żółtego odczytano przy 490 nm w czytniku mikropłytkowym. Surowice pozostałych Ośmiu prawidłowych myszy BALB / c zostały pobrane i wykryte w tym samym czasie, a średnią gęstość i SD obliczono jako kontrolę. Średnie wskaźniki enzymów (EI) próbek w różnych grupach obliczono jako:

2.5. Hodowla komórek śledziony i indukcja cytokin

Hodowla komórek śledziony i indukcja cytokin były modyfikacjami metod opisanych w . Krótko mówiąc, jednokomórkowe zawiesiny przygotowano z śledziony aseptycznie usuwanych z myszy i hodowano w 24-studzienkowych płytkach do hodowli w końcowym stężeniu komórek/ml. Komórki hodowano w RPMI-1640 z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej, 2 mM glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 50 m 2-merkaptoetanolu oraz 10 ml penicyliny, streptomycyny i roztworu przeciwgrzybiczego/L (Sigma). Kultury stymulowano 3 mg / L ConA, 12 mg/l LPS lub samym pożywką i inkubowano w temperaturze 37 w nawilżonym powietrzu z 5% CO2. Supernatant zebrano w 48 h i zakonserwowano w 20 do testów cytokin.

2.6. Testy cytokin

stężenia interleukiny-2 (IL-2), interleukiny-6 (IL-6) i interleukiny-13 (IL-13) w supernatancie oznaczono za pomocą odpowiednich komercyjnych Elisa dla mysich postaci tych cytokin. Intensywność każdej próbki odczytano przy 450 nm w spektrofotometrze mikropłytkowym.

2.7. Techniki histopatologiczne

nerki zebrane podczas ofiarowania myszy były utrwalane przez 24 godziny w neutralnej buforowanej formalinie przed osadzeniem parafiny. Sekcje zabarwiono hematoksyliną i eozyną oraz Metenaminą Jones silver, a następnie zbadano pod mikroskopem świetlnym pod kątem ciężkości zmiany nerek. Obserwowano kłębuszkowe zapalenie nerek, zmiany w kanalikach nerkowych i zapalenie śródmiąższowe, a stopień nasilenia zmian histologicznych charakterystycznych dla toczniowego zapalenia nerek oceniano jako nieobecny (), łagodny (), umiarkowany () i ciężki ().

2.8. Wyniki analizy statystycznej

wyrażono jako SD. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą dwukierunkowego testu t Studenta z minimalnym poziomem istotności

3. Wyniki

3.1. Wpływ melatoniny na poziomy przeciwciał IgM anty-ssDNA i histonów w surowicach

poziomy przeciwciał IgM anty-ssDNA i histonów były znacząco różne między grupami otrzymującymi pristane i melatoninę (Fig.1(A) i 1(B)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Rysunek 1

surowice myszy z każdej grupy pobrano przed leczeniem (0), 2, 4 i 8 tygodni później, a poziomy przeciwciał IgM anty-ssDNA i Przeciwhistonów wykryto metodą ELISA. EI obliczono według wzoru. a) poziom przeciwciał anty-ssDNA IgM w każdej grupie, b) poziom przeciwciał Antyhistonowych IgM w każdej grupie. Dane podano w średniej ± SD(N = 6-8). P*<05, P * * <01 kontra surowice przy 0 wk, ∆P<.05,∆∆P<.01 w porównaniu z surowicami u myszy kontrolujących model.

dwa tygodnie po pojedynczym wstrzyknięciu dootrzewnowym produktu pristane poziom przeciwciał anty-ssDNA IgM w surowicach zaczął oczywiście rosnąć, osiągnął szczyt w 4 wk, następnie zaczął spadać i ostatecznie powrócił do normy w 8 wk. W grupie MT1 poziom przeciwciał anty-ssDNA IgM w surowicach również wzrósł i osiągnął szczyt przy 4 wk, ale następnie zmniejszył się bardziej wyraźnie w porównaniu do grupy kontrolnej modelu (). W grupie MT2 poziom przeciwciał anty-ssDNA IgM w surowicach wzrósł w ciągu pierwszych czterech tygodni, ale znacznie niższy niż w grupie modelowej () i pozostał Normalny w innych okresach. W grupie MT3 poziom przeciwciał anty-ssDNA IgM nie wzrósł (Fig.1(A)).

przeciwciała Przeciwhistonowe w surowicach zwiększyły się o 1 wk po wstrzyknięciu, osiągnęły szczyt po 4 wk, następnie stopniowo zmniejszały się i wróciły do normy po 8 wk. W grupie MT1 poziomy przeciwciał Przeciwhistonowych w surowicach były znacząco niższe niż w grupie kontrolnej modelu () i wróciły do normy po 4 wk. W grupach MT2 i MT3 poziom przeciwciał wzrósł w ciągu pierwszych czterech tygodni, ale był znacznie niższy niż w grupie modelowej () i pozostał prawidłowy w pozostałych okresach (Fig.1(b)).

3.2. Wpływ melatoniny na produkcję cytokin

aby uzyskać lepszy wgląd w wpływ melatoniny na cytokiny w SLE, oznaczano wytwarzanie cytokin typu Th1 i th2 przez splenocyty stymulowane ConA lub LPS podczas przebiegu tocznia mysi. Wyniki wykazały, że wytwarzanie IL-2, IL-6 i IL-13 zmieniło się u myszy SLE indukowanych pristanem (fig.2). Produkcja IL-2 splenocytów od myszy w grupie kontrolnej modelu była niższa niż od normalnych myszy (), podczas gdy produkcja IL-6 i IL-13 splenocytów od myszy w grupie kontrolnej modelu była wyższa niż od normalnych myszy (). W grupach MT2 i MT3 poziomy IL-2 osiągnęły normalny poziom i były wyższe niż u myszy modelowych (), podczas gdy poziomy IL-6 i IL-13 były niższe niż u myszy modelowych (,) (fig.2).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Rysunek 2

wszystkie myszy uśmiercano pod koniec 24 tygodnia, a limfocyty śledziony wysiewano w ilości 1×106 komórek/studzienkę. Stężenia IL-2 w limfocytach śledziony były stymulowane przez 48 godzin 3 mg/L ConA. Stężenia IL-6 i IL-13 w limfocytach śledziony były stymulowane przez 48 godzin za pomocą 12 mg/L LPS. Stężenia IL-2, IL-6 i IL-13 w supernatantach hodowli wykryto metodą ELISA. Dane podano w średniej± SD (N = 4-5). P * * <01, P * <.05 w porównaniu z normalną grupą kontrolną, ∆p<.05, ∆∆P<.01 kontra grupa kontrolna modelu.

3.3. Wpływ melatoniny na zmiany histopatologiczne nerek

zmiany histopatologiczne nerek u myszy przedstawiono w tabeli 1 i na rycinie 3.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Rysunek 3

nerki pobrane w czasie składania ofiary zostały zabarwione H& e do badania histologicznego. a) normalna grupa kontrolna (HE×200). b) grupa kontrolna modelu (HE×200). c) grupa kontrolna modelu (HE×400). d) grupa MT (HE×200).

jak pokazano na fig. 3(a), nieprawidłowości nerek nie obserwowano u zdrowych myszy. Objętość i liczba komórek kłębuszków w normie. Kłębuszkowa ściana kapilarna była cienka. W kanalikach nie zaobserwowano odlewu białkowego. W śródmiąższu nerek nie obserwowano nacieku limfocytów i proliferacji fibroblastów.

jak pokazano na fig. Niektóre kłębuszki wykazywały zanik kłębuszków z poszerzeniem naczyń włosowatych i pogrubieniem ścian naczyń włosowatych. Niektóre cytaty ujawniły powstawanie skrzeplin. Obserwowano również poszerzenie mezangialne i zwiększenie warstw komórkowych. Ściana kapsułki kłębuszkowej była gruba,a przestrzeń między ścianą kapsułki a komórkami śródbłonka zniknęła w poważnie dotkniętych kłębuszkach. Niektóre kanaliki nerkowe wykazały rozszerzenie i proliferację komórek nabłonkowych. Odlewy białkowe obserwowano w kanalikach. W śródmiąższu nerek obserwowano naciek komórek zapalnych, takich jak monocyty, limfocyty i plazmacyty z ogniskową agregacją. Obserwowano również proliferacje fibroblastów śródmiąższowych.

u myszy leczonych melatoniną zaobserwowano pewną poprawę w różnym stopniu (rycina 3(d) I Tabela 1). Zanik kłębuszków i pogrubienie ścian naczyń włosowatych uległo zmianie w stopniu łagodnym lub umiarkowanym. Poprawiono również poszerzenie mezangialne. Przestrzeń między ścianą kapsułki a komórkami śródbłonka była mniejsza niż u normalnych myszy, ale zaobserwowano poprawę w porównaniu z grupą modelową nieleczoną. Obserwowano również nieznaczne nacieki limfocytów. Niektóre kanaliki nerkowe wykazały łagodne rozszerzenie i kilka odlewów białkowych. Niemniej jednak wszystkie zmiany były mniej dotkliwe niż u myszy modelowych.

4. Dyskusja

w tym badaniu zaobserwowano zaburzenia immunologiczne u myszy z pristanem i działanie melatoniny. Ponieważ przeciwciała anty-DNA i histonów były wrażliwe w SLE, zbadaliśmy zmiany przeciwciał anty-ssDNA i Antyhistonów IgM i znaleźliśmy wysokie poziomy autoprzeciwciał u myszy wstrzykniętych pristanem. Zmiany w nerkach stwierdzono również u myszy. Wyniki te były zgodne z poprzednimi raportami. Odkryliśmy również, że melatonina antagonizuje rosnące poziomy przeciwciał anty-ssDNA IgM i histonów, a melatonina może zmniejszyć zmiany w nerkach spowodowane przez pristane. Pristane Działa drażniąco na otrzewną. Powszechnie wiadomo, że Klasa IgM jest wytwarzana przez podzbiór komórek B1 (CD5+), a podzbiór B1 jest wysoce wzbogacony w jamie otrzewnej i jest rozszerzany u myszy BALB/c , zwiększając możliwość, że przeciwciała IgM anty-ssDNA i Przeciwhistonowe indukowane przez IP pristane pochodzą z podgrupy. Wcześniejsze badania donosiły, że melatonina miała wpływ na pierwszą odpowiedź immunologiczną przeciwciała (IgM, IgG). Niektóre badania wykazały, że melatonina miała dwukierunkową modulację na limfocyty . Pomyśleliśmy więc, że melatonina może poprawić objawy SLE poprzez modulowanie nadprodukcji komórek B.

sieć cytokin odgrywa ważną rolę w rozwoju SLE. W niektórych doświadczeniach in vitro melatonina może hamować działanie immunologiczne niektórych cytokin i limfocytów T. Obserwowaliśmy więc wpływ melatoniny na zaburzenia sieci cytokin. Uważa się, że IL-6 jest cytokiną zapalną, która jest wydzielana przez różne komórki tkanki, w tym makrofagi i komórki Th2. Poziom IL-6 ma dodatnią korelację ze wskaźnikiem aktywności SLE. Nasze wyniki wykazały, że poziom IL-6 został zwiększony po wstrzyknięciu pristane, podczas gdy melatonina może zmniejszyć produkcję IL-6. Rosnący poziom IL-6 może spowodować, że komórki B wydzielają więcej przeciwciał i sprzyjają rozwojowi zapalenia nerek . Tak więc zmniejszenie produkcji IL-6 przez melatoninę jest pomocne w hamowaniu produkcji przeciwciał i zmian w nerkach.

IL-2 jest wydzielana przez komórki Th1, a IL-13 jest wydzielana przez komórki Th2. Istnieją pewne sprzeczne wyniki w dokumentach dotyczących zmian IL – 2 i IL-13. W tym modelu SLE indukowanym przez Pristan, zbadaliśmy poziomy dwóch cytokin. Nasze wyniki wykazały, że poziom IL-2 u myszy wstrzykniętych pristanem był niższy niż u normalnych myszy, podczas gdy poziom IL-13 u myszy wstrzykniętych pristanem był wyższy niż u normalnych myszy. Odkryliśmy również, że melatonina może zmniejszyć produkcję IL-13, ale zwiększyć produkcję IL-2. Wiele doniesień wykazało, że poziom IL-2 zmniejszył się w SLE, zwłaszcza w fazie aktywnej, i że IL-2 może regulować aktywację limfocytów B. Niektóre badania wykazały, że melatonina może regulować poziom receptorów IL-2 / IL-2 , co może być mechanizmem hamującego działania melatoniny na produkcję IL-2. IL-13, jedna z najważniejszych cytokin w toczniu, uważano za czynnik aktywujący komórki B, co spowodowało nadmierną produkcję wielu autoprzeciwciał . IL-13 ma związek z uszkodzeniami nerek SLE . Tak więc zmniejszenie produkcji IL – 13 przez melatoninę jest również pomocne w hamowaniu produkcji przeciwciał i zmian w nerkach.

zmniejszający się poziom cytokiny typu Th1 i zwiększający się poziom cytokiny typu Th2 wskazywały również na zmianę z Th1 w kierunku Th2 w toczniu indukowanym nieskazitelnie. Niektóre doniesienia wykazały, że egzogenna melatonina może aktywować komórki T i znacząco promować cytokiny typu Th1, które uczestniczą w regulacji zaburzeń immunologicznych . Nasze wyniki wykazały, że melatonina może regulować cytokiny typu Th1 i obniżać cytokiny typu Th2. I to wskazywało, że melatonina może modulować zaburzenia sieci cytokin u myszy SLE poprzez regulację równowagi Th1 / Th2.

prednizon, który jest powszechnym lekiem na SLE, służył jako pozytywny lek w tym badaniu. Odkryliśmy, że prednizon miał regulacyjny wpływ na SLE wywołane pristanem. W porównaniu do prednizonu, Melatonina miała podobny lub trochę wcześniej wpływ na objawy SLE. Jak wiemy, działania niepożądane prednizonu są bardziej powszechne i poważne niż Melatonina. Tak więc myśleliśmy, że melatonina może być potencjalnym lekiem na SLE.

podsumowując, toczeń wywołany pristanem wykazuje zaburzenia układu odpornościowego, takie jak wysoki poziom autoprzeciwciał i nierównowaga sieci cytokin, co indukuje następujące zapalenie nerek. Zmiany są podobne do tocznia ludzkiego, a Pristan jest powszechny w środowisku; dlatego ten model jest odpowiedni do badania wpływu melatoniny na SLE związane ze środowiskiem. Z drugiej strony wykazaliśmy również, że podawanie melatoniny hamowało zmiany w toczniu wywołanym pristanem. To sugeruje, że melatonina ma korzystny wpływ na toczeń związany ze środowiskiem. Mechanizmy te mogą obejmować modulację zaburzeń w układzie odpornościowym, zwłaszcza w sieci cytokin. Jednak dalsze badania powinny być konieczne dla lepszego zrozumienia procesu regulacji i kluczowego czynnika jego działania na choroby autoimmunologiczne.