efectul de reglementare al melatoninei asupra tulburărilor citokinelor la șoarecii Lupus induși de Pristane

rezumat

lupusul eritematos sistemic (les) se dezvoltă în raport cu mulți factori de mediu. În opinia noastră, este mai important să investigăm efectul melatoninei asupra LES legate de mediu. În studiul de față, 0,5 ml pristane au fost utilizate pentru a induce Les la femelele de șoarece BALB/C. Melatonina (0, 01, 0, 1, 1, 0 mg/kg) a fost administrată oral imediat după injectarea pristane timp de 24 de săptămâni. Anticorpii IgM anti ssDNA și histone au fost detectați după 0, 1, 2, 4, 8 săptămâni de injecție pristane. Nivelurile de IL-2, IL-6 și IL-13 au fost detectate după 24 de săptămâni. Au fost observate și leziuni renale. Rezultatele au arătat că melatonina a antagonizat nivelurile crescânde de IgM anti ssDNA și autoanticorpi histonici. Melatonina ar putea, de asemenea, să scadă producția de IL-6 și IL-13 și să crească producția de IL-2. În plus, melatonina ar putea diminua leziunile renale cauzate de pristane. Aceste rezultate au sugerat că melatonina are un efect benefic asupra lupusului indus de pristane prin reglarea tulburărilor citokinelor.

1. Introducere

lupusul eritematos sistemic (les sau Lupus) este o boală autoimună care poate ataca țesutul și celulele normale ale organismului, ducând la inflamații și leziuni tisulare . SLE apare la orice vârstă și la orice sex. Cu toate acestea, femeile sunt mai susceptibile de a avea les decât bărbații . În plus , perturbarea rețelei de citokine a fost raportată și în SLE, inclusiv IL-1, IL-2, IL-6, IL-13 și IFN-. Aceste citokine au relații strânse cu dezvoltarea les, cum ar fi producția de autoanticorpi și nefrita complexă imună. Dar există unele rezultate contradictorii cu privire la modificările unor citokine în diferite rapoarte.

în ultimii ani, s-a acordat din ce în ce mai multă atenție factorilor de mediu care pot fi implicați în patogeneza les . Bolile autoimune devin din ce în ce mai frecvente în țările industrializate, iar aceste boli pot fi influențate de factorii de mediu . Pristane este un candidat probabil ca factor declanșator al Les în rândul populației sensibile. Experimentele pe animale au arătat că pristane ar putea induce simptome de boală autoimună asemănătoare lupusului la o tulpină de șoareci (BALB/c), cum ar fi niveluri ridicate de autoanticorpi și glomerulonefrită complexă imună . Unele investigații epidemiologice au demonstrat, de asemenea, că toate persoanele cu pristane în sânge aveau boli autoimune distincte sau simptome de boală autoimună . În plus, pristanul găsit în uleiul mineral, uleiul de rechin și multe alimente pare a fi o posibilă expunere la mediu care poate declanșa les. Deci, ar putea fi mai adecvat să se cerceteze factorii de mediu implicați în Les prin utilizarea modelului murin de tip SLE indus de pristane.

melatonina este sintetizată și secretată în principal de glanda pineală care poate produce receptori specifici în și din sistemul nervos central. Melatonina nu numai că poate afecta direct inflamația și celulele imune, dar are și influențe indirecte asupra acesteia prin talamencefal . Mai important, melatonina este considerată o substanță activă importantă în sistemul neuro-imunitar-endocrin . Este capabil să regleze dezechilibrul rețelei de citokine în unele boli autoimune, cum ar fi artrita reumatoidă și artrita adjuvantă . Unele experimente au investigat efectele sale asupra șoarecilor MRL-lpr/LPR și au arătat că melatonina a fost benefică pentru Les spontan la șoarecii de sex feminin . Deoarece mediul este un factor important în Les în societatea modernă, am fost mai interesați de efectele melatoninei asupra LES legate de mediu.

pentru a investiga rolul melatoninei în Les, în special în lupusul legat de mediu, s-au folosit șoareci induși de pristane. De asemenea, au fost determinate efectele melatoninei asupra tulburărilor citokinelor și următoarele modificări ale modelului les indus de pristane.

2. Materiale și metode

2.1. Animale

șaizeci de șoareci balb/c femele în vârstă de două luni ( g) au fost furnizate de centrul experimental pentru animale al Universității Medicale Anhui. Toate protocoalele experimentale descrise în acest studiu au fost aprobate de Comitetul de revizuire etică pentru experimentarea pe animale al Institutului de Farmacologie Clinică, Universitatea Medicală Anhui.

2.2. Materiale

melatonina a fost achiziționată de la Sigma. Pristanul, ADN-ul timusului de vițel denaturat termic (ssDNA), histona totală a timusului de vițel (histona), concanavalina A (ConA) și lipopolizaharidele (LPS) au fost, de asemenea, din Sigma. Au fost achiziționate anticorpi IgM de iepure anti-șoarece conjugați cu biotină și avidină marcată cu peroxidază de hrean . Kiturile ELISA pentru Mouse interleukin-2 și kiturile Elisa interleukin-6 au fost achiziționate de la ADL. Kiturile Mouse interleukin-13 ELISA au fost achiziționate de la BIOO.

2.3. Protocoale experimentale

șaizeci de șoareci femele BALB/c au fost împărțiți aleatoriu în șase grupuri: grupul de control normal, grupul model, grupul de tratament cu prednison care a servit ca grup de control pozitiv și grupurile de tratament cu melatonină (0,01, 0,1, 1,0 mg/kg), inclusiv grupul de melatonină unu (MT1), grupul de melatonină doi (MT2) și grupul de melatonină trei (MT3). Șoarecii din grupul de control normal au primit o injecție intraperitoneală de 0.5 ml soluție salină normală (NS), iar celorlalte grupuri li s-a administrat o injecție intraperitoneală de 0,5 ml pristane. Șoarecii din grupul de control normal și grupul de control model au primit administrare intragastrică de NS pe zi după primul tratament. Șoarecii din grupul de control pozitiv au primit administrare intragastrică de 5 mg/kg prednison (Pre) pe zi. Șoarecii din grupul MT1 au fost tratați intragastric cu 0,01 mg/kg melatonină, MT2 0,1 mg/kg melatonină și MT3 1,0 mg/kg melatonină. Serurile au fost colectate din vena cozii înainte de tratament (0) și 2, 4 și 8 săptămâni după tratament pentru a măsura nivelul de autoanticorpi. Douăzeci și patru de săptămâni după administrarea pristane, toți șoarecii au fost uciși, iar splinele au fost îndepărtate pentru detectări imunologice; între timp, țesuturile nefrice au fost examinate prin microscopie ușoară.

2.4. Testele imunosorbente legate de enzime (ELISAs) pentru anticorpii anti-ssDNA și Histone

anticorpii Anti-ssDNA și histone IgM au fost detectați printr-o tehnică ELISA similară cu cea descrisă în . Plăcile ELISA cu 96 de puțuri acoperite cu 10 mg / l ssDNA sau antigene histonice au fost incubate peste noapte la 4. În ziua următoare, plăcile au fost spălate cu PBS-Tween. Plăcile au fost incubate cu tampon de blocare (PBS-2% albumină serică bovină) peste noapte la 4 și spălate cu PBS-Tween. După incubarea peste noapte la 4 cu ser murin diluat la 1 : 250, plăcile au fost spălate din nou și apoi incubate timp de 2 ore la 4 cu anticorpi antimouse IgM conjugați cu biotină-iepure diluați la 1: 200. Ulterior, plăcile au fost spălate și incubate timp de 2 ore la 4 cu avidină marcată cu peroxidază de hrean în diluție 1 : 200. Plăcile au fost apoi spălate din nou și 100 L de substrat —tetrametilbenzidină (TMB) și soluție de peroxid de hidrogen au fost adăugate în godeuri timp de 30 de minute la 37. Reacția a fost încheiată prin adăugarea a 50 L de 2 m H2SO4 pe godeu. Intensitatea culorii galbene a fost citită la 490 nm într-un cititor de microplăci. Serurile altor opt șoareci normali BALB/C au fost colectate și detectate în același timp, iar densitatea medie și SD au fost calculate pentru a servi drept control. Indicii enzimatici medii (EI) ai probelor din diferite grupuri au fost calculați ca:

2.5. Cultura de celule de splină și inducerea citokinelor

cultura de celule de splină și inducerea citokinelor au fost modificări ale metodelor descrise în . Pe scurt, suspensiile cu o singură celulă au fost preparate din spline îndepărtate aseptic de la șoareci și cultivate în plăci de cultură cu 24 de puțuri la o concentrație finală de celule/ml. Celulele au fost cultivate în RPMI-1640 suplimentat cu 10% ser de vițel fetal, 2 mm glutamină, 1 mM piruvat de sodiu, 50 m 2-mercaptoetanol și 10 ml penicilină, streptomicină și soluție antimicotică/l (Sigma). Culturile au fost stimulate cu 3 mg/l ConA, 12 mg/l LPS sau mediu singur și incubate la 37 În aer umidificat cu 5% CO2. Supernatantul a fost recoltat la 48 h și conservat la 20 pentru testele de citokine.

2.6. Teste de citokine

concentrațiile de interleukină-2 (IL-2), interleukină-6 (IL-6) și interleukină-13 (IL-13) în supernatant au fost determinate utilizând Elise comerciale adecvate pentru forma murină a acestor citokine. Intensitatea fiecărui eșantion a fost citită la 450 nm într-un spectrofotometru microplacă.

2.7. Tehnici histopatologice

rinichii colectați în timpul sacrificării șoarecilor au fost fixați timp de 24 de ore în formalină tamponată neutră înainte de încorporarea parafinei. Secțiunile au fost colorate cu hematoxilină și eozină și metenamină de argint Jones și apoi examinate la microscop cu lumină pentru severitatea leziunii renale. Glomerulonefrita, leziunile tubulare renale și inflamația interstițială au fost observate, iar gradul de severitate a leziunilor histologice caracteristice nefritei lupusului a fost evaluat ca absent (), ușor (), moderat () și sever ().

2.8. Analiza statistică

rezultatele au fost exprimate ca SD. Analiza statistică a fost efectuată utilizând testul T bidirecțional al elevului cu ca nivel minim de semnificație

3. Rezultate

3.1. Efectele melatoninei asupra nivelurilor de anticorpi IgM Anti-ssDNA și histone în seruri

nivelurile de anticorpi IgM anti-ssDNA și histone au fost semnificativ diferite între grupurile de tratament cu pristane-injecție și melatonină [, Figurile 1 (a) și 1(b)].

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 1

serurile șoarecilor din fiecare grup au fost colectate înainte de tratament (0), 2, 4 și 8 săptămâni mai târziu, iar nivelurile de anticorpi IgM anti-ssDNA și antihistaminice au fost detectate prin ELISA. EI a fost calculat conform formulei. (a) nivelul anticorpului IgM anti-ssDNA în fiecare grup, (b) nivelul anticorpului antihistaminic IgM în fiecare grup. Datele au fost prezentate în valori medii ale SD (n=6-8). P * <.05, P * * <.01 față de seruri la 0 wk, p<.05, inox p<.01 versus seruri la șoarecii de control model.

la două săptămâni după o singură injecție intraperitoneală de pristane, nivelul anticorpilor IgM anti-ssDNA din seruri a început să crească evident, a atins vârful la 4 wk, apoi a început să scadă și, în cele din urmă, a revenit la normal la 8 wk. În grupul MT1, nivelul anticorpilor IgM anti-ssDNA în seruri a crescut și a atins vârful la 4 wk, dar apoi a scăzut mai evident în comparație cu grupul de control model (). În grupul MT2, nivelul anticorpilor IgM anti-ssDNA în seruri a crescut în primele patru săptămâni, dar mult mai mic decât cel al grupului model () și a rămas normal în alte perioade. În grupul MT3, nivelul anticorpilor IgM anti-ssDNA nu a crescut (Figura 1(a)).

anticorpii antihistaminici din ser au crescut cu 1 wk după injectare, au atins valoarea maximă la 4 wk, apoi au scăzut treptat și au revenit la normal la 8 wk. În grupul MT1, nivelurile de anticorpi antihistaminici din ser au fost semnificativ mai mici decât cele ale grupului de control model () și au revenit la normal la 4 wk. În grupurile MT2 și MT3, nivelurile de anticorpi au crescut în primele patru săptămâni, dar mult mai mici decât grupul model () și au rămas normale în celelalte perioade (Figura 1(b)).

3.2. Efectele melatoninei asupra producției de citokine

pentru a obține o mai bună înțelegere a influenței melatoninei asupra citokinelor în Les, producția de citokine de tip Th1 și Th2 de către splenocite stimulate cu ConA sau LPS a fost testată în cursul lupusului murin. Rezultatele au arătat că producția de IL-2, IL-6 și IL-13 S-a modificat la șoarecii SLE induși de pristane (Figura 2). Producția de splenocite IL-2 de la șoarecii din grupul de control model a fost mai mică decât cea de la șoarecii normali (), în timp ce producția de splenocite IL-6 și IL-13 de la șoarecii din grupul de control model a fost mai mare decât cea de la șoarecii normali (). În grupurile MT2 și MT3, nivelurile IL-2 au fost până la nivelul normal și mai mari decât cele ale șoarecilor model evident (), în timp ce nivelurile IL-6 și IL-13 au fost mai mici decât cele ale șoarecilor model evident (, ) (Figura 2).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 2

toți șoarecii au fost sacrificați la sfârșitul celor 24 de săptămâni, iar limfocitele splenice au fost însămânțate la 1 106 celule/godeu. Concentrațiile de IL-2 în limfocitele splenice au fost stimulate timp de 48 ore cu 3 mg/l ConA. Concentrațiile de IL-6 și IL-13 în limfocitele splenice au fost stimulate timp de 48 de ore cu 12 mg/l LPS. Concentrațiile de IL-2, IL-6 și IL-13 în supernatanții de cultură au fost detectate prin ELISA. Datele au fost prezentate în valori medii ale SD (n=4-5). P * * <.01, P * <.05 față de lotul martor normal, p<.05, inox p<.01 versus grupul de control al modelului.

3.3. Efectele melatoninei asupra modificărilor histopatologice renale

modificările histopatologice renale ale șoarecilor sunt prezentate în tabelul 1 și Figura 3.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figura 3

rinichii colectați în momentul sacrificiului au fost colorați cu H&E pentru examinare histologică. (a) grupul de control Normal (HE 200). (b) modelul de grup de control (he 200). (c) modelul grupului de control (he 400). (d) grupul MT (he 200).

așa cum se arată în Figura 3(a), anomaliile renale nu au fost observate la șoarecii normali. Volumul și numărul de celule ale glomerulilor au fost normale. Peretele capilar Glomerular era subțire. Nici o distribuție de proteine nu a fost văzută în tubule. Infiltrarea limfocitelor și proliferarea fibroblastelor nu au fost observate în interstițiul renal.

așa cum se arată în figurile 3(b) și 3(c) și în tabelul 1, majoritatea șoarecilor injectați cu pristane au evidențiat anomalii renale variind de la modele ușoare până la severe. Unele glomeruli au prezentat atrofie glomerulară cu dilatarea capilarelor și îngroșarea pereților capilari. Unele cites au dezvăluit formarea trombilor. S-au observat, de asemenea, lărgirea mezangială și creșterea straturilor celulare. Peretele capsulei glomerulare a fost gros, iar spațiul dintre peretele capsulei și celulele endoteliale a dispărut în glomerul grav afectat. Unele tubule renale au prezentat dilatare și proliferarea celulelor epiteliale. Distribuții de proteine au fost observate în tubule. O infiltrare a celulelor inflamatorii, cum ar fi monocitele, limfocitele și plasmacitele cu agregare focală a fost observată în interstițiul renal. De asemenea, au fost observate proliferări ale fibroblastelor interstițiale.

au existat unele îmbunătățiri de grade diferite la șoarecii tratați cu melatonină (Figura 3(d) și Tabelul 1). Atrofia glomerulară și îngroșarea pereților capilari au fost modificate într-un grad ușor sau moderat. Extinderea mezangială a fost, de asemenea, îmbunătățită. Spațiul dintre peretele capsulei și celulele endoteliale a fost mai mic decât cel al șoarecilor normali, dar a existat o îmbunătățire în comparație cu grupul model netratat. De asemenea, a fost observată infiltrarea ușoară a limfocitelor. Unele tubule renale au prezentat o dilatare ușoară și câteva distribuții de proteine. Cu toate acestea, toate modificările au fost mai puțin severe decât cele ale șoarecilor model.

4. Discuție

în acest studiu au fost observate tulburările imune ale șoarecilor amorsați cu pristane și efectele melatoninei. Deoarece anticorpii anti-ADN și histone au fost sensibili în Les , am investigat modificările anticorpilor anti-ssDNA IgM și antihistaminice și am găsit niveluri ridicate de autoanticorpi la șoarecii injectați cu pristane. Leziunile renale au fost, de asemenea, găsite la șoareci. Aceste rezultate au fost în concordanță cu rapoartele anterioare. De asemenea, am constatat că melatonina a antagonizat nivelurile crescânde de IgM anti-ssDNA și autoanticorpi histonici, iar melatonina ar putea diminua leziunile renale cauzate de pristane. Pristane este un iritant peritoneal. Este bine cunoscut faptul că clasa IgM este produsă de subsetul de celule B1 (CD5+), iar subsetul B1 este foarte îmbogățit în cavitatea peritoneală și este extins la șoarecii BALB/c, crescând posibilitatea ca anticorpii IgM anti-ssDNA și antihistaminici induși de i.p. pristane să fie derivați din subset . Studiile anterioare au raportat că melatonina a avut efecte asupra primului răspuns imun anticorp (IgM, IgG) . Unele studii au indicat că melatonina a avut modulare bidirecțională asupra limfocitelor . Așa că am crezut că melatonina ar putea îmbunătăți simptomele les prin modularea supraproducției celulelor B.

rețeaua de citokine joacă un rol important în dezvoltarea les. În unele experimente in vitro, melatonina ar putea inhiba efectele imune ale unor citokine și limfocite T. Așa că am observat efectele melatoninei asupra perturbării rețelei de citokine. IL – 6 este considerat ca o citokină inflamatorie care este secretată de o varietate de celule tisulare, inclusiv macrofage și celule Th2. Nivelul IL-6 are o corelație pozitivă cu indicele de activitate al les. Rezultatele noastre au arătat că nivelul de IL-6 a fost crescut după injectarea pristane, în timp ce melatonina ar putea scădea producția de IL-6. Creșterea nivelului de IL – 6 ar putea determina celulele B să secrete mai mulți anticorpi și să promoveze dezvoltarea nefritei . Deci, reglarea descendentă a producției de IL-6 de către melatonină este utilă în inhibarea producției de anticorpi și a leziunilor renale.

IL-2 este secretat de celulele Th1, iar IL-13 este secretat de celulele Th2. Există unele rezultate contradictorii în documentele privind modificările IL-2 și IL-13. Deci, în acest model les indus de pristane, am investigat nivelurile celor două citokine. Rezultatele noastre au arătat că nivelul de IL-2 la șoarecii injectați cu pristane a fost mai mic decât cel la șoarecii normali, în timp ce nivelul de IL-13 la șoarecii injectați cu pristane a fost mai mare decât cel la șoarecii normali. De asemenea, am constatat că melatonina ar putea scădea producția de IL-13, dar a crescut producția de IL-2. Multe rapoarte au arătat că nivelul IL-2 a scăzut în SLE, în special în stadiul activ, și că IL-2 ar putea regla în jos activarea limfocitelor B. Unele cercetări au arătat că melatonina ar putea regla nivelul receptorilor IL-2 / IL-2 , care poate fi mecanismul acțiunii inhibitoare a melatoninei asupra producției de IL-2. IL-13, una dintre cele mai importante citokine din lupus, a fost considerată a fi un factor de activare a celulelor B care a dus la producerea excesivă a multor autoanticorpi . IL-13 are legătură cu leziunile renale ale les . Deci, reglarea descendentă a producției de IL-13 de către melatonină este, de asemenea, utilă în inhibarea producției de anticorpi și a leziunilor renale.

scăderea nivelului de citokină de tip Th1 și creșterea nivelului de citokină de tip Th2 au indicat, de asemenea, că a existat o schimbare de la Th1 la Th2 în lupusul indus de curat. Unele rapoarte au arătat că melatonina exogenă ar putea activa celulele T și ar putea promova în mod semnificativ citokinele de tip Th1, care participă la reglarea tulburărilor imune . Rezultatele noastre au arătat că melatonina ar putea regla în sus citokinele de tip Th1 și ar putea regla în jos citokinele de tip Th2. Și asta a indicat că melatonina ar putea modula perturbarea rețelei de citokine la șoarecii SLE prin reglarea dezechilibrului Th1/Th2.

prednisonul, care este un medicament comun pentru LES , a fost servit ca medicament pozitiv în acest studiu. Am constatat că prednisonul a avut un efect de reglementare asupra LES indusă de pristane. Comparativ cu prednisonul, melatonina a avut un efect anterior similar sau puțin asupra simptomelor les. După cum am știut, reacțiile adverse ale prednisonului sunt mai frecvente și mai grave decât melatonina. Astfel, am crezut că melatonina poate fi un medicament potențial pentru Les.

în concluzie, lupusul indus de pristane prezintă tulburări ale sistemului imunitar, cum ar fi nivelul ridicat de autoanticorpi și dezechilibrul rețelei de citokine, care induce nefrita urmată. Modificările sunt similare cu lupusul uman, iar pristanul este comun în mediu; astfel, acest model este adecvat pentru a studia efectele melatoninei asupra LES legate de mediu. Pe de altă parte, am demonstrat, de asemenea, că administrarea melatoninei a inhibat modificările lupusului indus de pristane. Și asta a sugerat că melatonina a avut un efect benefic asupra lupusului legat de mediu. Mecanismele ar putea implica modularea tulburărilor sistemului imunitar, în special în rețeaua de citokine. Cu toate acestea, ar trebui să fie necesare studii suplimentare pentru o mai bună înțelegere a procesului de reglementare și a factorului cheie pentru acțiunea sa asupra bolilor autoimune.