Abstrakt
Hadí jedy jsou složité směsi proteinů z obou enzymů a nonenzymes, které jsou zodpovědné za produkci několik biologických účinků. Lidská envenomace hadím kousnutím, zejména těch z rodiny viperidů, vyvolává komplexní patofyziologický obraz charakterizovaný velkolepými změnami hemostázy a často je také vidět krvácení. Současné práce, zprávy schopnost šest z řady 1,2,3-triazolové deriváty, které inhibují některé farmakologické účinky způsobené jedy Bothrops jararaca a Lachesis muta. Testy In vitro ukázaly, že tyto sloučeniny byly narušeny způsobem závislým na koncentraci, fibrinogenem nebo plazmatickou srážlivostí, hemolýzou a proteolýzou produkovanou oběma jedy. Navíc tyto sloučeniny inhibovaly také biologické účinky in vivo. Myši ošetřené těmito sloučeninami byly plně chráněny před hemoragickými lézemi způsobenými takovými jedy. Ale, pouze B. aktivita vyvolávající edém jararaca byla neutralizována triazoly. Tak inhibiční účinek triazolů deriváty proti některé in vitro a in vivo biologické testy hadí jedy poukazuje na slibné aspekty, které mohou naznačovat jim, jako molekulární modely zlepšit výrobu účinný protijed nebo jako doplněk protijed neutralizace, zejména místní patologických jevů, které jsou částečně neutralizovány protijedů.
1. Úvod
Hadí jedy jsou složité směsi proteinů včetně enzymů (metaloproteinázy, serin proteinázy, phospholipases A2, a L-amino acid oxidase) a proteiny bez enzymové aktivity, jako je disintegrins, C-typ lektiny, cystein-rich sekreční proteiny (OSTRÝ) toxiny, natriuretické peptidy, a myotoxins. Jedovaté zmije Jararaca a Lachesis muta jsou zodpovědné za nehody s lidmi v několika oblastech Jižní Ameriky. Zatímco B. jararaca se vyskytuje v jižní Brazílii, Paraguay, a severní Argentina, L. muta je distribuován v rovníkové lesy na východ od And, od východní Ekvádor, Kolumbie, Peru, severní Bolívii a východní a severní Venezuela, Guyana, francouzská Guyana, Surinam, a severní Brazílie. V jejich dosahu jsou často hojné a jsou důležitou příčinou hadí kousnutí . Envenoming těmito hady je charakterizován hlavně systémovým (generalizované krvácení, koagulopatie, selhání ledvin a šok) a lokálními účinky (krvácení, edém a nekróza) . Jak bylo uvedeno jinde, hadí uštknutí představuje problém veřejného zdravotnictví v latinské Americe a v dalších tropických a subtropických zemích, v nichž jsou považována za zanedbané zdravotní problém, podle Světové Zdravotnické Organizace (WHO) . V Jižní Americe, B. jararaca vyvolává vyšší výskyt hmyzem (95%) než L. muto (cca 2%); nicméně, L. muta kousnutí obvykle vést k těžkým envenoming příznaky a jeho úmrtnost výskyt je třikrát větší než B. jararaca . V dnešní době, parenterální podání živočišného původu protijed je pouze specifická léčba pro envenoming prostřednictvím hadího uštknutí. V Brazílii, intravenózní podání buď Bothrops polyvalentní protilátka se používá k léčbě envenoming případy způsobené Bothrops kousnutí nebo polyvalentní bothropic-lachetic sérum pro L. muta a Bothrops (B. atrox) hadí uštknutí v Amazonské oblasti. Jak bylo uvedeno výše, středně těžkou až těžkou envenomings způsobené Bothrops a Lachesis hadi jsou charakterizovány komplexní řadu lokálních a systémových změn, jako jsou krvácení, myonecrosis, koagulopatie, kardiovaskulární šok, selhání ledvin a nakonec smrt . Jak uvádí jiní autoři, navzdory tomu, že jsou v bezpečí, vysoké dávky protijedů někdy používá v Brazílii k léčbě pacientů s prokázanou nebo suspektní Bothrops/Lachesis envenoming může přispět k časné anafylaktické a pozdní (sérová nemoc) typ reakce . Výroba antivenomů odpovídající kvality tak představuje značnou výzvu. Ceny antivenomů se navíc zvýšily a některé země zastavily jejich výrobu . Některé protijedů efektivně neutralizovat systémové toxické účinky jedu; nicméně, místní účinky nejsou blokovány, a tato situace může vést k amputaci nebo zdravotního postižení .
Kvůli těmto problémům, alternativní způsoby léčby mají hledal a některé z nich byly zapojeny do hledání nových molekul schopen neutralizovat systémové a lokální účinky jedy. Výtažky z rostlin a dalších přírodních zdrojů (jako ty z mořských organismů) byly testovány pro jejich schopnost neutralizovat různé biologické a toxické účinky hadí jedy. Byly identifikovány různé farmakologicky aktivní molekuly a pro ně již bylo uvedeno mnoho účinků , včetně jejich antivenomické schopnosti . V současné době se zkoumá mnoho nových bioprospektivních přístupů. V souvislosti s tím je však třeba poznamenat, že biologické účinky molekul odvozených z organické syntézy dosud nebyly dobře prozkoumány. Literatura popsal 1,2,3-triazolové sloučeniny jako důležitou třídu pěti-člen dusíkatých heterocyklických systém, který vykazuje odlišné farmakologické profily, jako antiagregační aktivitu , anticlotting , antivirové , trypanocidal , antimikrobiální , a/nebo jejich použití v léčbě schizofrenie a leishmanióza . Dvě obecné metody jsou k dispozici pro výstavbu 1,2,3-triazolové kruhy: Huisgen 1,3-dipolárních cycloaddition reakce , zejména mědi(I)-katalyzovaná cycloaddition , a intramolekulární 1,5-electrocyclization β-substituovaný-α-diazocarbonyl sloučenin . Naše předchozí studie ukázaly, že šest nových syntetických 1,2,3-triazolové sloučeniny (1-arylsulfonylamino-5-methyl-1H–triazol-4-karboxylové kyseliny ethyl estery) inhibuje hemolýza vyvolaná L. muta jed . Ve skutečnosti tyto deriváty vykazovaly širokou škálu farmakologických aktivit .
cílem této práce bylo vyhodnotit schopnost těchto šest 1,2,3-triazolové deriváty založené na-1-(p-chlorfenyl)-1H–triazol-4-carbohydrazide proti in vivo a in vitro činnosti Bothrops jararaca a Lachesis muta jedy.
2. Materiál
2.1. Jed a Materiál
Bothrops jararaca, Lachesis muta lyofilizované jedy, a anti-Lachesis nebo anti-Bothropic protijed byly poskytnuty z Fundação Ezequiel Dias, Belo Horizonte, MG, Brazílie, a skladovány při teplotě -20°C až do analýz. Dimethylsufoxid (DMSO), bovinní fibrinogen a azokasein byly získány z Sigma Chemical Co. Všechna ostatní činidla byla nejlepšího dostupného stupně.
2.2. Syntetické Deriváty
šest 1-arylsulfonylamino-5-methyl-1H–triazol-4-karboxylové kyseliny ethyl estery deriváty byly syntetizovány podle naší předchozí zprávě a jejich chemické struktury jsou uvedeny na Obrázku 1. Tyto sloučeniny byly rozpuštěny v dimethylsufoxidu (DMSO) a skladovány při 4°C, dokud nebylo požadováno.
Chemické struktury šest 1,2,3-triazolů deriváty N‘–1-(p-chlorfenyl)-1H–triazol-4-carbohydrazide. Šest derivátů bylo navrženo jako čísla, jak je uvedeno v závorce za každou derivací.
2.3. Zvířata
BALB / C myši (18-20 g) byly získány z Núcleo de Animais de laboratorio (NAL) Federální univerzity Fluminense. Zvířata byla chována za kontrolovaných podmínek teploty (°C) a světla. Experimenty byly schváleny UFF Institucionální Výboru pro Etiku ve Zvířatech (protokol č. 297), které byly v souladu s pokyny Brazilského Výboru pro Pokusy na Zvířatech (COBEA) a mezinárodní zákony a politika.
3. Metody
3.1. Inhibice nepřímé hemolýzy
stupeň hemolýzy způsobené jedy L. muta a B. jararaca byl stanoven nepřímým hemolytickým testem s použitím lidských erytrocytů a emulze slepičího žloutku jako substrátu . Množství L. muta a B. jed jararaca (µg / mL), který způsobil 100% hemolýzu, byl označen jako minimální nepřímá hemolytická dávka (MIHD). Inhibiční experimenty byly provedeny inkubací derivátů triazolu s jedním MIHD po dobu 30 minut při pokojové teplotě a poté byla hodnocena hemolytická aktivita. Kontrolní experimenty byly prováděny inkubací jedů DMSO nebo fyziologickým roztokem.
3.2. Anticlotting Aktivity
koagulační aktivita L. muta a B. jararaca jedy byla stanovena pomocí digitální Amelungu koagulometr, model KC4A (Labcon, Německo). Různé koncentrace L. muta (10 µg/mL) a B. jararaca (40 µg/mL) venom byly smíchány s bovine fibrinogen roztoku (2 mg/mL) nebo lidské plazmy, a množství jedu, že sražená buď fibrinogen, nebo plazmy za 60 sekund byla označena jako minimální dávka koagulantu (MCD). K hodnocení jejich inhibiční účinek, triazolové deriváty byly inkubovány po dobu 30 minut při pokojové teplotě s jedním z MCD jedy, a pak byla směs přidána k fibrinogenu nebo plazma a koagulační čas zaznamenán. Kontrolní experimenty byly prováděny paralelně přidáním DMSO nebo fyziologického roztoku inkubovaného s jedy namísto triazolů.
3.3. Antiproteolytic Aktivity
Proteolytické aktivity muta L. a. B. jararaca jedy byla stanovena pomocí azocasein jako substrát (o 0,2% w/v, v 20 mM Tris-HCl, 8 mM CaCl2, pH 8.8), s menší modifikací . Efektivní koncentrace (EC) byla definována jako množství jedu (µg/mL) schopen produkovat variace na 420 nm z o 0.2. Deriváty triazolu byly inkubovány s jedním EC jedu po dobu 30 minut při pokojové teplotě a poté byla měřena proteolýza. Kontrolní experimenty byly prováděny inkubací jedů DMSO nebo fyziologickým roztokem.
3.4. Přípravky Aktivity
Hemoragické léze produkován muta L. a. B. jararaca jedy byly kvantifikovány pomocí postupu popsaného Kondo et al. , s úpravami. Stručně řečeno, vzorky byly injikovány intradermálně (i. d. ) do břišní kůže myší. O dvě hodiny později byla zvířata utracena dekapitací, odstraněna břišní kůže, natažena a zkontrolována na vizuální změny ve vnitřním aspektu, aby se lokalizovaly hemoragické skvrny. Krvácení bylo kvantifikováno jako minimální hemoragická dávka (MHD), definovaná jako množství jedu (mg/kg) schopné produkovat hemoragický halo 10 mm . Inhibiční účinek triazolových derivátů byla zkoumána inkubací sloučeniny s dvěma MHD L. muta nebo B. jararaca jed po dobu 30 minut při pokojové teplotě a pak byla směs injekcí do myší a krvácení byla měřena. Hemoragická aktivita byla vyjádřena jako střední průměr (v milimetrech) hemoragického halo indukovaného jedy v nepřítomnosti a přítomnosti derivátů triazolu. Negativní kontrolní experimenty byly provedeny injekcí DMSO nebo fyziologického roztoku.
3.5. Antiedematogenní aktivita
aktivita vyvolávající edém jedů L. muta a B. jararaca byla stanovena podle Yamakawa et al. , s úpravami. Skupiny pěti myší byly injikovány subkutánně (s. c) do pravé podložky s 50 µL jedu, zatímco levá potravinová podložka dostala 50 µL fyziologického roztoku. Jednu hodinu po injekci byl vyhodnocen edém a vyjádřen jako procento zvýšení hmotnosti podložky pravé nohy ve srovnání s levou. Inhibiční účinek triazolových derivátů byla zkoumána inkubací sloučeniny s L. muta nebo B. jararaca jed po dobu 30 minut při pokojové teplotě a pak byla směs injekcí do myší (pravou nohu na podložku) a edém byla měřena.
3.6. Statistická analýza
výsledky jsou vyjádřeny jako prostředky ± SEM získané s uvedeným počtem zvířat nebo provedených experimentů. Statistická významnost rozdílů mezi experimentálními skupinami byla hodnocena pomocí Studentova testu. Hodnota ≤ 0,05 byla považována za významnou.
4. Výsledky a Diskuse
vývoje účinných, bezpečných, levnější a dostupnější protijedů si zaslouží pozornost, protože hadí uštknutí může způsobit těžkým zdravotním postižením a zabít tisíce lidí, stejně. Rostoucí počet studií byl zaměřen na hledání inhibitorů hadích jedů z různých zdrojů, ať už přírodních nebo syntetických . Suramin a benzoyl fenyl-benzoát jsou syntetické molekuly, schopné inhibovat myotoxicity, srážení krve, a fosfolipázy A2 a hyaluronidáza činnosti hadí jedy z různých rodin. Laktonové analogy byly syntetizovány a inhibovány myotoxicitou a enzymatické aktivity indukující edém indukované fosfolipázou A2 izolovanou z B .jararacussu. Na druhé straně mořské bioaktivní principy také přitahovaly pozornost kvůli jejich širokému rozšíření farmakologických účinků .
V této práci, byla hodnocena schopnost šest 1-arylsulfonylamino-5-methyl-1H–triazol-4-karboxylové kyseliny ethyl estery neutralizovat některé in vitro (hemolýza, sraženiny, a proteolýzy) a in vivo (krvácení, edém vyvolávající) činnosti způsobené B. jararaca a L. muta jedy, protože předchozí výsledky ukázaly, že těchto šest deriváty inhibovaly hemolýza vyvolaná L. muta jed, ale s různými energiemi . Z tohoto důvodu se předpokládalo, že by bylo užitečné prozkoumat působení takových derivátů na další důležité biologické aktivity související s kousnutím hadem, jako je proteolýza, srážení krve, hemolýza, krvácení a edém. Bylo prokázáno, že tyto sloučeniny inhibovaly hemolýzu způsobenou jedem B. jararaca (50 µg/mL) a L.muta (15 µg/mL) (Obrázek 2 (a)). Inhibiční procento derivátů bylo nad 50% proti oběma jedům. Mírný rozdíl v inhibičním profilu byl však pozorován u derivátu 6, kde bylo dosaženo 50% a 90% inhibice hemolýzy u B. jararaca a L. muta venom. Ani deriváty, ani DMSO nevedly erytrocyty k hemolýze, ani DMSO nezasahovalo do stupně hemolýzy způsobené jedy.
()
(b)
(a)
(b)
Účinek derivátů na hemolýzu a proteolýzy. Deriváty 1-6 (45 µM) byly inkubovány S B.jararaca (tmavé sloupce) nebo S L. muta (čárkované sloupce) po dobu 30 minut při pokojové teplotě a poté byly provedeny hemolytické (a) a proteolytické (b) aktivity. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM jednotlivých experimentů ().
Envenomation těchto plazů vytváří závažné krvácení vzhledem k vysokému obsahu zinku-závislé metalloprotease nebo serinové proteázy, které pomáhají trávit bílkoviny komponenty extracelulární matrix nebo konzumovat faktorů srážení krve . B. jararaca a L. muta venom hydrolyzoval azokasein v závislosti na koncentraci s EC 20 µg / mL a 6 µg/mL (údaje nejsou uvedeny). Deriváty inhibovaly proteolýzu indukovanou B. jararaca nebo L. muta (Obrázek 2(b)). Deriváty 1, 2, 3 a 6 inhibovaly proteolýzu indukovanou oběma jedy až do 80% a derivát 5 inhiboval takovou aktivitu pod 50%. Výrazný rozdíl na inhibiční profil derivátů byla pozorována u derivátů 4, ve kterém je inhibována 97% a 25% proteolýzy vyvolané B. jararaca nebo L. muta jed, respektive (Obrázek 2(b)).
Jak je vidět na Obrázku 3, deriváty, 1, 2, 4, 5 a 6, ale není derivace 3 inhibována v závislosti na koncentraci způsobem (23-94 µM), srážení krve z fibrinogenu vyvolané jedy B. jararaca (40 µg/mL) nebo L. muto (10 µg/mL). Zdálo se, že deriváty inhibují účinněji koagulaci vyvolávající l. muta než B. jararaca. Při nejvyšší koncentraci (94 µM), deriváty 1, 2, 3, 5 a 6 předejít L. muta srážení krve (viz Obrázek 3(b)), zatímco deriváty 2 a 6 zabránila B. jararaca jednou (Obrázek 3(b)). V koncentracích do 200 µM, všechny 1,2,3-triazolové deriváty účinně zabránit fibrinogen koagulační způsobené jedy, ale v koncentracích nižších než 10 µM, žádná z těchto sloučenin, brání srážení krve. Když však byly deriváty (10 µM) spojeny dohromady a inkubovány buď s jedem B.jararaca nebo L. muta, doba srážení byla dvakrát zpožděna. Bylo zjištěno, že pokud byl ze směsi odstraněn derivát 2 nebo 6, nebyl pozorován inhibiční účinek při srážení. Kromě toho deriváty také zabránily srážení vyvolané jedy při použití plazmy. DMSO (1% obj., konečná koncentrace) ani fyziologický roztok neinterferovaly s koagulačními procesy.
()
(b)
(a)
(b)
Účinek derivátů na fibrinogen koagulační. Dvacet tři µM derivátů (šedé sloupce), 46 µM (bílé sloupce) nebo 94 µM (černé sloupce) bylo inkubováno s 40 µg/mL B.jararaca (a) nebo s 10 µg/mL l. muta (b) po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Poté byla směs přidána k fibrinogenu (2 mg / mL)a byla zaznamenána doba srážení. Jedy byly inkubovány s fyziologickým roztokem (C1); 1% v/v DMSO (C2); derivát 1 (sloupec 1); derivát 2 (sloupec 2); derivát 3 (sloupec 3); derivát 4 (sloupec 4); deriváty 5 (sloupec 5); a s deriváty 6 (sloupec 6). # znamená, že fibrinogen se nesrážel až do 600 sekund pozorování. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM jednotlivých experimentů ().
Intradermální injekce B. jararaca (12 mg/Kg) nebo L. muto (20 mg/Kg) jed produkoval krvácení halo 20 mm u myší. Takový halo představuje dva MHD jedů. Když byl každý jed smíchán s deriváty (90 µM) a poté injikován do myší, byla pozorována úplná ochrana před krvácením (údaje nejsou zobrazeny). Naproti tomu předchozí výsledky ukázaly, že antilachetické sérum neinhibuje krvácení vyvolané jedem L. muta . Injekce DMSO, derivátů nebo fyziologického roztoku nevyvolala krvácení. Edém vyvolávající je dalším důležitým účinkem, který následuje po kousnutí hadem . Obrázek 4 ukazuje, že edém vyvolaný 5 mg / Kg B. jararaca(obrázek 4 (a)) nebo 8 mg/Kg L. muta (obrázek 4(B)) byla významně snížena deriváty (90 µM). Deriváty triazolu 1, 2 a 4 inhibovaly nad 80% edém vyvolaný B. jararaca, zatímco deriváty 3, 5 a 6 inhibovaly kolem 70% (obrázek 4(a)). Jak je vidět, všechny deriváty inhibovaly méně Edematogenní aktivitu indukovanou l. muta (obrázek 4(b)).
()
(b)
(a)
(b)
Účinek derivátů na edém-vyvolávající aktivitu. Deriváty (90 µM) byly inkubovány s 5 mg/Kg B.jararaca (a) nebo s 8 mg/Kg L. muta (b) po dobu 30 minut při pokojové teplotě a poté byla provedena aktivita vyvolávající edém. Sloupce jsou derivátem 1 plus jed (1); derivát 2 plus jed (2); derivát 3 plus jed (3); derivát 4 plus jed (4); derivát 5 plus jed (5) a derivátu 6 plus jed (6). Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM jednotlivých experimentů ().
Na závěr 1-arylsulfonylamino-5-methyl-1H–triazol-4-karboxylové kyseliny ethyl estery deriváty mohou být užitečné jako prototypy pro navrhování nových molekul ke zlepšení současné léčbě používá pro B. jararaca a L. muta hadí uštknutí. Inhibiční účinnost těchto derivátů se může lišit nebo může být zvýšena, když byly všechny dohromady, pravděpodobně působí synergicky. K dosažení úplné neutralizace biologických účinků způsobených jedy B. jararaca a L. muta by tedy byla zapotřebí jejich nižší koncentrace. Dále již byla provedena předchozí analýza vztahu mezi strukturou a aktivitou derivátů . Deriváty byly předloženy analýzy „Lipinského pravidlo pěti“, který označuje, že chemické molekuly by mohly být perorálně účinný lék u lidí a toto pravidlo uvádí, že molekula porušení jakékoliv dvě z těchto pravidel, je pravděpodobné, že bude špatně vstřebává: (1) molekulární hmotnost méně než 500 Da, (2) počet vodíková vazba dárci (OH nebo NH skupin) roven nebo je menší než 5, (3) počet hydrogen bond akceptory méně než 10, a konečně (4) vypočtené méně než 5 . Výsledky ukázaly, že všechny deriváty splněno toto pravidlo (molekulární hmotnost = 296.31–341.30; 2.6–3.4; nHBA = 8-11 a nHBD = 1-3) ukazuje na dobré teoretické biodisponibility .
Poděkování
Tato práce byla podpořena Mezinárodní Nadace pro Vědu (IFS Grant F/4571-1) a tímto Brazilské agentury pro financování: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico( CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa dělat Estado do Rio de Janeiro Carlos Chagas Filho (Faperj), Coordinação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (pláštěnky), a Universidade Federal Fluminense/pró-recitoria de Pesquisa e Pós-graduação e Inovação (Uff/PROPPi).