Antivenom effekter af 1,2,3-Triasoler mod Bothrops jararaca og Lachesis muta slanger

Abstract

slangegifte er komplekse blandinger af proteiner af både ikke-Tymer og ikke-Tymer, som er ansvarlige for at producere flere biologiske effekter. Menneskelig envenomation ved slangebid, især dem fra viperid-familien, inducerer et komplekst patofysiologisk billede, der er kendetegnet ved spektakulære ændringer i hæmostase og ofte blødning ses også. Det foreliggende arbejde rapporterer evnen hos seks af en serie af 1,2,3-triasolderivater til at hæmme nogle farmakologiske virkninger forårsaget af giftene af Bothrops jararaca og Lachesis muta. In vitro-analyser viste, at disse forbindelser blev forringet på en koncentrationsafhængig måde, fibrinogen eller plasmakoagulation, hæmolyse og proteolyse produceret af begge gifte. Desuden hæmmede disse forbindelser også biologiske virkninger in vivo. Mus behandlet med disse forbindelser var fuldt beskyttet mod hæmoragiske læsioner forårsaget af sådanne giftstoffer. Men kun B. jararaca-ødeminducerende aktivitet blev neutraliseret af triasolerne. Så den inhiberende virkning af triasolderivater mod nogle in vitro og in vivo biologiske analyser af slangegift peger på lovende aspekter, der kan indikere dem som molekylære modeller for at forbedre produktionen af effektivt modgift eller for at supplere modgiftneutralisering, især de lokale patologiske virkninger, som delvist neutraliseres af modgift.

1. Introduktion

slangegifte er komplekse blandinger af proteiner, herunder proteiner (metalloproteinaser, serinproteinaser, phospholipaser A2 og L-aminosyreoksidase) og proteiner uden aktivitet, såsom disintegriner, C-type lectiner, cysteinrige sekretoriske proteiner (sprøde) toksiner, natriuretiske peptider og myotoksiner. De giftige pit vipers Bothrops jararaca og Lachesis muta er ansvarlige for ulykker, der involverer mennesker i flere regioner i Sydamerika. Mens B. jararaca findes i det sydlige Brasilien, Paraguay og det nordlige Argentina, L. muta er udbredt i ækvatoriale skove øst for Andesbjergene, lige fra det østlige Ecuador, Colombia, Peru, Det nordlige Bolivia og det østlige og nordlige Brasilien, Til Guyana, Fransk Guyana, Surinam og det nordlige Brasilien. Inden for deres rækkevidde er de ofte rigelige og er vigtig årsag til slangebitter . Envenoming af disse slanger er hovedsageligt kendetegnet ved systemisk (generaliseret blødning, koagulopati, nyresvigt og chok) og lokale virkninger (blødning, ødem og nekrose) . Som rapporteret andetsteds udgør slangebid et folkesundhedsproblem i Latinamerika og i andre tropiske og subtropiske lande, hvor de betragtes som et forsømt sundhedsspørgsmål, ifølge Verdenssundhedsorganisationen (hvem) . I Sydamerika inducerer B. jararaca en højere forekomst af bid (95%) end L. muta (ca .2%); imidlertid fører L. muta-bid normalt til mere alvorlige envenomerende symptomer, og dens dødelighed er tre gange højere end B. jararaca. I dag er den parenterale administration af animalsk afledt modgift den eneste specifikke behandling for envenoming af slangebitter. I Brasilien anvendes intravenøs administration af enten Bothrops polyvalent antivenom til behandling af de envenomerende tilfælde forårsaget af Bothrops bites eller det polyvalente bothropic-lachetic serum til L. muta og Bothrops (B. atroks) slangebid i de amasoniske regioner. Som nævnt ovenfor er moderate til svære envenomings påført af Bothrops og Lachesis slanger kendetegnet ved en kompleks række lokale og systemiske ændringer såsom blødning, myonekrose, koagulopati, kardiovaskulær chok, nyresvigt og til sidst død . Som rapporteret af andre forfattere, på trods af at de er sikre, kan Høje doser af modgift, der undertiden bruges i Brasilien til behandling af patienter med påviste eller mistænkte Bothrops/Lachesis envenoming, bidrage til tidlige anafylaktiske og sene (serumsyge) type reaktioner . Produktionen af modgift af tilstrækkelig kvalitet udgør således en betydelig udfordring. Desuden er priserne på modgift steget, og nogle lande har stoppet deres fremstilling . Nogle antivenomer neutraliserer effektivt de systemiske toksiske virkninger af giften; imidlertid blokeres de lokale virkninger ikke, Og denne situation kan føre til amputation eller handicap .

på grund af sådanne problemer er der søgt alternative behandlinger, og nogle af dem har involveret søgningen efter nye molekyler, der er i stand til at neutralisere systemiske og lokale virkninger af gifte. Ekstrakter fra planter og andre naturlige kilder (som dem fra marine organismer) er blevet testet for deres evne til at neutralisere en række biologiske og toksiske virkninger af slangegifte. Forskellige farmakologisk aktive molekyler er blevet identificeret , og mange effekter er allerede blevet opført for dem, herunder deres antivenom evne . I dag undersøges mange nye bioprospekteringsmetoder. I forbindelse hermed skal det imidlertid bemærkes, at de biologiske virkninger af molekyler afledt af organisk syntese endnu ikke er blevet undersøgt godt. Litteratur har beskrevet 1,2,3-triasolforbindelse som en vigtig klasse af fem-medlems nitrogen heterocyklisk system, der udviser forskellige farmakologiske profiler , såsom blodpladeaktivitet , antiklotting , antiviral , trypanocidal , antimikrobiel og/eller deres anvendelse til behandling af schisofreni og leishmaniasis . To generelle metoder er tilgængelige til konstruktion af 1,2,3-triasolringe: Huisgen 1,3-dipolære cycloadditionreaktioner , især kobber(I)-katalyseret cycloaddition og den intramolekylære 1,5-elektrocyklisering af Vores tidligere undersøgelser har vist, at seks nye syntetiske 1,2,3-triasolforbindelser (1-arylsulfonylamino-5-methyl-1h-triasol-4-carboksilsyreethylestere) hæmmede hæmolysen induceret af L. muta-gift . Faktisk viste sådanne derivater en bred vifte af farmakologiske aktiviteter .

formålet med dette arbejde var at evaluere evnen af disse seks 1,2,3-triasolderivater baseret på –1-(p-chlorphenyl)-1h-triasol-4-karbonhydrid mod in vivo og in vitro-aktiviteter af Bothrops jararaca og Lachesis muta-giftstoffer.

2. Materiale

2.1. Gift og materiale

Bothrops jararaca, Lachesis muta lyofiliserede giftige stoffer og anti-Lachesis eller anti-Bothropisk modgift blev leveret fra Funda, Belo horisont, mg, Brasilien og opbevaret ved -20 kr.C indtil analyser. Fra Sigma Chemical Co blev der opnået dimethylsufoksid (DMSO), bovint fibrinogen og asocasein. Alle andre reagenser var af den bedste tilgængelige kvalitet.

2.2. Syntetiske derivater

de seks 1-arylsulfonylamino-5-methyl-1h–derivater af triasol-4-carboksilsyreethylestere blev syntetiseret i henhold til vores tidligere rapport, og deres kemiske strukturer er vist i Figur 1. Disse forbindelser blev opløst i dimethylsufoksid (DMSO) og opbevaret ved 4 liter C, indtil det var nødvendigt.

Figur 1

kemiske strukturer af de seks 1,2,3-triasolderivater N ‘ –1-(p-chlorphenyl)-1h-triasol-4-carbohydrat. De seks derivater blev designet som tal, som vist i parentes efter hvert derivat.

2.3. Dyr

BALB/C-mus (18-20 g) blev opnået fra N-Kurscleo de Animais de Laborat-Kurrio (NAL) fra Federal Fluminense University. Dyrene blev anbragt under kontrollerede temperaturforhold (kur C) og lys. Eksperimenter blev godkendt af Uff institutionelle Udvalg for etik i dyreforsøg (protokol nummer 297), der var i overensstemmelse med retningslinjerne fra det brasilianske Udvalg for dyreforsøg (COBEA) og internationale love og politikker.

3. Metoder

3.1. Inhibering af indirekte hæmolyse

graden af hæmolyse forårsaget af giften af L. muta og B. jararaca blev bestemt ved den indirekte hæmolytiske test ved anvendelse af humane erythrocytter og høns æggeblommeemulsion som substrat . Mængden af L. muta og B. jararaca-gift (larg/mL), der producerede 100% hæmolyse, blev betegnet som minimum indirekte hæmolytisk dosis (MIHD). Inhiberende eksperimenter blev udført ved inkubation af triasolderivater med en MIHD i 30 minutter ved stuetemperatur, og derefter blev hæmolytisk aktivitet evalueret. Kontroleksperimenter blev udført ved at inkubere gifte med DMSO eller saltopløsning.

3.2. Antiklottende aktivitet

koagulationsaktiviteten af L. muta og B. jararaca-gifter blev bestemt ved anvendelse af et digitalt Amelung-koagulometer, model KC4A (Labcon, Tyskland). Forskellige koncentrationer af L. muta (10 kg/mL) og B. jararaca (40 kg/mL) gift blev blandet med bovin fibrinogenopløsning (2 mg/mL) eller med humant plasma, og mængden af gift, der koagulerede enten fibrinogen eller plasma på 60 sekunder, blev betegnet som minimum koagulantdosis (MCD). For at evaluere deres inhiberende virkning blev triasolderivaterne inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur med en MCD-gift, og derefter blev blandingen tilsat til fibrinogen eller plasma og koagulationstid registreret. Kontroleksperimenter blev udført parallelt ved tilsætning af DMSO eller saltvand inkuberet med gifte i stedet for triasolerne.

3.3. Antiproteolytisk aktivitet

proteolytisk aktivitet af L. muta og B. jararaca-venomer blev bestemt ved anvendelse af acasein som substrat (0,2% vægt/v, i 20 mM Tris-HCl, 8 mM CaCl2, pH 8,8) med mindre modifikation . En effektiv koncentration (EC) blev defineret som mængden af gift (larg/mL) i stand til at producere en variation ved en 420 nm på omkring 0,2. Triasolderivater blev inkuberet med et EC-gift i 30 minutter ved stuetemperatur, og derefter blev proteolyse målt. Kontroleksperimenter blev udført ved at inkubere gifte med DMSO eller saltopløsning.

3.4. Antihemorragisk aktivitet

hæmoragiske læsioner produceret af L. muta og B. jararaca-gifte blev kvantificeret ved hjælp af en procedure beskrevet af Kondo et al. , med ændringer. Kort sagt blev prøver injiceret intradermalt (i.d.) i musens abdominale hud. To timer senere blev dyrene aflivet ved halshugning, abdominal hud fjernet, strakt og inspiceret for visuelle ændringer i det indre aspekt for at lokalisere hæmoragiske pletter. Blødning blev kvantificeret som den minimale hæmoragiske dosis (MHD), defineret som mængden af gift (mg/kg), der er i stand til at producere en hæmoragisk glorie på 10 mm . Den inhiberende virkning af triasolderivater blev undersøgt ved at inkubere forbindelser med to MHD af L. muta eller B. jararaca gift i 30 minutter ved stuetemperatur, og derefter blev blandingen injiceret i mus, og blødning blev målt. Hæmoragisk aktivitet blev udtrykt som den gennemsnitlige diameter (i millimeter) af den hæmoragiske halo induceret af gifte i fravær og tilstedeværelse af triasolderivaterne. Negative kontrolforsøg blev udført ved injektion af DMSO eller saltopløsning.

3.5. Antiedematogen aktivitet

Ødeminducerende aktivitet af L. muta og B. jararaca-gifter blev bestemt ifølge Yamakava et al. , med ændringer. Grupper på fem mus blev injiceret subkutant (s.c) i den højre fodpude med 50 liter gift, mens den venstre madpude modtog 50 liter saltvand. En time efter injektion blev ødem evalueret og udtrykt som procentdelen af stigningen i vægten af den højre fodpude sammenlignet med den venstre. Den inhiberende virkning af triasolderivater blev undersøgt ved at inkubere forbindelser med L. muta eller B. jararaca gift i 30 minutter ved stuetemperatur, og derefter blev blandingen injiceret i mus (højre fodpude), og ødem blev målt.

3.6. Statistisk analyse

resultaterne udtrykkes som middelkrus sem opnået med det angivne antal dyr eller udførte forsøg. Den statistiske betydning af forskelle mellem eksperimentelle grupper blev evalueret ved hjælp af elevens test. En værdi på 0,05 kr. blev betragtet som signifikant.

4. Resultater og diskussion

udviklingen af effektive, sikre, billigere og mere tilgængelige modgift fortjener opmærksomhed, da slangebid kan forårsage alvorlige handicap og også dræbe tusinder af mennesker. Et stigende antal undersøgelser har været fokuseret på søgen efter inhibitorer af slangegifte fra en række kilder, hvad enten de er naturlige eller syntetiske . Disse molekyler er syntetiske molekyler, der er i stand til at hæmme myotoksicitet, koagulation og phospholipase A2 og hyaluronidase aktiviteter af slangegifte fra forskellige familier. Lactonanaloger blev syntetiseret og hæmmet myotoksicitet, og ødem-inducerende aktiviteter induceret af en phospholipase A2 isoleret fra B. jararacussu enten . På den anden side har marine bioaktive principper også tiltrukket opmærksomhed på grund af deres vidt spredte farmakologiske handlinger .

i dette arbejde blev det evalueret evnen hos seks 1-arylsulfonylamino-5-methyl-1h-triasol-4-carboksilsyreethylestere til at neutralisere nogle in vitro (hæmolyse, koagulation og proteolyse) og in vivo (blødning og ødeminducerende) aktiviteter forårsaget af B. jararaca og L. muta-gifter, da tidligere resultater viste, at disse seks derivater hæmmede hæmolyse induceret af L. muta-gift, men med forskellige styrker . Af denne grund blev det antaget, at det ville være værd at undersøge handlingerne af sådanne derivater på andre vigtige biologiske aktiviteter relateret til slangebid, som proteolyse, koagulation, hæmolyse, blødning og ødem. Det blev vist, at disse forbindelser inhiberede hæmolysen forårsaget af B. jararaca (50 liter/mL) og L. muta (15 liter/mL) gift (figur 2(a)). Den inhiberende procentdel af derivaterne var over 50% mod begge gifte. Imidlertid blev der observeret en lille forskel på den inhiberende profil for derivat 6, hvor en 50% og 90% hæmning på hæmolyse blev opnået for henholdsvis B. jararaca og L. muta venom. Hverken derivater eller DMSO førte erythrocytter til hæmolyse, og DMSO blandede sig heller ikke i graden af hæmolyse forårsaget af gifte.

(a)

(b)

(a)
(b)

figur 2

virkning af derivater på hæmolyse og proteolyse. Derivater 1-6 (45 liter) blev inkuberet med B. jararaca (mørke søjler) eller med L. muta (stiplede søjler) i 30 minutter ved stuetemperatur, og derefter blev hæmolytiske (A) og proteolytiske (b) aktiviteter udført. Data udtrykkes som middelkurs sem for individuelle eksperimenter ().

envenomation af disse slangebitter producerer alvorlig blødning på grund af det høje indhold af sinc-afhængig metalloprotease eller serinprotease, der fordøjer proteinkomponenter i den ekstracellulære matrice eller forbruger blodkoagulationsfaktorer . B. jararaca og L. på en koncentrationsafhængig måde hydrolyseret mutagift med et EF på hhv.20 g/mL og 6 g/mL (data er ikke vist). Derivaterne hæmmede proteolyse induceret af B. jararaca eller L. muta (figur 2(b)). Derivaterne 1, 2, 3 og 6 hæmmede proteolyse induceret af begge gifte op til 80%, og derivatet 5 hæmmede en sådan aktivitet under 50%. En markant forskel på inhiberende profil af derivater blev observeret for derivat 4, hvor det hæmmede 97% og 25% proteolysen induceret af henholdsvis B. jararaca eller L. muta venom (figur 2(b)).

som det ses i figur 3, derivaterne 1, 2, 4, 5 og 6, men ikke derivatet 3 hæmmet på en koncentrationsafhængig måde (23-94 liter), koaguleringen af fibrinogen induceret af giften af B. jararaca (40 liter/mL) eller L. muta (10 liter/mL). Det så ud til, at derivater hæmmede mere effektivt L. muta-inducerende koagulation end B. jararaca. Ved den højeste koncentration (94 liter) forhindrede derivaterne 1, 2, 3, 5 og 6 L. muta-koagulering (figur 3(b)), mens derivaterne 2 og 6 forhindrede B. jararaca en gang (Figur 3(b)). Ved koncentrationer på op til 200 liter forhindrede alle 1,2,3-triasolderivaterne effektivt fibrinogenkoagulation forårsaget af begge giftstoffer, men ved koncentrationer under 10 liter forhindrede ingen af disse forbindelser koagulering. Men når derivater (10 liter) blev sat sammen og inkuberet med enten B. jararaca eller L. muta gift, blev koagulationstiden forsinket to gange. Det blev bemærket, at hvis derivat 2 eller 6 blev fjernet fra blandingen, blev der ikke observeret hæmmende virkning ved koagulation. Desuden forhindrede derivaterne også koagulering induceret af gifte, når plasma blev anvendt. Hverken DMSO (1% v/v, endelig koncentration) eller saltopløsning interfererede med koagulationsprocesser.

(a)

(b)

(a)
(b)

figur 3

virkning af derivater på fibrinogen koagulation. Tyve tre liter-derivater (grå søjler), 46 liter (hvide søjler) eller 94 liter (sorte søjler) blev inkuberet med 40 liter/mL B. jararaca (A) eller med 10 liter/mL L. muta (b) i 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev blandingen tilsat til fibrinogen (2 mg/mL), og koagulationstiden blev registreret. Giftige stoffer blev inkuberet med saltvand (C1); 1% v/V DMSO (C2); derivat 1 (kolonne 1); derivat 2 (kolonne 2); derivat 3 (kolonne 3); derivat 4 (kolonne 4); derivat 5 (kolonne 5); og med derivat 6 (kolonne 6). # betyder, at fibrinogen ikke koagulerede før 600 sekunders observation. Data udtrykkes som middelkurs sem for individuelle eksperimenter ().

Intradermal injektion af B. jararaca (12 mg/Kg) eller L. muta (20 mg/Kg) gift producerede en blødningshalo på 20 mm hos mus. En sådan halo repræsenterer to MHD af giftige stoffer. Når hvert gift blev blandet med derivater (90 liter) og derefter injiceret i mus, blev der set en fuldstændig beskyttelse mod blødning (data ikke vist). I modsætning hertil viste tidligere resultater, at antilaketisk serum ikke hæmmer blødning induceret af L. muta-gift . Injektion af DMSO, derivater eller saltopløsning producerede ikke blødning. Ødeminducerende er en anden vigtig effekt, der følger slangebid . Figur 4 viser, at ødem induceret af 5 mg/Kg B. jararaca (figur 4(a)) eller 8 mg/Kg L. muta(figur 4 (b)) blev signifikant reduceret med derivaterne (90 liter). 1, 2 og 4 hæmmede over 80% ødem induceret af B. jararaca, hvorimod derivater 3, 5 og 6 hæmmede omkring 70% (figur 4(A)). Som set hæmmede alle derivater mindre L. muta-induceret edematogen aktivitet (figur 4(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

figur 4

virkning af derivater på ødeminducerende aktivitet. Derivaterne (90 liter) blev inkuberet med 5 mg/Kg B. jararaca (A) eller med 8 mg/Kg L. muta (b) i 30 minutter ved stuetemperatur, og derefter blev ødeminducerende aktivitet udført. Kolonner er derivat 1 plus gift (1); derivat 2 plus gift (2); derivat 3 plus gift (3); derivat 4 plus gift (4); derivat 5 plus gift (5) og derivat 6 plus gift (6). Data udtrykkes som middelkurs sem for individuelle eksperimenter ().

afslutningsvis kan 1-arylsulfonylamino-5-methyl-1h-triasol-4-carboksilsyreethylesterderivater være nyttige som prototyper til design af nye molekyler til forbedring af den nuværende behandling, der anvendes til B. jararaca og L. muta slangebid. Den hæmmende styrke af disse derivater kan variere eller kan forbedres, når de blev sat sammen, sandsynligvis virkende synergistisk. Således ville en lavere koncentration af dem være nødvendig for at nå en fuldstændig neutralisering af de biologiske virkninger forårsaget af B. jararaca og L. muta venoms. Desuden tidligere analyse af struktur-aktivitet forholdet af derivater har allerede udført . Derivaterne blev underkastet analysen af” Lipinskis regel om fem”, der indikerer, at et kemisk molekyle kunne være et oralt aktivt lægemiddel hos mennesker, og en sådan regel siger, at et molekyle, der overtræder to af følgende regler, sandsynligvis absorberes dårligt: (1) molekylvægt mindre end 500 Da, (2) Antal hydrogenbindingsdonorer (OH-eller NH-grupper) lig med eller mindre end 5, (3) Antal hydrogenbindingsacceptorer mindre end 10 og endelig (4) beregnet mindre end 5 . Resultaterne viste, at alle derivater opfyldte denne regel (molekylvægt = 296,31–341,30; 2,6–3,4; nHBA = 8-11 og nHBD = 1-3), der peger på god teoretisk biodisponibilitet .

anerkendelser

dette arbejde blev støttet af International Foundation for Science (IFS Grant F / 4571-1) og af følgende Brasilianske finansieringsagenturer: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico( CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro Carlos Chagas Filho (Faperj), Coordinação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (slag), og Universidade Federal Levanger/pró-recitoria de Pesquisa e Pós-graduação Inovação e (Uff/PROPPi).