Effets antivenins des 1,2,3-Triazoles contre les serpents Bothrops jararaca et Lachesis muta

Résumé

Les venins de serpents sont des mélanges complexes de protéines d’enzymes et de nonenzymes, responsables de plusieurs effets biologiques. L’envenimation humaine par les morsures de serpents, en particulier celles de la famille des vipérides, induit un tableau physiopathologique complexe caractérisé par des changements spectaculaires de l’hémostase et fréquemment des hémorragies sont également observées. Le présent travail rapporte la capacité de six dérivés du 1,2,3-triazole d’une série à inhiber certains effets pharmacologiques causés par les venins de Bothrops jararaca et de Lachesis muta. Des essais in vitro ont montré que ces composés étaient altérés de manière dépendante de la concentration, de la coagulation du fibrinogène ou du plasma, de l’hémolyse et de la protéolyse produites par les deux venins. De plus, ces composés inhibaient également les effets biologiques in vivo. Les souris traitées avec ces composés étaient entièrement protégées des lésions hémorragiques causées par de tels venins. Mais, seul le B. l’activité induisant l’œdème de jararaca a été neutralisée par les triazoles. Ainsi, l’effet inhibiteur des dérivés des triazoles contre certains dosages biologiques in vitro et in vivo de venins de serpent indique des aspects prometteurs qui peuvent les indiquer comme modèles moléculaires pour améliorer la production d’antivenins efficaces ou pour compléter la neutralisation des antivenins, en particulier les effets pathologiques locaux, qui sont partiellement neutralisés par les antivenins.

1. Introduction

Les venins de serpent sont des mélanges complexes de protéines comprenant des enzymes (métalloprotéinases, sérine protéinases, phospholipases A2 et L-acide aminé oxydase) et des protéines sans activité enzymatique, telles que des désintégrines, des lectines de type C, des toxines de protéines sécrétrices riches en cystéine (CRISP), des peptides natriurétiques et des myotoxines. Les vipères venimeuses Bothrops jararaca et Lachesis muta sont responsables d’accidents impliquant des humains dans plusieurs régions d’Amérique du Sud. Alors que B. jararaca se trouve dans le sud du Brésil, le Paraguay et le nord de l’Argentine, L. muta est distribué dans les forêts équatoriales à l’est des Andes, allant de l’est de l’Équateur, de la Colombie, du Pérou, du nord de la Bolivie et de l’est et du nord du Venezuela, au Guyana, à la Guyane française, au Surinam et au nord du Brésil. Dans leur aire de répartition, ils sont souvent abondants et sont une cause importante de morsures de serpent. L’envenimation par ces serpents est principalement caractérisée par des effets systémiques (saignements généralisés, coagulopathie, insuffisance rénale et choc) et locaux (hémorragie, œdème et nécrose). Comme indiqué ailleurs, les morsures de serpents constituent un problème de santé publique en Amérique latine et dans d’autres pays tropicaux et subtropicaux, dans lesquels elles sont considérées comme un problème de santé négligé, selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS). En Amérique du Sud, B. jararaca induit une incidence de piqûres plus élevée (95%) que L. muta (environ 2%); cependant, les piqûres de L. muta entraînent généralement des symptômes d’envenimation plus graves et son incidence de létalité est trois fois plus élevée que B. jararaca. De nos jours, l’administration parentérale d’antivenin d’origine animale est le seul traitement spécifique de l’envenimement par les morsures de serpent. Au Brésil, l’administration intraveineuse d’antivenin polyvalent Bothrops est utilisée pour traiter les cas envenimants causés par les piqûres de Bothrops ou le sérum bothropic-lachétique polyvalent pour les morsures de serpents L. muta et Bothrops (B. atrox) dans les régions amazoniennes. Comme indiqué ci-dessus, les envenimements modérés à sévères infligés par les serpents Bothrops et Lachesis sont caractérisés par une série complexe d’altérations locales et systémiques telles qu’une hémorragie, une myonécrose, une coagulopathie, un choc cardiovasculaire, une insuffisance rénale et éventuellement la mort. Comme l’ont rapporté d’autres auteurs, malgré leur innocuité, des doses élevées d’antivenins parfois utilisées au Brésil pour traiter des patients présentant une envenimation Bothrops / Lachesis avérée ou suspectée peuvent contribuer à des réactions de type anaphylactique précoce et tardive (maladie sérique). Ainsi, la production d’antivenins de qualité adéquate représente un défi considérable. De plus, les prix des antivenins ont augmenté et certains pays ont arrêté leur fabrication. Certains antivenins neutralisent efficacement les effets toxiques systémiques du venin; cependant, les effets locaux ne sont pas bloqués et cette situation peut entraîner une amputation ou une invalidité.

En raison de ces problèmes, des traitements alternatifs ont été recherchés et certains d’entre eux ont impliqué la recherche de nouvelles molécules capables de neutraliser les effets systémiques et locaux des venins. Des extraits de plantes et d’autres sources naturelles (comme ceux d’organismes marins) ont été testés pour leur capacité à neutraliser divers effets biologiques et toxiques des venins de serpent. Diverses molécules pharmacologiquement actives ont été identifiées et de nombreux effets ont déjà été répertoriés pour elles, y compris leur capacité antivenimeuse. De nos jours, de nombreuses nouvelles approches de bioprospection sont à l’étude. Cependant, à cet égard, il convient de noter que les effets biologiques des molécules issues de la synthèse organique n’ont pas encore été bien explorés. La littérature a décrit le composé 1,2,3-triazole comme une classe importante de système hétérocyclique azoté à cinq membres qui présente différents profils pharmacologiques, tels qu’une activité antiplaquettaire, anticlotante, antivirale, trypanocide, antimicrobienne et / ou leur utilisation dans le traitement de la schizophrénie et de la leishmaniose. Deux méthodes générales sont disponibles pour la construction de cycles 1,2,3-triazole : les réactions de cycloaddition 1,3-dipolaire de Huisgen, en particulier la cycloaddition catalysée par le cuivre (I), et l’électrocyclisation 1,5-intramoléculaire de composés α-diazocarbonyles β-substitués. Nos études antérieures ont montré que six nouveaux composés synthétiques du 1,2,3-triazole (1-arylsulfonylamino-5-méthyl-1H–esters éthyliques de l’acide triazole-4-carboxylique) inhibaient l’hémolyse induite par le venin de L. muta. En fait, ces dérivés présentaient un large éventail d’activités pharmacologiques.

Le but de ces travaux était d’évaluer la capacité de ces six dérivés du 1,2,3-triazole à base de –1-(p-chlorophényl)-1H–triazole-4-carbohydrazide contre les activités in vivo et in vitro des venins Bothrops jararaca et Lachesis muta.

2. Matériel

2.1. Venin et matériel

Bothrops jararaca, venins lyophilisés Lachesis muta et antivenin anti-Lachèse ou anti-Bothropique ont été fournis par Fundação Ezequiel Dias, Belo Horizonte, MG, Brésil, et stockés à -20 ° C jusqu’aux dosages. Le diméthylsufoxyde (DMSO), le fibrinogène bovin et l’azocaséine ont été obtenus à partir de Sigma Chemical Co. Tous les autres réactifs étaient de la meilleure qualité disponible.

2.2. Dérivés synthétiques

Les six dérivés d’esters éthyliques de l’acide 1-arylsulfonylamino-5-méthyl-1H- triazole-4-carboxylique ont été synthétisés selon notre rapport précédent et leurs structures chimiques sont illustrées à la figure 1. Ces composés ont été dissous dans du diméthylsufoxyde (DMSO) et stockés à 4 °C, jusqu’à ce que cela soit nécessaire.

Figure 1

Structures chimiques des six dérivés des 1,2,3-triazoles N’–1-(p-chlorophényl) -1H–triazole-4-carbohydrazide. Les six dérivées ont été conçues comme des nombres, comme indiqué entre parenthèses après chaque dérivée.

2.3. Animaux

Souris BALB/c (18-20 g) ont été obtenues auprès du Núcleo de Animais de Laboratório (NAL) de l’Université fédérale Fluminense. Les animaux ont été logés dans des conditions contrôlées de température (°C) et de lumière. Des expériences ont été approuvées par le Comité Institutionnel de l’UFF pour l’Éthique dans l’Expérimentation Animale (protocole numéro 297) qui étaient conformes aux directives du Comité Brésilien pour l’Expérimentation Animale (COBEA) et aux lois et politiques internationales.

3. Méthodes

3.1. Inhibition de l’hémolyse indirecte

Le degré d’hémolyse causé par les venins de L. muta et de B. jararaca a été déterminé par le test hémolytique indirect en utilisant des érythrocytes humains et une émulsion de jaune d’œuf de poule comme substrat. La quantité de L. muta et B. le venin de jararaca (µg / mL) qui a produit une hémolyse à 100% a été désigné comme dose hémolytique indirecte minimale (MHIM). Des expériences inhibitrices ont été réalisées en incubant des dérivés du triazole avec un MIHD pendant 30 minutes à température ambiante, puis l’activité hémolytique a été évaluée. Des expériences de contrôle ont été réalisées en incubant des venins avec du DMSO ou une solution saline.

3.2. Activité anticlotante

L’activité de coagulation des venins de L. muta et de B. jararaca a été déterminée à l’aide d’un coagulomètre numérique Amelung, modèle KC4A (Labcon, Allemagne). Différentes concentrations de L. le venin de muta (10 µg/mL) et de B. jararaca (40 µg/mL) a été mélangé à une solution de fibrinogène bovin (2 mg/mL) ou à du plasma humain, et la quantité de venin qui a coagulé soit du fibrinogène, soit du plasma en 60 secondes a été désignée comme dose minimale de coagulant (MCD). Pour évaluer leur effet inhibiteur, les dérivés du triazole ont été incubés pendant 30 minutes à température ambiante avec un MCD de venins, puis le mélange a été ajouté au fibrinogène ou au plasma et le temps de coagulation enregistré. Des expériences témoins ont été réalisées en parallèle en ajoutant du DMSO ou une solution saline incubée avec des venins, au lieu des triazoles.

3.3. L’activité antiprotéolytique

Des venins de L. muta et de B. jararaca a été déterminée en utilisant l’azocaséine comme substrat (0,2 % p/v, dans du Tris-HCl de 20 mM, du CaCl2 de 8 mM, pH 8,8), avec des modifications mineures. Une concentration efficace (CE) a été définie comme la quantité de venin (µg/mL) capable de produire une variation à 420 nm d’environ 0,2. Les dérivés du triazole ont été incubés avec un EC de venin pendant 30 minutes à température ambiante puis la protéolyse a été mesurée. Des expériences de contrôle ont été réalisées en incubant des venins avec du DMSO ou une solution saline.

3.4. Activité antihémorragique

Les lésions hémorragiques produites par les venins de L. muta et B. jararaca ont été quantifiées à l’aide d’une procédure décrite par Kondo et al. , avec des modifications. Brièvement, des échantillons ont été injectés par voie intradermique (i.d.) dans la peau abdominale de souris. Deux heures plus tard, les animaux ont été euthanasiés par décapitation, la peau abdominale enlevée, étirée et inspectée pour détecter des modifications visuelles de l’aspect interne afin de localiser les taches hémorragiques. L’hémorragie a été quantifiée comme la dose hémorragique minimale (MHD), définie comme la quantité de venin (mg/ kg) capable de produire un halo hémorragique de 10 mm. L’effet inhibiteur des dérivés du triazole a été étudié en incubant des composés avec deux MHD de venin de L. muta ou de B. jararaca pendant 30 minutes à température ambiante, puis le mélange a été injecté à des souris et l’hémorragie a été mesurée. L’activité hémorragique a été exprimée par le diamètre moyen (en millimètre) du halo hémorragique induit par les venins en l’absence et en présence des dérivés du triazole. Des expériences de contrôle négatif ont été réalisées en injectant du DMSO ou une solution saline.

3.5. L’activité antiédématogène

L’activité induisant un œdème des venins de L. muta et de B. jararaca a été déterminée selon Yamakawa et al. , avec des modifications. Des groupes de cinq souris ont été injectés par voie sous-cutanée (c.s.) dans le coussinet du pied droit avec 50 µL de venin, tandis que le coussinet alimentaire gauche a reçu 50 µL de solution saline. Une heure après l’injection, l’œdème a été évalué et exprimé en pourcentage d’augmentation du poids du coussinet du pied droit par rapport au coussinet gauche. L’effet inhibiteur des dérivés du triazole a été étudié en incubant des composés avec du venin de L. muta ou de B. jararaca pendant 30 minutes à température ambiante, puis le mélange a été injecté à des souris (coussinet du pied droit) et l’œdème a été mesuré.

3.6. Les résultats de l’analyse statistique

sont exprimés en moyennes ± SEM obtenues avec le nombre indiqué d’animaux ou d’expériences réalisées. La signification statistique des différences entre les groupes expérimentaux a été évaluée à l’aide du test de Student. Une valeur ≤ 0,05 a été considérée comme significative.

4. Résultats et discussion

Le développement d’antivenins efficaces, sûrs, moins chers et plus accessibles mérite l’attention, car les morsures de serpents peuvent causer de graves handicaps et tuer des milliers de personnes. Un nombre croissant d’études ont été axées sur la recherche d’inhibiteurs des venins de serpent provenant de diverses sources, qu’elles soient naturelles ou synthétiques. La suramine et le benzoate de benzoyle phényle sont des molécules synthétiques capables d’inhiber la myotoxicité, la coagulation et les activités de la phospholipase A2 et de la hyaluronidase des venins de serpent de différentes familles. Des analogues de lactone ont été synthétisés et ont inhibé la myotoxicité, ainsi que les activités induisant un œdème et enzymatiques induites par une phospholipase A2 isolée de B. jararacussu. D’autre part, les principes bioactifs marins ont également attiré l’attention en raison de leurs actions pharmacologiques largement répandues.

Dans ce travail, il a été évalué la capacité de six esters éthyliques d’acide 1-arylsulfonylamino-5-méthyl-1H–triazole-4-carboxylique à neutraliser certaines activités in vitro (hémolyse, coagulation et protéolyse) et in vivo (hémorragie et induisant un œdème) causées par B. jararaca et L. venins muta, puisque les résultats précédents indiquaient que ces six dérivés inhibaient l’hémolyse induite par le venin de L. muta, mais avec des puissances différentes. Pour cette raison, on a pensé qu’il serait utile d’étudier les actions de ces dérivés sur d’autres activités biologiques importantes liées aux morsures de serpent, telles que la protéolyse, la coagulation, l’hémolyse, l’hémorragie et l’œdème. Il a été montré que ces composés inhibaient l’hémolyse provoquée par le venin de B. jararaca (50 µg/mL) et de L. muta (15 µg/mL) (Figure 2(a)). Le pourcentage inhibiteur des dérivés était supérieur à 50% contre les deux venins. Cependant, une légère différence sur le profil inhibiteur a été observée pour le dérivé 6, où une inhibition de 50% et 90% de l’hémolyse a été obtenue pour le venin de B. jararaca et de L. muta, respectivement. Ni les dérivés ni le DMSO n’ont conduit les érythrocytes à l’hémolyse, ni le DMSO n’a interféré dans le degré d’hémolyse causé par les venins.

(a)

(d)

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Figure 2

Effet des dérivés sur l’hémolyse et la protéolyse. Les dérivés 1-6 (45 µM) ont été incubés avec B. jararaca (colonnes sombres) ou avec L. muta (colonnes pointillées) pendant 30 minutes à température ambiante, puis des activités hémolytiques (a) et protéolytiques (b) ont été réalisées. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM des expériences individuelles ().

L’envenimation par ces morsures de serpent produit une hémorragie sévère due à la teneur élevée en métalloprotéase dépendante du zinc ou en protéase sérine qui digère les composants protéiques de la matrice extracellulaire ou consomme des facteurs de coagulation du sang. B. jararaca et L. le venin muta hydrolysait l’azocaséine de manière dépendante de la concentration avec une EC de 20 µg/mL et 6 µg/mL, respectivement (données non représentées). Les dérivés inhibent la protéolyse induite par B. jararaca ou L. muta (Figure 2(b)). Les dérivés 1, 2, 3 et 6 inhibent la protéolyse induite par les deux venins jusqu’à 80 % et le dérivé 5 inhibe une telle activité inférieure à 50%. Une différence marquée sur le profil inhibiteur des dérivés a été observée pour le dérivé 4, dans lequel il inhibait respectivement 97% et 25% de la protéolyse induite par le venin de B. jararaca ou de L. muta (Figure 2(b)).

Comme on le voit sur la figure 3, les dérivés 1, 2, 4, 5 et 6, mais pas le dérivé 3 inhibent de manière dépendante de la concentration (23-94 µM), la coagulation du fibrinogène induite par les venins de B. jararaca (40 µg/mL) ou de L. muta (10 µg/mL). Il semble que les dérivés inhibent plus efficacement la coagulation induisant L. muta que B. jararaca. À la concentration la plus élevée (94 µM), les dérivés 1, 2, 3, 5 et 6 ont empêché la coagulation de L. muta (Figure 3(b)), tandis que les dérivés 2 et 6 ont empêché le B. jararaca une fois (Figure 3 (b)). À des concentrations allant jusqu’à 200 µM, tous les dérivés du 1,2,3-triazole ont efficacement empêché la coagulation du fibrinogène causée par les deux venins, mais à des concentrations inférieures à 10 µM, aucun de ces composés n’a empêché la coagulation. Cependant, lorsque les dérivés (10 µM) ont été mis tous ensemble et incubés avec du venin de B. jararaca ou de L. muta, le temps de coagulation a été retardé de deux fois. On a remarqué que, si le dérivé 2 ou 6 était retiré du mélange, aucun effet inhibiteur sur la coagulation n’était observé. De plus, les dérivés empêchaient également la coagulation induite par les venins lors de l’utilisation du plasma. Ni le DMSO (1% v / v, concentration finale) ni la solution saline n’interféraient avec les processus de coagulation.

(a)

(d)

(a)
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Figure 3

Effet des dérivés sur la coagulation du fibrinogène. Vingt-trois dérivés µM (colonnes grises), 46 µM (colonnes blanches) ou 94 µM (colonnes noires) ont été incubés avec 40 µg/mL de B. jararaca (a) ou avec 10 µg/mL de L. muta (b) pendant 30 min à température ambiante. Ensuite, le mélange a été ajouté au fibrinogène (2 mg / mL) et le temps de coagulation a été enregistré. Les venins ont été incubés avec une solution saline (C1); du DMSO à 1% v/ v (C2); le dérivé 1 (colonne 1); le dérivé 2 (colonne 2); le dérivé 3 (colonne 3); le dérivé 4 (colonne 4); le dérivé 5 (colonne 5); et avec le dérivé 6 (colonne 6). # signifie que le fibrinogène n’a pas coagulé avant 600 secondes d’observation. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM des expériences individuelles ().

L’injection intradermique de venin de B. jararaca (12 mg/Kg) ou de L. muta (20 mg/Kg) a produit un halo hémorragique de 20 mm chez la souris. Un tel halo représente deux MHD de venins. Lorsque chaque venin a été mélangé à des dérivés (90 µM) puis injecté à des souris, une protection complète contre l’hémorragie a été observée (données non montrées). En revanche, les résultats précédents ont montré que le sérum antiaquétique n’inhibait pas l’hémorragie induite par le venin de L. muta. L’injection de DMSO, de dérivés ou de solution saline n’a pas produit d’hémorragie. L’œdème induit est un autre effet important qui suit la morsure de serpent. La figure 4 montre que l’œdème induit par 5 mg/ Kg de B. jararaca (Figure 4(a)) ou 8 mg/ Kg L. muta (Figure 4(b)) a été significativement réduit par les dérivés (90 µM). Les dérivés du triazole 1, 2 et 4 inhibent à plus de 80% l’œdème induit par B. jararaca, tandis que les dérivés 3, 5 et 6 inhibent environ 70 % (Figure 4(a)). Comme on l’a vu, tous les dérivés inhibaient moins l’activité œdématogène induite par L. muta (Figure 4(b)).

(a)

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Figure 4

Effet des dérivés sur l’activité induisant un œdème. Les dérivés (90 µM) ont été incubés avec 5 mg/Kg de B. jararaca (a) ou avec 8 mg/Kg de L. muta (b) pendant 30 minutes à température ambiante, puis une activité induisant un œdème a été réalisée. Les colonnes sont le dérivé 1 plus le venin (1); le dérivé 2 plus le venin (2); le dérivé 3 plus le venin (3); le dérivé 4 plus le venin (4); le dérivé 5 plus le venin (5) et le dérivé 6 plus le venin (6). Les données sont exprimées en moyenne ± SEM des expériences individuelles ().

En conclusion, les dérivés d’esters éthyliques de l’acide 1-arylsulfonylamino-5-méthyl-1H- triazole-4-carboxylique peuvent être utiles comme prototypes pour concevoir de nouvelles molécules afin d’améliorer le traitement actuel utilisé pour les morsures de serpents de B. jararaca et de L. muta. Le pouvoir inhibiteur de ces dérivés peut varier ou être amélioré lorsqu’ils ont été mis tous ensemble, agissant probablement en synergie. Ainsi, une concentration plus faible d’entre eux serait nécessaire pour parvenir à une neutralisation complète des effets biologiques causés par les venins de B. jararaca et de L. muta. En outre, une analyse antérieure de la relation structure-activité des dérivés a déjà été effectuée. Les dérivés ont été soumis à l’analyse de la « règle de cinq de Lipinski » qui indique qu’une molécule chimique pourrait être un médicament actif par voie orale chez l’homme et une telle règle stipule qu’une molécule violant deux des règles suivantes est susceptible d’être mal absorbée: (1) poids moléculaire inférieur à 500 Da, (2) nombre de donneurs de liaison hydrogène (groupes OH ou NH) égal ou inférieur à 5, (3) nombre d’accepteurs de liaison hydrogène inférieur à 10, et enfin (4) calculé inférieur à 5. Les résultats ont montré que tous les dérivés remplissaient cette règle (poids moléculaire = 296,31-341,30; 2,6-3,4; nHBA = 8-11 et nHBD = 1-3) indiquant une bonne biodisponibilité théorique.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation Internationale pour la Science (Subvention F/4571-1 de l’FS) et par les agences de financement brésiliennes suivantes: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro Carlos Chagas Filho (Faperj), Coordinação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (capes) et Universidade Federal Fluminense / pró-recitoria de Pesquisa e Pós-graduação e Inovação (Uff / PROPPi).