La Bêta-cyfluthrine formulée présente une grande divergence de toxicité parmi les espèces d’oiseaux

Résumé

On suppose généralement que la toxicité des insecticides pyréthroïdes pour les oiseaux est négligeable, bien que peu d’espèces aient été testées. La toxicité aiguë orale de la bêta-cyfluthrine formulée a été déterminée chez les canaris (Serinus sp.), des vacher brillants (Molothrus bonariensis) et des tourterelles à oreilles (Zenaida auriculata). Des doses uniques ont été administrées aux adultes par gavage. Les doses létales approximatives 50 () et leurs intervalles de confiance ont été déterminés par une conception D-optimale approximative. Les Canaris se sont révélés nettement plus sensibles à la bêta-cyfluthrine formulée (mg/kg) que les deux autres espèces testées (mg/kg et mg/kg, resp.). Les valeurs obtenues pour les canaris étaient également considérablement inférieures aux valeurs de toxicité typiques disponibles dans la littérature pour les pyréthroïdes. Cette étude souligne la nécessité de tester un plus large éventail d’espèces avec des insecticides potentiellement toxiques, en utilisant des conceptions modernes d’essai ascendant et descendant avec un nombre minimal d’oiseaux.

1. Introduction

L’utilisation généralisée des pesticides contribue au déclin des populations et à la mortalité des oiseaux dans les agroécosystèmes. Parmi les diverses catégories de pesticides, les insecticides présentent généralement un risque plus élevé d’effets aigus en raison de leur toxicité inhérente élevée et de leur potentiel d’exposition élevé. Les cas documentés de mortalité massive par intoxication et les diverses études faisant état d’effets négatifs des insecticides sur les oiseaux sont des preuves évidentes du risque que posent les insecticides sur les espèces d’oiseaux sauvages (p. ex.). Un cas de mortalité massive d’oiseaux qui a fait l’objet d’une grande attention en Argentine a été la mortalité de la buse de Swainson en 1995-1996 causée par le monocrotophos, un insecticide organophosphoré. Après cet événement, l’enregistrement des monocrotophos a été annulé en Argentine tandis que les insecticides pyréthroïdes ont gagné en importance et en popularité.

Parmi les insecticides, les pyréthroïdes sont une classe d’insecticides synthétiques neurotoxiques largement utilisés en raison de leur sécurité relative pour les mammifères et les oiseaux, de leur puissance insecticide élevée à de faibles doses et de leur biodégradation rapide. Les canaux sodiques de l’axone des insectes sont 100 fois plus sensibles aux esters pyréthroïdes que les canaux des mammifères. Pour ces raisons, les pyréthroïdes ont progressivement remplacé les insecticides organochlorés, organophosphorés et carbamates sur le terrain. Plusieurs études sur les pyréthroïdes ont été menées sur des vertébrés (p. ex.), la majorité sur des rongeurs (p. ex.). La neurotoxicité des pyréthroïdes pour les mammifères dépend de la configuration stéréochimique et de la structure des pyréthroïdes. En revanche, on sait peu de choses sur la toxicité des pyréthroïdes pour les oiseaux, probablement parce que cette classe d’insecticides est généralement considérée comme ayant une toxicité négligeable pour les oiseaux.

Bêta-cyfluthrine (cyano-(4-fluoro-3-phenoxyphenil)-methyl-3-(2,2-dichloroethenyl)-2,2-dimethyl-cyclopropanecarboxylate ) est l’ingrédient actif des formulations insecticides utilisées pour lutter contre une grande variété de ravageurs sur les cultures de coton, de maïs, de tournesol et de soja. Comme d’autres pyréthrinoïdes, la bêta-cyfluthrine présente une interaction stéréosélective avec une fraction des canaux sodiques des membranes neuronales, ce qui entraîne une prolongation des courants de sodium vers l’intérieur évoqués dans les neurones par chaque impulsion entrante de stimulation excitatrice. La bêta-cyfluthrine est un mélange de quatre diastéréomères, les diastéréomères II et IV prédominant et déterminant les propriétés chimiques et physiques de la substance. La bêta-cyfluthrine est un pyréthroïde de type II, avec un groupe cyano caractéristique sur le carbone alpha. Les pyréthroïdes de type II présentent une plus grande efficacité insecticide et une toxicité plus élevée que les pyréthroïdes de type I. Les esters de type II maintiennent le canal sodique ouvert pendant une période de temps plus prolongée que les esters de type I. Les principaux signes d’intoxication des pyréthroïdes de type II chez les mammifères comprennent la choréoathétose et la salivation (CS).

La DL50 de la bêta-cyfluthrine rapportée aux oiseaux dans le Manuel des pesticides est > 2000 mg/kg chez la caille japonaise. L’EPA dans sa base de données  » ECOTOX  » (http://cfpub.epa.gov/ecotox/) donne la même valeur, mais associée au bobwhite du Nord. Pourtant, des informations non publiées citées dans un rapport sans détails sur le véhicule ou la formulation ont donné une DL50 de ca. 100 mg / kg pour la bêta-cyfluthrine aux Canaries ainsi que les valeurs plus habituelles pour le canard blanc et le canard colvert de > 2000 mg/ kg. Cette valeur pour les Canaries, si elle est réelle, jette des doutes sur la sagesse générale selon laquelle les pyréthroïdes sont non toxiques pour les oiseaux. La présente étude avait pour corroboration objective et indépendante de la DL50 de la bêta-cyfluthrine aux Canaries et déterminait la toxicité orale aiguë de la bêta-cyfluthrine formulée commercialement pour deux espèces nouvelles et sauvages, le vacher brillant (Molothrus bonariensis) et la tourterelle à oreilles (Zenaida auriculata).

2. Matériaux et méthodes

2.1. Site et Conditions Générales d’étude

L’étude a été réalisée dans les installations de recherche de l’INTA (Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria) à la Station Expérimentale Agricole du Paraná (31°50’53 » S, 60°32’19 » W). L’étude a été réalisée dans une volière de 20 × 10 m, comprenant une zone d’acclimatation avec 6 groupes d’enclos (chacun de 3 × 2 × 3 m) et 24 cages d’essai individuelles (chacune de 0,5 × 0,5 × 0,5 m). La photopériode et la température moyenne de la salle d’essai pendant le dosage ont été enregistrées (tableaux 2 et 3). La ventilation a été contrôlée de manière à maintenir les conditions intérieures de température et d’humidité dans les plages environnementales extérieures.

2.2. Sélection, capture et logement des oiseaux

Les oiseaux sauvages, les vachers brillants et les colombes à oreilles ont été sélectionnés en fonction de leur grand nombre dans les champs environnants, ce qui a assuré leur disponibilité, leur abondance et leur succès de capture. Les oiseaux de vache brillants ont été capturés avec des filets de brume et des colombes à oreilles avec des pièges à appâts. Des canaris élevés en captivité ont été utilisés. Les oiseaux adultes en bonne santé ont été pondérés et regroupés par sexe avant d’être acclimatés à des conditions expérimentales pendant au moins 14 jours. Au moins trois perchoirs de 1,5 m ont été placés dans chaque enclos. Les cowbirds brillants ont reçu de la nourriture commerciale certifiée insectivore, les colombes à oreilles ont reçu un mélange de graines de blé et de tournesol, et les canaris, un mélange de graines commerciales et un œuf moulu. L’eau embouteillée destinée à la consommation humaine était offerte ad libitum à toutes les espèces. En raison de l’absence d’un comité de protection des animaux constitué à l’INTA ou à l’université locale (Universidad Nacional del Litoral) qui assurait la supervision académique de cette recherche, les directives du Denver Wildlife Research Center du département américain de l’Agriculture ont été suivies pour la capture, le transport, le logement, les soins, l’euthanasie et la nécropsie des oiseaux, en plus d’autres procédures de l’étude.

2.3. Produit chimique et dose

Pour obtenir les doses test (mg de bêta-cyfluthrine / kg de poids corporel), nous avons utilisé une formulation commerciale (Bulldock de Bayer CropScience), une suspension de 12,5 g par an / 100 mL d’ingrédients inertes non déclarés. Nous avons supposé que la concentration indiquée sur l’étiquette était correctement signalée et que le volume nécessaire de produit formulé correspondant à la dose requise de bêta-cyfluthrine était administré aux oiseaux. Il est connu que la toxicité des pyréthroïdes peut être fortement influencée par le véhicule de dosage. Les oiseaux sauvages étant exposés à des produits formulés, nous avons choisi de tester la formulation sans véhicule supplémentaire si possible et avec de l’eau distillée comme diluant pour plusieurs doses pour les canaris (voir dilutions dans les notes de bas de page du tableau 3). Les doses

ont été calculées selon des équations standard pour chaque étape de la conception D-optimale approximative, en milligrammes d’i.a. par kilogramme de poids corporel, comme indiqué dans le tableau 3. Les volumes de dosage ont été calculés sur la base du poids corporel individuel mesuré dans les 12 heures suivant l’administration (tableau 1). Pour éviter la régurgitation, les volumes de dose les plus élevés (> 0,17 mL pour les canaris, > 0,45 mL pour les cow-birds brillants et > 1,0 mL pour les colombes à oreilles) ont été divisés et administrés en jusqu’à quatre aliquotes séparées de 15 minutes. Cette administration fractionnée des doses a eu lieu pour toutes les espèces dans l’essai limite, un canari dans la première étape de l’essai complet et tous les oiseaux de vache brillants et les tourterelles à oreilles dans toutes les étapes de l’essai complet (tableau 1). Les volumes de dose n’ont jamais dépassé 16 mL/kg P.C. (poids corporel) chez les canaris, 27 mL/kg P.C. chez les oiseaux-vaches brillants et 26 mL/kg P.C. chez les colombes à oreilles. Le produit chimique d’essai formulé a été administré par gavage. Le cathéter a été lubrifié avec de la vaseline pour diminuer l’inconfort possible lors de son introduction. Les personnes qui ont régurgité une partie ou la totalité d’une dose et qui ont survécu à la dose ont été remplacées par d’autres en raison du fait que la régurgitation modifie la dose et empêche l’approximation correcte de la DL50. Quarante-six pour cent des vachers brillants, 33% des tourterelles à oreilles et 16% des canaris régurgitaient, bien qu’ils soient à jeun avant la dose.

2.4. Procédure

Des essais de toxicité orale aiguë ont été effectués conformément au projet de directive 223 de l’Organisation de Coopération et de développement économiques. Cette procédure minimise le nombre d’oiseaux utilisés et permet une validation statistique approfondie.

Tout d’abord, cinq individus de chaque espèce ont été traités avec une dose limite de 2000 mg/kg de produit chimique d’essai. Après toute mortalité à cette dose limite, la DL50 a été estimée par étapes séquentielles avec le plan approximatif D-optimal (essai complet; Figure 1). Aux Canaries, la première étape du test complet a été réalisée pour confirmer et améliorer l’estimation initiale de la DL50 canarienne (250 mg / kg, sur la base de la valeur de la littérature susmentionnée et du résultat d’un test limite). Une étape supplémentaire a été ajoutée pour obtenir un plus grand niveau de précision.

(a)

(d)

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Figure 1

Schéma de la méthodologie utilisée.

Les oiseaux ont été assignés au hasard à chaque test et ont été observés pendant 14 jours après la dose. La mortalité, les symptômes cliniques, le changement de poids entre le début et la fin de l’étude, les régurgitations, le temps de décès (en heures) et la récupération ont été enregistrés.

Les animaux d’essai et les animaux témoins ont été examinés par nécropsie pour déterminer les différences macroscopiques. La taille, la position et l’apparence de tous les organes et du tractus gastro-intestinal complet ont été examinées. De plus, des foies et des cœurs ont été pesés et leurs poids relatifs calculés (1), afin de détecter toute pathologie associée à une perte ou une augmentation de masse de ces organes (hépatomégalie, nécrose, hypertrophie, etc.).

2.5. Analyse statistique

Nous adaptons un modèle probit aux données combinées de toutes les étapes (STAT-SAS 6.1) pour obtenir les estimations de la DL50, les confidences des intervalles de confiance et les pentes des courbes dose-réponse. Les poids corporels initiaux et finaux et les poids relatifs des cœurs et des foies ont été comparés par ANOVA unidirectionnelle en utilisant SPSS v.10 pour Windows.

3. Résultats

3.1. Essais limites

Les estimations initiales de la DL50 obtenues pour les essais limites étaient de 2247 mg/kg pour les deux espèces, à la fois pour les vachers brillants et les colombes à oreilles, car 40 % des individus sont morts chez les deux espèces. En revanche, tous les canaris traités sont morts et il était donc impossible d’obtenir une estimation initiale de la DL50 avec le test limite (tableau 2).

3.2. Test complet

Chez les canaris, les valeurs de DL50 estimées à chaque étape séquentielle étaient respectivement de 68 mg/ kg, 110 mg/ kg et 170 mg/ kg. Au cours de l’étape supplémentaire (similaire à la troisième étape, réalisée afin de diminuer les intervalles de confiance de la DL50), deux des quatre personnes ayant reçu la dose la plus élevée ont régurgité et, pour cette raison, elles n’ont pas été incluses dans les résultats. Pour les vacher brillants et les tourterelles à oreilles, bien que les doses administrées au deuxième stade soient les mêmes en raison de résultats similaires dans le test limite, la mortalité était différente (tableau 3). Les estimations de la DL50 après la deuxième étape étaient respectivement de 1 589 mg/kg et de 2 338,6 mg/kg pour les vacher brillants et les tourterelles à oreilles. Les estimations finales de la DL50, obtenues en ajustant un modèle probit aux données combinées de tous les stades pour chaque espèce, étaient de 170 ± 41 mg/kg pour les canaris, de 2234 ± 544 mg/kg pour les vachers brillants et de 2271 ± 433 mg/kg pour les tourterelles à oreilles. Les courbes dose-réponse sont représentées à la figure 2.

Figure 2

Courbes dose-réponse.

Les signes cliniques comprenaient une apparence ébouriffée, une salivation (attestée par des mouvements de déglutition constants et des tremblements de la tête), une diminution de l’activité, une prostration, un halètement, une respiration laborieuse, des tremblements corporels, une perte d’équilibre et / ou des convulsions. Les signes sont apparus peu de temps après l’administration et ont duré de quelques minutes à quelques heures. Il y avait des doses qui ne produisaient pas de signes cliniques et d’autres qui permettaient la récupération de personnes présentant des signes d’intoxication, y compris des convulsions (tableaux 2 et 3). Toutes les récupérations ont eu lieu dans les 24 premières heures suivant la posologie. Les pondérations prédose et postdose à 14 jours sont données dans le tableau 4. Il n’y a pas eu de différences significatives entre le poids corporel des survivants avant l’administration et 14 jours après la dose, sauf pour les canaris dans la troisième étape de l’essai complet où les poids postdose de 14 jours étaient plus élevés que les poids avant l’administration (). La durée maximale de la mort était de 1.75 heures chez les canaris, 3 heures chez les colombes à oreilles et 5 heures chez les vachers brillants. Seuls les canaris ont montré une tendance à un temps de mort plus court avec une dose croissante (figure 3).

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(d)

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Figure 3

Heure du décès en fonction de la dose (seules les doses ayant causé le décès sont indiquées).

Tous les oiseaux morts présentaient une raideur des membres antérieurs et postérieurs. Nous avons observé un liquide blanc épais dans différentes sections du tractus g.i., attribuable à la formulation de l’insecticide. Les différences macroscopiques entre les organes des personnes traitées et des personnes témoins n’ont pas été détectées. Les poids relatifs du cœur et du foie (et) ne variaient pas non plus (dans tous les cas).

4. Discussion

La DL50 que nous avons obtenue aux Canaries se rapproche de la valeur présentée dans le rapport sur la bêta-cyfluthrine de la Commission européenne, confirmant qu’elle est modérément toxique ou de classe II pour cette espèce. Les valeurs de DL50 pour la bêta-cyfluthrine formulée obtenues chez les oiseaux-vaches brillants (une autre espèce de passereau) et les tourterelles à oreilles sont proches des valeurs rapportées pour la caille blanche et la caille japonaise, confirmant que la bêta-cyfluthrine est pratiquement non toxique ou de classe III pour ces espèces. Un certain soin est nécessaire avant d’attribuer ces différences de sensibilité uniquement à la phylogénie. La variation des procédures de dosage pourrait avoir introduit une variation indésirable de nos résultats. Ceux-ci sont discutés en détail ci-dessous.

La sensibilité différente à la bêta-cyfluthrine entre les canaris et les autres oiseaux testés peut être due à des différences dans les caractéristiques des sites d’action toxique, l’absorption intestinale, le métabolisme et / ou l’élimination de cette substance. Par exemple, la faible toxicité aiguë de la cyperméthrine sur les cailles s’expliquait par une résistance élevée du SNC des cailles aux effets létaux de la cyperméthrine, un métabolisme plus étendu à un grand nombre de produits et une élimination rapide dans les excréments. Il est possible que des mécanismes physiologiques similaires se produisent chez les vachers brillants et les tourterelles à oreilles, ce qui explique leur faible sensibilité à la bêta-cyfluthrine. De plus, les différences significatives de sensibilité aux sites d’action toxique et les différences métaboliques ainsi que les différentes voies principales de détoxification et activités enzymatiques peuvent jouer un rôle majeur dans les réponses différentielles à ces insecticides. D’autre part, les différences de taille corporelle entre les trois espèces d’oiseaux incluses dans cette étude pourraient avoir influencé les résultats. D’après les recherches allométriques menées par Mineau et al. , la petite taille du canari par rapport aux deux autres espèces pourrait avoir contribué à la sensibilité plus élevée.

Des facteurs liés au cadre expérimental et à nos procédures auraient pu influencer les résultats de cette étude. Une relation entre la température et les effets toxiques des pyréthroïdes a été démontrée pour plusieurs groupes d’animaux, y compris les insectes, les amphibiens et les mammifères. Dans notre étude, des variations ont été notées dans les températures ambiantes au moment de chaque étape des tests (tableau 3). Cependant, même lorsque la variation était légèrement plus élevée dans le cas des vachers brillants, il est peu probable qu’elle ait influencé les résultats, car nous avons obtenu la DL50 grâce à des données combinées provenant d’étapes séquentielles avec des températures différentes. De plus, les volumes de dose variables et les administrations fractionnées peuvent avoir une variabilité accrue entre les animaux de laboratoire. Dans nos travaux, les canaris ont reçu un volume bien inférieur à celui utilisé pour les deux autres espèces (tableau 1). Wolansky et coll. a montré que l’augmentation de la quantité d’huile de maïs administrée avec une dose de bifenthrine, un autre pyréthroïde synthétique, modifiait le cours temporel et la puissance du pesticide chez le rat (une différence de puissance de deux fois a été observée pour une augmentation de 5 fois de l’huile de maïs). L’utilisation d’huile comme agent de dosage doit être évitée lorsque des pesticides hautement lipophiles sont testés. Nous espérons avoir évité ce problème en dosant avec la formulation soignée si possible, et donc en ne modifiant pas la concentration relative de pesticide dans la solution doseuse. La comparaison du nombre d’aliquotes (tableau 1) à la mortalité dans les tests (tableau 3) suggère que le régime posologique exact n’a probablement pas affecté les résultats de nos tests dans une large mesure. Enfin, comme nous avons testé un matériau formulé (avec des inertes inconnus) plutôt que le principe actif, nous ne pouvons pas déterminer avec certitude si le canari est plus sensible au principe actif ou à l’un des formulants. Cependant, la similitude avec la valeur citée pour l’a.i. par l’Union européenne et l’absence relative de toxicité des formulants chez les deux autres espèces (avec des DL50 similaires à celles obtenues chez la caille ou le colvert avec le principe actif seul) suggère des différences de sensibilité au pyréthroïde et non aux inertes inclus dans le matériau formulé.

Les symptômes cliniques observés en réponse à des doses élevées chez les trois espèces d’oiseaux sont en accord avec ceux décrits par Sheets et al. chez les rats traités par la bêta-cyfluthrine et ceux observés par Qadri et al. , qui a testé la perméthrine et la cyperméthrine chez les poulets. Ces symptômes consistaient en une diminution de l’activité, des tremblements dans tout le corps, une salivation, une respiration agitée, une posture aplatie et une choréoathétose. Les symptômes d’intoxication nerveuse ont été observés peu de temps après la prise et ont duré jusqu’à quelques heures, indiquant que l’élimination des pyréthroïdes du système nerveux est rapide. Les survivants de toutes les espèces n’ont pas montré de perte de poids corporel, du moins à la fin de la période d’observation de 14 jours (tableau 4). De plus, le poids corporel des canaris a considérablement augmenté au cours de la troisième étape du test complet. Singh et al ont observé une augmentation du poids corporel après un traitement aigu par la bêta-cyfluthrine sur des rats albinos. Ces auteurs postulent que l’augmentation du poids corporel peut être due à une consommation excessive de nourriture et d’eau et à une efficacité de conversion alimentaire accrue des groupes traités par rapport aux groupes contrôlés.

Tous les décès sont survenus dans les 24 heures suivant la dose, probablement parce que les niveaux maximaux dans le sang, le foie, les muscles et le cerveau sont atteints le premier jour de traitement. Les durées de mort chez les vacher brillants et les tourterelles à oreilles étaient assez similaires à celles obtenues avec le fenvalérate par Mumtaz et Menzer chez la caille japonaise (4 à 8 heures). La récupération rapide est une caractéristique de l’empoisonnement par les pyréthroïdes chez les mammifères. Chez les trois espèces d’oiseaux, même les individus ayant reçu des doses approchant la DL50 se sont rétablis rapidement (tableau 3). Pascual et coll. nous avons signalé une fréquence élevée de régurgitation chez les colombes, tout comme nous. Les régurgitations n’étaient pas aussi fréquentes aux Canaries, suggérant des différences dans leur capacité physiologique à régurgiter. Étant donné que les individus qui régurgitaient ont été remplacés par d’autres, les résultats n’ont pas été influencés par la régurgitation dans cette étude.

Des études aiguës et subaiguës ont montré que les pyréthroïdes à fortes doses provoquent une hypertrophie hépatique et, si la mort ne survient pas, ces changements se sont avérés réversibles. Néanmoins et comme dans Yavasoglu et al. , qui a travaillé avec la cyperméthrine chez le rat, le poids relatif du foie () — en tant que mesure indirecte des changements dans la santé ou la fonction du foie — n’a montré aucun effet de la dose. Bien qu’il existe des études in vitro sur les effets des pyréthroïdes sur le muscle cardiaque de rats et de cobayes, les effets associés à la perte ou à l’augmentation de la masse cardiaque n’ont pas été détectés ici.

En conclusion, bien qu’il y ait eu des facteurs qui ont peut-être exacerbé les différences de sensibilité au sein ou entre les espèces (p. ex., volumes de dose variables, schéma de dosage multiple, températures ambiantes variables, taille corporelle, etc.), la sensibilité élevée des canaris à la bêta-cyfluthrine a été corroborée. D’autre part, la bêta-cyfluthrine formulée s’est avérée pratiquement non toxique pour les oiseaux de vache brillants et les tourterelles à oreilles. Ces résultats soulignent la nécessité de tester un plus large éventail d’espèces avant de généraliser la toxicité des pyréthroïdes (et éventuellement d’autres pesticides) pour les oiseaux. Dans le cas de la bêta-cyfluthrine en particulier, bien que de faibles taux d’application soient généralement utilisés sur le terrain (7,5–20 g d’i.a. / ha selon Tomlin), il est nécessaire de considérer la variation potentielle de la toxicité de ce pesticide afin d’évaluer pleinement son innocuité pour les oiseaux. Dans le cas présent, une approche de la sensibilité aux espèces suggérerait que d’autres espèces d’oiseaux, en particulier les espèces de petits corps, montreront une sensibilité plus élevée aux pyréthroïdes. Des recherches futures sont nécessaires pour expliquer pourquoi les Canaries sont plus sensibles à la bêta-cyfluthrine, pour déterminer si les canaries sont également plus sensibles aux autres pyréthroïdes et, plus important encore, si les espèces sauvages apparentées phylogénétiquement aux Canaries présentent également une grande sensibilité aux pyréthroïdes.

Remerciements

Les auteurs remercient Environnement Canada et l’Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) qui ont financé et soutenu ce document. En outre, ils remercient le Dr Brian Collins pour sa collaboration statistique essentielle; le Dr Julie Brodeur pour son examen, le personnel de l’INTA et Natalia Bossel qui ont collaboré aux captures et à la fourniture de matériaux; Juan Carlos Reboreda, pour sa précieuse contribution à l’élevage de vacher brillant; les deux directeurs de l’AEE-Paraná en tant que Centre régional Entre Ríos, qui ont soutenu ce travail dans la Station expérimentale du Paraná; enfin, deux arbitres anonymes qui ont fourni des commentaires utiles sur des ébauches antérieures.