izolálás az endogén (6s)-5,6,7,8-tetrahidrofoláthoz kötött E. coli DHFR komplex kristályosításával
a tetrahidrofoláthoz kötött dihidrofolát-reduktáz szerkezete feltárja a az edhfr:FH4 bináris komplexet molekuláris helyettesítéssel határoztuk meg az edhfr:folát:NADP+ zárt ternáris komplex alkalmazásával (PDB id: 7dfr)50. Amint az ábrán látható. 2, a tiszta elektronsűrűség megerősíti a Ko-tisztított endogén ligandumot FH-ként4 az SP tetraéderes geometriája alapján3 C6 összhangban van egy 6s sztereoizomerrel. Ez ellentétben áll a trigonális sík geometriájával sp2 C6 egy fh2 bináris komplex hasonló kristályosodási körülményekből nyert.
Edhfr:FH4 (zöld, felső ábra) és eDHFR:fh2 (narancssárga, alsó ábra) komplexek ligandumszerkezetének összehasonlítása. A ligandumok körül körvonalazott fo-Fc elektronsűrűség-térképeket 3,0-on mutatjuk be 6db szint. A jobb oldali nézeteket az óramutató járásával ellentétes irányban, a függőleges tengely körül, a bal oldalon látható perspektívákból forgatjuk. Az FH4 és az FH2 botként jelenik meg. A C6 szénatom bíborvörös színű, és az FH4 és FH2 különböző hibridizációs állapotait bíborvörös mutató nyilak jelzik. Az összes többi Atom színe a következő: oxigén piros, nitrogén kék, szén zöld, narancssárga az FH4 és az FH2 esetében. A megtekintés egyszerűsége érdekében csak a nem hidrogénatomok jelennek meg
annak érdekében, hogy megértsük, miért kapjuk meg az FH4 komplexet, míg mások kudarcot vallottak, azonosítottuk, hogy a két különböző ligandum komplex (FH4 vs.FH2) eredete a kristály betakarításának időzítése, és így a kristály növekedésének időtartama. Egy időben természetesen tanulmány ábrán látható. 3, amely a kötött ligandum elektronsűrűségének változásait követi a kristálynövekedés különböző napjain, kiderült, hogy az FH4-FH2 bomlás (tükröződik az sp3-sp2 átmenet C6 helyzetben) körülbelül 2-3 nappal a kristályosodás után jött létre.
az FO–Fc időfolyamának sztereó nézetei kihagyják az elektronsűrűség-térkép változásait, amelyek megfelelnek az FH4 FH2-vé történő átalakításának. A ligandumok körül körvonalazott fo-Fc elektronsűrűség-térképeket 3,0-on mutatjuk be 6db szint. Az eDHFR:Az FH4 bináris komplex kristályokat sötétben, szobahőmérsékleten termesztettük. Minden időpontban egy független kristálycseppből egyetlen kristályt gyűjtöttek be gyorsfagyasztással röntgendiffrakció céljából. A teljesen finomított bináris komplex struktúrák FH4 és FH2 ligandumszerkezeteit 2, illetve 14 napon az egyes ábrák referenciaként mutatják be, hogy összehasonlítsák az elektronsűrűség változásával. A 3.és 6. napon begyűjtött kristályokra vonatkozó kihagyási térképeket a kezdeti szerkezeti finomítás után készítettük ligandumok vagy oldószerek bevezetése nélkül. A fehérjeszerkezetek szuperpozícióját PyMOL69 alkalmazásával hajtottuk végre
tudomásunk szerint ez az első alkalom, hogy egy hiteles FH4-hez kötött EGYDOMÉNES DHFR komplexet izoláltak. Validáltuk az eDHFR:FH4 komplex kristályosodásának reprodukálására szolgáló protokollt, és megerősítettük az FH4-FH2 bomlás időbeli lefolyását legalább két független ismétléssel a kristálygyűjtés minden pontján (kiegészítő ábra. 1). A köztes elektronsűrűség a ligandum bomlásának időbeli lefolyása mentén egyértelműen megmutatja az sp3-sp2 átmenetet a C6 helyzetben, valamint a kötött ligandum benzoil gyűrűjének egyidejű forgását (ábra. 3). Ez hasonlíthat az átmeneti állapot ligandum konformációjára előre katalitikus irányban. A kristálynövekedés során megfigyelt FH4-FH2 bomlás valószínűleg nem tükrözi a DHFR által végzett fordított katalízist, amely magában foglalja az FH4 FH2-vé történő átalakítását. Valószínűleg a fény sem indukálja, figyelembe véve, hogy a kristályosodási cseppeket szobahőmérsékleten inkubáltuk sötétben a kristálynövekedés során, és az FH4-FH2 bomlás időtartama napok sorrendje. Teszteltük a ditiotreitol (DTT) vagy a Tris(2-karboxi-etil)foszfin (Tcep) redukálószerekkel történő együttkristályosítást is 2-3 mM-es koncentrációban, valamint DTT vagy TCEP bevezetését akár 20 percig kristály áztatással a betakarítás előtt 2 nap, 3 nap, 14 nap, legfeljebb 7,5 hónap. Ismét ezek az eljárások nem befolyásolták a ligandum elektronsűrűségének minőségi változásainak reprodukálhatóságát az eDHFR bomlási ideje mentén: FH4 komplex az ebben a tanulmányban azonosított kristályos formában (kiegészítő ábra. 1). Így, valószínű, hogy a jelenlegi kristályosítási protokoll előnyösen kristályosítja az endogén FH4 komplexet, amelyet az eDHFR fehérjemintákban együtt tisztítanak, bomlása a kristályban visszafordíthatatlan az általunk vizsgált körülmények között, valószínűleg véges oxigénszintű oxidáció miatt. Bár az FH4 fh2-ből történő előállításának gyors előremenő katalitikus reakciója termodinamikailag előnyös a NADPH felesleges mennyiségének jelenlétében, mint in vivo, az FH4 komplex lassú bomlása fh2 komplexgé folytatódhat a NADPH folyamatos ellátása nélkül, amint azt itt megfigyeltük az in vitro kristályosodási állapotban. Így kiderül, hogy a rejtély, hogy miért volt nehéz megszerezni a régóta üldözött FH4 komplexet, annak belső instabilitása. Nagyon valószínű, hogy a kémiailag labilis FH4 komplex szerkezet megszerzésének sikerének kulcsa a jól diffraktáló kristályok időben történő betakarítása 2 napos növekedés az itt azonosított kristályosodási feltétel mellett. Ezenkívül a DHFR mező felmérése azt jelzi, hogy sok kristályográfia19,20,24,28,29,32,43,45,47,48,50,51,52 az NMR12,13,15,17,19,25,26 A DHFR tanulmányai dialízist alkalmaztak az endogén ligandumok eltávolítására az érdeklődésre számot tartó exogén ligandumok bevezetése előtt. Azonosítottunk egy kristályosodási feltételt, amely izolálja az endogén FH4-hez kötött DHFR komplexet a fehérjeminta dialízise vagy további szubsztrátok vagy termékek bevezetése nélkül. Feltételezzük, hogy az eDHFR:FH4 komplex jelenlegi kristályosodási feltétele az FH4-hez kötött formát részesíti előnyben más formákkal szemben, mint például az eDHFR:FH2:NADP(H) hármas komplex.
az eDHFR szerkezeti jellemzése: FH4 komplex
az FH4 komplex elzáródott konformációt alkalmaz az eDHFR – ben (Lásd az ábrákat. 4 és 5). Ez összhangban van a korábbi megállapításokkal, amelyek arra utalnak, hogy a katalitikus ciklus összes alapállapotú FH4 bináris és ternáris komplexe (poszthidridtranszfer és sp2-sp3 konverzió C6-nál) elzáródott konformációkban fordul elő. Ennek oka az FH4 megdöntött pterin gyűrűjének szterikus ütközése a NADP(H) nikotinamid gyűrűjével, amely a Met20 hurok zárt konformációjában fordul elő (ábra. 5)12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,35,36,37,38. Amint az ábrán látható. 4, az FH4 van der Waals kapcsolatokkal és kedvező poláris kölcsönhatásokkal rendelkezik az aktív helymaradványokkal és a vizekkel. Különösen két Asp27 és Arg57 bidentát sóhíd rögzíti az FH4, az aminopirimidin (N3 és exociklikus-NH2), illetve a Anavar-karboxilát két végét közel azonos helyzetben, mint a szubsztrát/analóg komplexek12, 20,24,45.
az edhfr:FH4 komplex aktív helyszerkezete sztereó nézetekben látható. az oldalláncok (Cián) az FH 4 (zöld) és a Met20 (sárga) körön belül botként jelennek meg. A másodlagos struktúrák karikatúrákként jelennek meg szürke színben, az FH4 3,5 Milliméterén belüli vizek pedig gömbökként. Az FH4-gyel való poláris kölcsönhatásokat szaggatott vonalak jelzik. Az FH4–et kihagyó fo-Fc elektronsűrűség-térkép piros színnel, a 2FO-Fc kihagyási térkép pedig 1,0 6-os szinten kék színnel látható a maradékanyagokra és a vizekre vonatkozóan. Az Ile14-Gly15 amid kötések három konformerét szaggatott kör és piros nyilak jelzik. B az Ile14-Gly15 kapcsolat kibővített nézete
az FH4 komplex szuperpozíciója fh2 és FH4 analóg komplexekkel. A jelenlegi FH4, FH2 és jelentett eDHFR komplexek és a jelentett 5-formil-FH4 komplex az elzáródott Met20 hurok konformációikkal, a Phe31 maradékokkal és a megfelelő ligandumokkal együtt zöld, bíborvörös és sárga színűek. A PDB IDs összes többi szerkezete:1dyj (ddFH4)45, 5CCC (ddFH4:NADP+)12, 1rf7 (FH2)24, 4PDJ (FH2:NADPH)20 és 4psy (folát: NADP+)20 szürke színű. A piros szaggatott kör a phe31 és a ligandum–benzoil-csoportok közötti, a kötött ligandumoktól függően két különböző orientációt elfogadó, javasolt ~ – ~ kölcsönhatásokat jelöli. Az FH4 és az 5-formil-FH4 egy klaszterhez tartoznak, szemben a ddfh4, az FH2 és a folsavval, míg a Phe31 oldalláncok szinte ugyanabban a helyzetben maradnak minden igazított struktúrában. A Met20 hurkok három általános konformációs állapotba vannak besorolva, zárt, részben zárt és elzárt. Csak a zárt konformációk képesek szerkezetileg befogadni a NADP(H) kofaktor nikotinamid csoportját, amely belép az aktív helyre
két vízmolekula van, amelyek áthidalják a Met20 hurkot és az FH4-et egy hidrogénkötési hálózaton keresztül, amely magában foglalja a Gly15 (C = O)-wat1-FH4(N5) és a Glu17(NH)-wat2-FH4(N10) (ábra. 4). Ezek a kölcsönhatások hiányoznak a korábban jelentett (6R) – 5,10-dideazatetrahidrofolát (ddFH4) komplexekben12,45 az analóg 5 és 10 pozíciójában az N-C helyettesítés miatt. Ez okozhatja az analóg Met20 konformációjának megfigyelt különbségét az FH4 komplexhez képest (ábra. 5). Az EKT-ben az egyetlen rendelkezésre álló szerkezet, amely nagyon hasonlít a Met20 hurok konformáció az FH4 komplexben egy 5-formil-FH4 komplex (ábra. 5, PDB ID: 1JOM) 51 és két eDHFR-nanobody alloszterikus gátló komplexek, amelyek különböző DHFR epitópokat céloznak meg nanomoláris affinitással (kiegészítő ábra. 2, EKT azonosítók: 3K74 és 4EIG) 28,29. Az 5-formil-FH4 komplex megőrzi az áthidaló vizet a Glu17(NH) és az FH4(N10) között, mint az FH4 komplexben, annak ellenére, hogy eltérő P61 és P212121 űrcsoportok vannak. Az 5-formil-FH4, más néven folinsav vagy leucovorin, az FDA által jóváhagyott” mentő ” gyógyszer a metotrexát káros hatásainak megelőzésére kemoterápia53. Az FH4-karboxilcsoportja kis elektronsűrűséget mutat (ábra. 4), ami zavarra vagy nagyobb kötésforgási szabadságra utal a C körül 6cccccccc-tengely, mint a ligandumok más részein.
a vízhálózaton kívül a stabilizáló kölcsönhatások strukturális eredetét az FH4 komplexben és a lassú termékkibocsátásban a jelenlegi FH4 és FH2 bináris komplexek és a korábban bejelentett eDHFR struktúrák szerkezeti összehasonlítása alapján találtuk meg. Először is, a Van der Waals érintkezése a Glu17 oldallánccal az FH4 további árnyékolását eredményezi az oldószertől (ábra. 4), amely hiányzik a szubsztrátban vagy a termék analógjában (6R)-5,10-dideazatetrahidrofolát komplexekben12,20,24, 45. Másodszor, a konzervált Ile14-Gly15 amidkötés három alternatív gerinckonformációjának tiszta elektronsűrűsége entrópikus hozzájárulást sugall az FH4 komplex stabilitásához a met20 hurokhorgony helyi rugalmasságából (ábra. 4). A korábbi mutagenezis vizsgálatok azt mutatták, hogy az Ile14 kulcsfontosságú a met20 hurok rugalmasságának szabályozásában, míg az I14V, I14A és I14G változatok mindegyike lassabb hidridátviteli sebességet, a met20 hurok nagyobb rugalmasságát mutatta, amint azt a kristályszerkezetek nyílt konformációjában figyelték meg, az elsődleges kinetikus izotóphatás fokozott hőmérsékletfüggését és a hibrid QM/MM szimulációkból számított magasabb átmeneti állapot aktiválási energiát mutatták23,40. Harmadszor, a benzoil-gyűrű forgása elektrosztatikusan kedvező perem–szembe kerüléshez vezet a konzervált Phe-vel31 az FH4 komplexben, szemben az fh2, folát és ddfh4 komplexekben a proton-proton közeli (él-él) visszataszító kölcsönhatásokkal, függetlenül a NADP (H) kötéstől (ábra. 5, kibővített nézet, ábra. 6)54,55. Ennek a szerkezeti változásnak a funkcionális hatását támasztja alá a benzoil gyűrű egyidejű forgásának és az sp3-sp2 átmenetnek a megfigyelése a kötött ligandum C6 helyzetében az FH4-FH2 bomlás során a komplexben (ábra. 3). A Phe31 szerepét a termékkibocsátás szabályozásában tovább erősítik a korábbi mutagenezis vizsgálatok56, amelyek kimutatták, hogy az eDHFR F31V és F31Y változatai a kcat egyensúlyi állapot sebességi állandójának kétszeres növekedését és a termékkibocsátás sebességének becsült 20-50-szeres növekedését mutatták a mutációk hidridtranszfer lassítására gyakorolt hatása mellett.
elektrosztatikus kölcsönhatások A (Z) \ – \ – \ rendszerek között. Lásd refs 54,55 a részletekért
figyelembe véve az adott E. coli DHFR rendszer dinamikus tulajdonságait, az itt megfigyelt stabil elzáródott eDHFR:FH4 komplex (alacsony szabad energiájú köztitermék a dinamikus tájon) ésszerűen megalapozhatja a lassú termékkibocsátási kinetikát (az FH4 disszociáció koff sebessége, az eDHFR katalitikus ciklusának sebességkorlátozó lépése). Korábbi NMR relaxációs diszperziós vizsgálatok szerint az E. coli DHFR katalitikus ciklusának minden lépése “konformáció-szelekciót” követ, nem pedig “indukált fit” mechanizmust15. Következésképpen az egyes lépések mikroszkopikus sebessége a reakciókoordináta mentén az enzim konformációs mintavételi sebességétől függ15(például a gyors hidridátadáshoz vagy a termék sebességkorlátozásához illetékes átmeneti állapot). Ez azt jelenti, hogy minél stabilabb az alapállapot, és minél jobban különbözik a gerjesztett alállomástól, annál nagyobb az ilyen konformációk mintavételéhez szükséges szabad energiaköltség. Az eDHFR esetében ez szükségszerűen magában foglalja az aktív telephely és a rugalmas Met20 hurok átszervezését. Az eDHFR15 NMR relaxációs diszperziós vizsgálataiban javasolták, hogy a hidridtranszfer kémiai lépés szubpopulált gerjesztett állapota elzáródott konformációt fogad el (amelynek alapállapota Michaelis komplex zárt konformációban van). A termékkibocsátási lépés szubpopulált gerjesztett állapota azonban zárt konformációt alkalmaz (amelynek alapállapotú FH4 komplexe elzáródott konformációban van). A reakciókoordináta mentén a jelenleg megfigyelt edhfr: FH4 bináris komplex az eDHFR:FH4:NADP+ és az eDHFR:FH4:NADPH köztes komplexek között helyezkedik el (ábra. 1). Mindkettő elzáródott konformációt alkalmaz, ahol a kofaktor nikotinamid része az aktív helyről15 mutat. A “zárt gerjesztett alállomás” mintavételéhez a sebességkorlátozó termékleadási lépés során 15, az elzárt alapállapotból aktív helyszíni átszervezést kell végrehajtani. Ezt az edhfr:FH4 stabil katalitikus köztitermék képviseli ebben a tanulmányban. Az FH4 termék disszociációs aránya a kofaktor kötéskor nőtt, az eDHFR:FH4:NADP+ esetében az eDHFR:FH4:NADPH esetében az eDHFR:FH4: NADPH esetében az edhfr: FH4: NADPH esetében az edhfr-hez képest kétszeres növekedéssel, az edhfr: FH4: NADPH esetében pedig nyolcszoros növekedéssel:FH4 mind a pH 6, mind a pH 9-en mérve versenykísérletekkel35. Ez azt jelzi, hogy a kofaktor kötése esetén felgyorsult a termék felszabadulása és megnövekedett a konformációs mintavételi arány. Bár hiteles eDHFR:FH4:NADPH háromkomponensű komplex alapállapot-struktúráról még soha nem számoltak be, feltételezzük, hogy érzékelhető hasonlóság lehet az eDHFR: FH4 bináris komplexummal, mivel az összes FH4-hez kötött földi köztes állapot elzáródott konformációt alkalmaz15. Arra számítunk azonban, hogy a kofaktor kötése növeli a gerjesztett alállomások populációját, amelyet korábban az NMR relaxációs diszperziós vizsgálatok alapján javasoltak, hogy zárt konformációban legyen15. Ezzel összhangban megfigyeltük, hogy az eDHFR:FH2:NADP(H) szerkezet hármas komplexében (amelyet külön kristályosítási körülmények között is meghatároztunk vizsgálatunkban) a Met20 hurok rendezetlenné vált. Ez a kofaktor által elősegített ligandumcsere általános mechanizmusára utal a konformációs mintavételi sebesség növelésével, amikor a kofaktor az aktív helytől távol eső nikotinamid részével kötődik.
az FH4-komplexben az FH4 benzoil–gyűrű (C1 ons) és a Phe31-es (Cz) közötti távolság 4,93 Ft, ami lényegesen rövidebb (~0,3-0,6 Ft), mint a jelenlegi fh2 és a korábban jelentett fh2-komplexek (PDB ID: 1rf7, 4PDJ)20,24, amelyek 5,22, 5,55, illetve 5,32 Ft. Az eDHFR reakciókoordinátája mentén a távolság rövidülésének hasonló tendenciáját két független számítási tanulmány hangsúlyozta. Egy QM / MM vizsgálat kiszámította, hogy a Michaelis-komplextől az átmeneti állapotig a hidridtranszfer-reakció során a megfelelő távolság ~0,3 Xhamsterrel lerövidül, és hogy ebben a távolságban (~0,01^) alig van különbség az átmeneti állapot és a reakciótermék között27. Egy másik, vegyes kvantum/klasszikus molekuláris dinamikát alkalmazó tanulmány azt javasolta, hogy a megfelelő távolság drámaibb lerövidítése ~1 Xhamsterrel, amikor a reakció a reagensről az átmeneti állapotra fejlődik18. Ezért kristálytani megfigyeléseink általában egyetértenek a korábbi számítási modellezéssel, ami arra utal, hogy bizonyos mértékig az FH4 komplex megőrzi az átmeneti állapot fizikai természetét. Ez összhangban van az NMR relaxációs diszperzióval leképezett edhfr dinamikus energia tájára vonatkozó korábbi megfigyelésekkel is, amelyek szerint a katalitikus ciklus minden köztiterméke alacsonyan fekvő gerjesztett állapotokat mintáz, amelyek konformációi hasonlítanak az előző vagy következő köztitermékek alapállapoti szerkezeteire15. Mivel az enzimek stabilizálják az átmeneti állapotot, a DHFR család lassú termékkibocsátása az átmeneti állapot fizikai jellegének a reakciótermék-komplexbe történő átvitelének tulajdonítható. Ezt az itt meghatározott hosszú távú FH4 komplexből javasoljuk, a katalitikus ciklus során szükséges fajspecifikus konformációs változások mellett32.
az edhfr elzáródott komplexének jellemzése nanomoláris kötési affinitással lassan kialakuló inhibitor
a Röntgenkristályográfia azt mutatja, hogy az EDHFR komplexe lassan kialakuló szoros inhibitorral AMPQD46 szintén megjeleníti az elzáródott konformációt. A Met20 hurok olyan konformációt fogadott el az AMPQD komplexben, amely hasonlít a háromkomponensű komplexhez egy antidiabetikus biguanid fenforminnal és NADP+ – val (PDB ID: 5UIH) 52. Másrészt az FDA által jóváhagyott kemoterápiás szer metotrexát korábban Röntgenkristályográfiával bizonyították24, 47, NMR48ÉS egymolekulájú kinetics49, hogy kötődjön a zárt DHFR konformációban (ábra. 7). Ez az eltérés a fehérje konformációkban váratlan volt, mivel mindhárom inhibitornak közös szerkezeti jellemzője van: a fenformin biguanid csoportja, az AMPQD diaminopirimidin csoportja és a metotrexát diaminopterin csoportja, amelyek mindegyike rugalmas linkerrel kapcsolódik egy fenilcsoporthoz. Azonban a megfelelő eDHFR-inhibitor komplexek szerkezeti szuperpozíciójának szoros vizsgálata (ábra. 7) kimutatta, hogy a metotrexát metilamino kapcsolódási csoportja (a fenforminban és az AMPQD-ben hiányzik) olyan pozíciót foglal el, amely potenciális szterikus ütközést eredményezne a Met20 hurokkal, ha elzáródott konformációt alkalmazna, mint a fenformin és AMPQD komplexekben. Korábban kimutattuk, hogy az AMPQD viszonylag nagyobb preferenciát mutatott (az IC-50 és a Ki háromszoros csökkenése) az eDHFR gátlására, mint a humán DHFR46. Még magasabb fajspecifikus E. coli a humán DHFR felett (~30-szoros) figyelhető meg az AMPQD anyavegyületénél, amelyből hiányzik az aminofenil farokcsoport és a metilén linker46. Az EDHFR elzáródott komplexének jelenlegi kristályszerkezete AMPQD-vel hihető mechanisztikus magyarázatot ad fajspecifikációjára, amely az emberi DHFR vs.edhfr konformációs egyensúlyának különbségeinek tulajdonítható. Az előbbi kizárólag zárt konformációkban figyelhető meg, míg az utóbbi nagyobb konformációs rugalmassági mintavételt mutat mind a zárt, mind az elzáródott konformációkban, amint azt a továbbiakban tárgyaljuk.
az eDHFR szerkezete: AMPQD gátló komplex. az AMPQD-vel való aktív hely kölcsönhatások sztereó nézete az Fo–Fc kihagyja a térképet 3,5-ös szinten. A fehérje oldalláncok (Cián) az AMPQD-től (zöld) számított 4 6-on belül botokként jelennek meg, beleértve a Met20 hurok két maradékát (sárga). A poláris kölcsönhatásokat szaggatott vonalak jelzik. b az AMPQD (zöld), a fenformin (sárga, PDB: 5UIH)52 és a metotrexát komplexek szuperpozíciója (szürke vékony rúdként látható az PDB-ből: 1ra3, 1dds)20,47. A Met20 hurkok rajzfilmekként, a ligandumok pedig botokként jelennek meg. A ligandumok kémiai szerkezetét a tetejére rajzolják. A NADP (H) a megtekintés egyszerűsége érdekében egyik struktúrában sem jelenik meg
DHFR konformációk összehasonlítása
a DHFR PDB struktúrák csoportosítása a Met20 hurok gerinc Ca atomjainak rmsd-jét használva távolságmérőként (ábra. 8. kiegészítő füzet. 3) azt jelzi, hogy az emberi DHFR kizárólag zárt konformációt alkalmaz (katalitikusan Kompetens a NADPH kötéshez), míg az eDHFR sokkal rugalmasabb mind zárt, mind elzáródott konformációkkal. Az elzáródott konformációk ritkábban fordulnak elő (17%) az eDHFR struktúrákban. Mind a sebességkorlátozó termékleadási komplex FH4-gyel, mind a lassan kialakuló gátló komplex AMPQD-vel elfogadja az edhfr elzáródott konformációját (ábra. 9), amely ritkán szerepel az EKT-ben (kiegészítő ábra. 3). Érdekes módon mind az FH4,mind az AMPQD megosztja a nanomoláris affinitás és az eDHFR35,36, 46 lassú felszabadulásának jellemzőit, a legfontosabb nitrogénatomok helyzete a heterociklusokon erősen konzerválódott, és a farok különbségei nyilvánvalóak. Ez új stratégiát javasol a DHFR inhibitorok kifejlesztésére az elzáródott eDHFR konformációk megcélzásával. Javasolunk egy stratégiát a kábítószer-rezisztencia leküzdésére is. Amint azt a kiegészítő ábra mutatja. 4, az AMPQD FH4-hez és a trimetoprim FH4-hez való konformációjának összehasonlításakor finom különbségek vannak a Van der Waals borítékokban. Az E. coli DHFR trimetoprim eDHFR menekülési változatai mutációkkal rendelkeznek, amelyek szintén blokkolják az AMPQD57 gátló funkcióját. A kölcsönhatások különbségeinek tanulmányozásával más ligandumokat is kereshetünk, amelyek minimalizálják ezeket az interakciós különbségeket az FH2 és az FH4 között. Ez biztosíthatja, hogy a mutációk, amelyek csökkentik az inhibitorok kötődését, az FH2 és az FH4 kötődési affinitását is csökkentik.
162 DHFR struktúra csoportosítása a Met20 hurkok páros Ca Rmsd-je alapján. A DHFR struktúrákat kék (emberek), zöld (eDHFR) és piros (ebben a tanulmányban) körök képviselik. Az élhossz (az elzártaknál lila, a zárt konformációknál arany színű) arányos a Met20 hurok konformerek maximális RMSD-jével. Kérjük, olvassa el a részletesebb csoportosítási diagramot a kiegészítő információban
az AMPQD (zöld) és az FH4 (sárga) komplexek szuperpozíciója. A Met20 hurkok rajzfilmekként, a ligandumok pedig botokként jelennek meg. A jobb oldali nézetet a bal oldalon látható perspektívából 90 db-ot forgatjuk az óramutató járásával megegyező irányban a függőleges tengely körül
az eDHFR
hármas komplexének jellemzése végül egy eDHFR-ben:FH2:NADP (H) háromkomponensű komplex mind Ko-tisztított endogén ligandummal, mind kofaktorokkal (ábra. 10), Azt találtuk, hogy a Met20 hurok rendezetlenné válik. Ez támogatja a kofaktor kötésének szerepét a konformációs mintavétel fokozásában a gyors ligandumcsere érdekében, vagy a termék alloszterikus mechanizmuson keresztüli felszabadulásának megkönnyítésében (ts kb 2, ábra. 1)12,13,14,15. A nikotinamid-ribóz rész eltávolodik az aktív helytől (ábra. 10) hasonló az elzáródott FH4 hármas komplexhez12. Redox állapota az elektronsűrűség alapján ismeretlen. A különböző endogén ligandumhoz kötött, bináris és ternáris eDHFR komplexek izolálásának képessége változó kristályosodási körülmények között azt sugallja, hogy az eDHFR különböző kötött ligandumokkal rendelkező molekuláris Fajok keverékét és konformációk együttesét tartalmazza. Az itt alkalmazott kristálytani megközelítés hatékonysága kihasználja a molekuláris inhomogenitást azáltal, hogy kihagyja a dialízis lépést egy régóta követett és kémiailag labilis FH4 komplex kristályszerkezet izolálására. Ez ellentétben áll a DHFR minták dialízissel történő előkezelésével járó tipikus eljárással, amely eltávolítja a nyomokban endogén ligandumokat és növeli a minta homogenitását. A jobb homogenitás általában javítja a kokristályosítás vagy a kristály áztatási kísérletek általános sikerességi arányát, amikor a kérdéses ligandumokat exogén módon vezetik be.
a DHFR:FH2:NADP(H) háromkomponensű komplexum sztereó nézetei. A rendezetlen Met20 hurok (az Ile14 és a Pro21 közötti maradékok) fekete szaggatott vonalakkal van jelölve. A Fo–Fc kihagyja térkép egy 3,0 6-os szinten látható piros háló. A másodlagos struktúrákat karikatúrákként és ligandumokként ábrázolják egy bottal ábrázolva. Az atomok színe a következő: szén (fehér), nitrogén (kék), oxigén (piros) és foszfor (narancssárga)