A estrutura cristalina de um tetrahydrofolate vinculado a diidrofolato redutase revela a origem do slow lançamento do produto

Isolamento por cristalização das endógena (6s)-5,6,7,8-tetrahydrofolate vinculado a E. coli DHFR complexo

A estrutura do eDHFR:FH4 binário complexo foi determinada por substituição molecular usando o eDHFR:Folato:NADP+ fechado complexo ternário (PDB ID: 7DFR)50. Como mostrado na Fig. 2, The clear electron density confirms the co-purified endogenous ligand as FH4 based on the tetrahedral geometry of sp3 C6 consistent with a 6s stereoisomer. Isto está em contraste com a geometria trigonal planar de sp2 C6 em um complexo binário FH2 obtido de condições semelhantes de cristalização.

Comparação das estruturas ligando de eDHFR:FH4 (verde, figura superior) e eDHFR:FH2 (laranja, figura inferior) complexos. Os mapas de densidade de elétrons fo-Fc omitidos em torno dos ligandos são mostrados ao nível de 3,0 σ. As vistas à direita São rodadas 90° no sentido contrário ao dos ponteiros do relógio em torno do eixo vertical a partir das perspectivas mostradas à esquerda. FH4 e FH2 são mostrados como paus. O átomo de carbono C6 é colorido em magenta, e seus diferentes estados de hibridação em FH4 e FH2 são indicados por setas de ponta magenta. Todos os outros átomos são coloridos da seguinte forma: oxigênio em vermelho, nitrogênio em azul, carbono em verde, e laranja para FH4 e FH2, respectivamente. Não só de átomos de hidrogênio são mostrados para a simplicidade de visualização

Em um esforço para entender por que obter o FH4 complexo, enquanto que outros não conseguiram, identificou-se que a origem dos dois tipos de ligante complexos (FH4 vs. FH2) é o tempo de cristal colheita, e assim a duração do crescimento de cristais. Um curso de tempo mostrado na Fig. O decaimento FH4 para FH2 (refletido na transição sp3 para sp2 na posição C6) ocorreu aproximadamente 2-3 dias após a cristalização estabelecida.

vistas estéreo do curso de tempo de Fo–Fc omita alterações no mapa de densidade de elétrons correspondentes à conversão de FH4 para FH2. Os mapas de densidade de elétrons fo-Fc omitidos em torno dos ligandos são mostrados ao nível de 3,0 σ. O eDHFR:Cristais complexos binários FH4 foram cultivados no escuro à temperatura ambiente. Em cada ponto de tempo, um único cristal de uma gota de cristal independente foi colhido por congelamento de flash para difração de raios-X. As estruturas ligando de FH4 e FH2 de estruturas complexas Binárias totalmente refinadas em 2 e 14 dias, respectivamente, são mostradas em cada figura como referências para comparar com a mudança de densidades elétricas. Os mapas omitidos para os cristais colhidos em 3 e 6 dias foram gerados após o refinamento estrutural inicial sem a introdução de ligantes ou solventes. A superposição das estruturas proteicas foi realizada utilizando PyMOL69

esta é a primeira vez que sabemos que um autêntico complexo DHFR de domínio único FH4 foi isolado. Nós validamos o Protocolo para reproduzir a cristalização do complexo eDHFR:FH4 e confirmamos o curso de tempo do decaimento FH4 para FH2 por pelo menos duas réplicas independentes em cada momento da colheita de cristal (Fig. suplementar. 1). As densidades elétricas intermediárias ao longo do tempo de decaimento do ligando mostram claramente a transição sp3 para sp2 na posição C6 e a rotação concomitante do anel benzoílo do ligando ligado (Fig. 3). Isto pode assemelhar-se à conformação do Estado de transição ligando na direção catalítica para a frente. O decaimento observado de FH4 a FH2 durante o crescimento do cristal provavelmente não reflete a catálise reversa por DHFR envolvendo a conversão de FH4 a FH2. Ele também provavelmente não é induzido pela luz, considerando que as gotas de cristalização foram incubadas à temperatura ambiente na escuridão durante o crescimento do cristal, e o curso de tempo de decaimento FH4 a FH2 está na ordem dos dias. Temos também testado co-cristalização com os agentes de redução de dithiothreitol (DTT) ou Tris(2-carboxyethyl)fosfina (TCEP) em 2-3 mM de concentração, bem como a introdução de TDT ou TCEP para até 20 minutos de cristal de imersão antes da colheita em 2 dias, 3 dias, 14 dias até 7,5 meses. Mais uma vez, estes procedimentos não afetaram a reprodutibilidade da densidade de elétrons ligando mudanças qualitativamente ao longo do curso de tempo de decaimento do complexo eDHFR:FH4 na forma cristalina identificada neste estudo (Figo suplementar. 1). Assim, é provável que o protocolo de cristalização atual cristalize preferencialmente o complexo FH4 endógeno co-purificado nas amostras de proteína eDHFR, e seu decaimento no cristal é irreversível sob as condições testadas, provavelmente devido à oxidação em um nível finito de oxigênio. Embora a rápida reação catalítica para a frente da produção de FH4 a partir de FH2 seja termodinamicamente favorecida na presença de excesso de NADPH como in vivo, o Lento decaimento do complexo FH4 de volta para um complexo FH2 pode ocorrer sem um fornecimento contínuo de NADPH como observamos aqui sob a condição de cristalização in vitro. Assim, o mistério de por que o complexo FH4 de longa duração era difícil de obter é revelado como sendo sua instabilidade intrínseca. É muito provável que a chave para o nosso sucesso de obter a estrutura complexa quimicamente labila FH4 é a colheita oportuna de Cristais bem difratores dentro de 2 dias de crescimento sob a condição de cristalização identificada aqui. Além disso, um levantamento do campo DHFR indica que muitos cristalógrafos19,20,24,28,29,32,43,45,47,48,50,51,52 e NMR12,13,15,17,19,25,26 os estudos do DHFR aplicaram diálise para remover os ligandos endógenos antes de introduzir os ligandos exógenos de interesse. Identificámos uma condição de cristalização que isola o complexo DHFR endógeno ligado a FH4 sem diálise da amostra de proteínas ou introdução de substratos ou produtos adicionais. Nós postulamos que a atual condição de cristalização para o complexo eDHFR:FH4 favorece a forma de ligação FH4 sobre outras formas, como o complexo ternário eDHFR:FH2:NADP(H).

caracterização estrutural do complexo eDHFR: complexo FH4

o complexo FH4 adota uma conformação oclusiva em eDHFR (ver figos. 4 e 5). Isto é consistente com os achados anteriores que sugerem que todos os complexos binários e ternários do Estado do solo do ciclo catalítico (transferência pós-hidreto e conversão sp2 para sp3 em C6) ocorrem em conformações oclusivas. Isto é devido ao choque estérico do anel pterina inclinado de FH4 com o anel nicotinamida de NADP(H), que ocorreria na conformação fechada do ciclo Met20 (Fig. 5)12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,35,36,37,38. Como indicado na Fig. 4, FH4 has van der Waals contacts and favorable polar interactions with active site residues and waters. Em particular, dois bidentate sal pontes com Asp27 e Arg57 âncora duas extremidades do FH4, aminopyrimidine (N3 e exocyclic-NH2) e α-carboxilato de etilo, respectivamente, em perto de idênticos cargos no substrato/analógico complexes12,20,24,45.

a estrutura do sítio activo do complexo eDHFR: FH4 é mostrada em estéreo. uma corrente lateral (ciano) dentro de 4 Å de FH4 (verde) e o laço Met20 (amarelo) são mostrados como varas. Estruturas secundárias são exibidas como desenhos animados em cinza, e águas dentro de 3.5 Å de FH4 como esferas. As interacções polares com FH4 são indicadas com linhas tracejadas. O mapa de densidade de elétrons Fo–Fc omitindo FH4 é mostrado em um nível de 3,5 σ EM Vermelho e o mapa de omitição 2Fo–Fc em um nível de 1,0 σ é mostrado em azul para resíduos e águas. Os três conformadores da ligação amida Ile14-Gly15 são indicados por um Círculo Tracejado e setas vermelhas. b uma visão alargada da ligação Ile14-Gly15

superposição do complexo FH4 com complexos analógicos FH2 e FH4. Os atuais complexos FH4, FH2, e edhfr relatados e o complexo 5-formil-FH4 relatado, juntamente com suas conformações oclused loop Met20, resíduos de Phe31 e os correspondentes ligandos são coloridos em verde, magenta e amarelo, respectivamente. Todas as outras estruturas do PDB Id: 1DYJ (ddFH4)45, 5CCC (ddFH4:NADP+)12, 1RF7 (FH2)24, 4PDJ (FH2:NADPH)20, e 4PSY (folato:NADP+)20 são de cor cinza. The red track circle indicates proposed π-π interactions between Phe31 and the ligand benzoyl groups that adopt two distinct orientations depending on the bound ligands. FH4 e 5-formil-FH4 pertencem a um aglomerado em contraste com ddFH4, FH2, e folato, enquanto as cadeias laterais Phe31 permanecem quase na mesma posição em todas as estruturas alinhadas. Os loops Met20 são categorizados em três estados conformacionais gerais, fechados, parcialmente fechados e oclusivos. Apenas o fechado conformações pode estruturalmente acomodar a nicotinamida grupo de NADP(H) cofactor entrando o site ativo

Existem duas moléculas de água de correspondência a Met20 loop e FH4 através de uma ligação de hidrogênio rede que envolve Gly15 (C = O)-wat1-FH4(N5) e Glu17(NH)-wat2-FH4(N10) (Fig. 4). Estas interacções estão ausentes nos complexos (6R)-5,10-dideazatetrahidrofolato (ddFH4) anteriormente relatados12,45 devido à substituição de N para C nas 5 e 10 posições no análogo. Isto pode causar a diferença observada na conformação Met20 no análogo em comparação com o complexo FH4 (Fig. 5). As únicas estruturas disponíveis no PDB que se assemelham muito à conformação do ciclo Met20 no complexo FH4 são um complexo 5-formil-FH4(Fig. 5, PDB ID: 1JOM)51 e dois eDHFR-nanobody inibidores alostéricos complexos que são alvo de diferentes DHFR epitopos com nanomolar afinidade (Complementar Fig. 2, PDB IDs: 3K74 and 4EIG) 28,29. O complexo 5-formil-FH4 preserva a água de ligação entre Glu17 (NH) e FH4(N10) como no complexo FH4, apesar de seus diferentes grupos espaciais P61 e P212121, respectivamente. 5-Formil-FH4, também conhecido como ácido folínico ou leucovorina, é um medicamento aprovado pela FDA para prevenir efeitos nocivos do metotrexato durante a quimioterapia53. O grupo γ-carboxílico de FH4 apresenta pouca densidade de electrões (Fig. 4), sugerindo desordem ou mais liberdade de rotação de ligações em torno do eixo Cß-Cy ou C-Cδ do que em outras partes dos ligandos.

além de rede de abastecimento de água, encontramos estruturais origem da estabilização interações no FH4 complexo e lento produto lançamento com base estruturais comparação da atual FH4 e FH2 binários complexos e relatado anteriormente eDHFR estruturas. Em primeiro lugar, o contacto de van der Waals com a cadeia lateral Glu17 resulta numa blindagem adicional de FH4 do solvente (Fig. 4) ausente no substrato ou produto análogo (6R)-5,10-dideazatetra-hidrofolato complexes12,20,24,45. Em segundo lugar, a clara densidade de elétrons de três conformações alternativas da espinha dorsal conservada da ligação amida Ile14-Gly15 sugere uma contribuição entrópica para a estabilidade do complexo FH4 a partir da flexibilidade local na âncora do laço Met20 (Fig. 4). Nomeadamente, anterior mutagenesis estudos mostraram Ile14 é crucial para controlar a flexibilidade do Met20 ciclo, enquanto I14V, I14A, e I14G variantes todos mostraram um ritmo mais lento de hidreto de taxa de transferência, maior flexibilidade do Met20 loop, como observado em um abrir de conformação em estruturas cristalinas, aumento da dependência da temperatura do primário cinética de isótopos de efeito, e uma maior estado de transição de energia de ativação calculada a partir híbrido QM/MM simulations23,40. Em terceiro lugar, a rotação do anel de benzoíla leva a eletrostaticamente favorável de ponta-a-face π–π interações com o conservada Phe31 no FH4 complexo em contraste com a proton-perto-de prótons (de borda a borda) repulsiva medicamentosas em FH2, folato, e ddFH4 complexos, independentemente do NADP(H) ligação (Fig. 5, expanded view, Fig. 6)54,55. A implicação funcional desta mudança estrutural é também suportada pela observação da rotação concomitante do anel benzoílo e da transição sp3 para sp2 na posição C6 do ligante ligado durante o tempo de decaimento FH4 para FH2 no complexo (Fig. 3). O papel de Phe31 no controle de versão do produto é ainda corroborada pelo anterior mutagenesis studies56, que demonstrou que F31V e F31Y variantes de eDHFR apresentado um aumento de duas vezes do estado estacionário a taxa constante de kcat e um número estimado de 20 a 50 vezes o aumento da taxa de lançamento de produtos, além de mutações’ efeito sobre a abrandar o hidreto de transferência.

interacções electrostáticas dos sistemas π–π. Ver refs 54,55 para detalhes

Considerando as propriedades dinâmicas de um determinado E. coli DHFR sistema, a estabilidade da tapada, eDHFR:FH4 complexo (uma baixa de energia livre de intermediários na sua dinâmica de paisagem) observaram aqui pode razoavelmente fundamentam a lenta lançamento do produto cinética (koff taxa de FH4 dissociação, a limitação de taxa de passo de eDHFR ciclo catalítico). De acordo com estudos anteriores de dispersão de relaxamento NMR, cada etapa do ciclo catalítico de E. coli DHFR segue uma “seleção de conformação” ao invés de um mecanismo de “ajuste induzido “15. Consequentemente, a taxa microscópica de cada etapa ao longo da coordenada de reacção depende da taxa de amostragem conformacional da enzima 15 (por exemplo, o estado de transição competente para a transferência rápida de hidreto ou para a libertação do produto limitador de velocidade). Isto implica que quanto mais estável o estado do solo, e mais diferente é do sub-estado excitado, maior o custo de energia livre necessário para provar tais conformações. Para a eDHFR, isso implica necessariamente a reorganização do site ativo e do loop flexível Met20. Foi proposto em estudos de dispersão de relaxamento NMR de eDHFR15 que o estado excitado subpopulado para a etapa química de transferência de hidreto adota uma conformação oclusiva (cujo estado de terreno complexo Michaelis está em uma conformação fechada). No entanto, o estado de excitação subpopulada para a fase de liberação do produto adota uma conformação fechada (cujo estado de base complexo FH4 está em uma conformação oclusiva). Ao longo da coordenada de reação, o complexo binário eDHFR:FH4 atualmente observado reside entre o complexo binário eDHFR:FH4:NADP+ e eDHFR:FH4:complexos intermediários NADPH (Fig. 1). Ambos adoptam conformações oclusivas, em que a fracção nicotinamida do cofactor se afasta do site15 activo. Para amostrar o “subestado excitado fechado” durante a fase de liberação de produto limitante de taxa 15, a reorganização do local ativo do Estado do solo oclused deve ocorrer. Isto é representado pelo intermediário catalítico estável eDHFR:FH4 capturado neste estudo. A taxa de dissociação do produto koff de FH4 foi aumentada com a ligação do cofactor, com um aumento duas vezes para o eDHFR: FH4: NADP+ em comparação com o eDHFR: FH4, e um aumento oito vezes para o eDHFR: FH4: NADPH em comparação com o eDHFR:FH4 medido a pH 6 e pH 9 pela competition experiments35. Isto indica a libertação acelerada do produto e o aumento das taxas de amostragem em conformidade quando um cofactor Está ligado. Embora um edhfr autêntico: FH4: estrutura de Estado de terreno complexo NADPH nunca foi relatado antes, nós hipotetizamos que pode haver uma semelhança apreciável com o complexo binário eDHFR:FH4, como todos os estados intermediários de terra ligados FH4 adotam uma conformaçãooclusa15. Esperamos, no entanto, que a ligação do cofactor aumente a população dos subestados excitados, propostos anteriormente com base em estudos de dispersão de relaxamento NMR, para estar em uma conformação fechada 15. Consistente com isso, observamos que em um complexo ternário da estrutura eDHFR:FH2:NADP(H) (também determinado em nosso estudo sob condições de cristalização separadas), o loop Met20 ficou desordenado. Isto sugere que um mecanismo geral de cofactor facilitou o intercâmbio de ligandos através do aumento da taxa de amostragem conformacional quando o cofactor Está ligado com a sua fracção de nicotinamida a apontar para longe do local activo.

No FH4 complexas, a distância entre o FH4 de benzoíla anel (C1ʹ) e o Phe31 (Cz) é 4.93 Å, o que é significativamente menor, (~0.3–0.6 Å) do que as correspondentes distâncias no atual FH2 e relatado anteriormente FH2 complexos (PDB ID: 1RF7, 4PDJ)20,24, que são 5.22, 5.55, e 5.32 Å, respectivamente. Uma tendência similar de encurtamento de distância ao longo da coordenada de reação de eDHFR foi enfatizada em dois estudos computacionais independentes. Um estudo QM / MM calculou que a distância correspondente é encurtada em ~0,3 Å do complexo Michaelis para o estado de transição como a reação de transferência de hidreto ocorre e que há pouca diferença nesta distância (~0,01 Å) entre o estado de transição e o produto de reação 27. Outro estudo usando a dinâmica molecular mista quântica / clássica sugeriu um encurtamento mais dramático da distância correspondente por ~1 Å à medida que a reação evolui do reagente para o estado de transição 18. Portanto, nossas observações cristalográficas estão de acordo com a modelagem computacional anterior sugerindo que, em certa medida, o complexo FH4 preserva a natureza física do Estado de transição. Isto também é consistente com observações anteriores sobre a paisagem de energia dinâmica de eDHFR mapeado por dispersão de relaxamento NMR que cada intermediário no ciclo catalítico amostras de estados excitados de baixa altitude cujas conformações se assemelham às estruturas de Estado-solo dos intermediários anteriores ou seguintes 15. Uma vez que as enzimas estabilizam o estado de transição, a libertação lenta do produto da família DHFR pode ser atribuída à transição da natureza física do Estado de transição para o complexo do produto de reação. Isto é sugerido a partir do complexo FH4 de longa duração aqui determinado, além das alterações conformacionais específicas da espécie necessárias durante o ciclo catalítico 32.

Caracterização de um ocluída complexo de eDHFR com um nanomolar afinidade de ligação de evolução lenta, inibidor

cristalografia de raios-X mostra que o complexo de eDHFR com uma evolução lenta, apertada inibidor AMPQD46 também apresenta ocluída conformação. O ciclo Met20 adotou uma conformação no complexo AMPQD que se assemelha ao do complexo ternário com um biguanídeo anti-diabético fenformina e NADP+ (ID PDB: 5uih) 52. Por outro lado, o agente quimioterapêutico aprovado pela FDA,o metotrexato, foi previamente demonstrado pela cristalografia de raios X24, 47, NMR48, e cinetics49 de molécula única para se ligar na conformação DHFR fechada (Fig. 7). Esta discrepância nas conformações proteicas foi inesperada uma vez que todos os três inibidores compartilham uma característica estrutural comum: o grupo biguanida de fenformina, o grupo diaminopirimidina de AMPQD, e o grupo diaminopterina de metotrexato, cada um ligado a um grupo fenil com um linker flexível. No entanto, um exame atento da superposição estrutural dos complexos inibidores eDHFR correspondentes (Fig. 7) demonstrou que o grupo de ligação metilamino do metotrexato (ausente na fenformina e AMPQD) ocupava uma posição que resultaria num potencial choque estérico com a loop Met20 se adoptasse uma conformação oclusiva como nos complexos fenformina e AMPQD. Anteriormente demonstrámos que o AMPQD apresentava uma preferência relativamente maior (uma diminuição de três vezes no IC-50 e no Ki) por inibir o eDHFR sobre o DHFR46 humano. An even higher species-specificity for E. coli sobre DHFR humano (~30 vezes) é observado para o composto original de AMPQD, que carece do grupo cauda aminofenil e do linker46 metileno. A estrutura cristalina atual do complexo oclusivo de eDHFR com AMPQD fornece uma explicação mecanicista plausível para sua especificidade de espécie, atribuível a diferenças nos equilíbrios conformacionais de DHFR humanos vs. eDHFR. O primeiro é observado exclusivamente em conformações fechadas, enquanto o segundo mostra maior flexibilidade conformacional amostragem em conformações fechadas e oclusivas, como discutido em seguida.

estrutura do complexo inibitório EDHFR: AMPQD. a Stereo view of the active site interactions with AMPQD with the Fo-Fc omit map at a 3.5 σ level. As cadeias laterais proteicas (ciano) a 4 Å de AMPQD (verde) são apresentadas como varas, incluindo dois resíduos do ciclo Met20 (amarelo). As interacções polares são indicadas com linhas tracejadas. B superposição de AMPQD (verde), fenformina (amarela, PDB: 5UIH)52, e complexos de metotrexato (cinza mostrado como varas finas do PDB: 1RA3, 1DDS)20,47. Met20 loops são mostrados como desenhos animados e ligandos como paus. As estruturas químicas dos ligandos são desenhadas por cima. O NADP(H) não é exibida em qualquer uma das estruturas para a simplicidade de visualização

Comparação de DHFR conformações com base no cluster

Um cluster de DHFR AO de estruturas utilizando o RMSD da Met20 loop espinha dorsal Ca átomos como a distância métrica (Fig. 8 e Fig. suplementar. 3) indica que o DHFR humano adota exclusivamente uma conformação fechada (cataliticamente competente para a ligação do NADPH), enquanto o eDHFR é muito mais flexível com ambas as conformações fechadas e oclusivas. As conformações oclused são vistas menos frequentemente (17%) em estruturas eDHFR. Tanto o complexo de libertação de produto limitador de velocidade com FH4 como o complexo inibitório de início lento com AMPQD adotam uma conformação oclusiva de eDHFR(Fig. 9) que raramente está representado no APO (Fig. complementar. 3). Curiosamente, tanto FH4 quanto AMPQD compartilham as características de afinidade nanomolar e liberação lenta de eDHFR35,36,46 com a posição dos átomos chave de nitrogênio nos heterociclos fortemente conservados, e diferenças evidentes nas caudas. Isto sugere uma nova estratégia para o desenvolvimento de inibidores DHFR, visando conformações eDHFR obstruídas. Propomos também uma estratégia para combater a resistência à droga. Como indicado na figura complementar. 4, ao comparar a conformação de AMPQD a FH4 e trimethoprim a FH4, há diferenças sutis nos envelopes de van der Waals. As variantes de escape edhfr do trimetoprim possuem mutações que também bloqueiam a função inibitória do AMPQD57. Ao estudar as diferenças nas interações, pode-se procurar por outros ligandos que minimizem essas diferenças de interação com FH2 e FH4. Isto pode garantir que as mutações, que diminuem a ligação dos inibidores, diminuam também a afinidade de ligação de FH2 e FH4.

Clustering of 162 DHFR structures based on their pairwise Ca RMSD of the Met20 loops. Estruturas DHFR são representadas por círculos preenchidos em azul (humanos), verde (eDHFR) e vermelho (neste estudo). O comprimento da aresta (colorido em roxo para o oclusão e ouro para as conformações fechadas, respectivamente) é proporcional ao máximo RMSD dos conformadores de loop Met20. Consulte um diagrama de agrupamento mais detalhado nas informações suplementares.

superposição de complexos AMPQD (verde) e FH4 (amarelo). Os loops Met20 são mostrados como desenhos animados e ligandos como paus. A vista à direita é rodada 90° no sentido horário em torno do eixo vertical a partir de uma perspectiva mostrado à esquerda

a Caracterização de um complexo ternário de eDHFR

Finalmente, em um eDHFR:FH2:Complexo ternário NADP(H)com ligando endógeno co-purificado e cofactores (Fig. 10), descobrimos que o loop Met20 fica desordenado. Isto suporta o papel da ligação do cofactor na melhoria da amostragem conformacional para troca rápida de ligantes ou facilitar a libertação do produto através de um mecanismo alostérico (TS‡2, Fig. 1)12,13,14,15. A fracção da nicotinamida ribose afasta-se do local activo (Fig. 10) semelhante ao complexo ternário fh4oclusivo. Seu estado redox é Desconhecido com base na densidade de elétrons. A capacidade de isolar diferentes complexos edhfr endógenos ligados a ligandos, binários e ternários em diferentes condições de cristalização sugere que eDHFR contém uma mistura de espécies moleculares com ligantes ligados diferentes e um conjunto de conformações. A eficácia da abordagem cristalográfica aqui aplicada tira partido da inomogeneidade molecular, omitindo o passo de diálise para isolar uma estrutura cristalina complexa FH4 de longa duração e quimicamente labial. Esta situação opõe-se ao processo típico que envolve o pré-tratamento de amostras de DHFR por diálise, que remove vestígios de ligantes endógenos e aumenta a homogeneidade das amostras. A homogeneidade melhorada geralmente melhora a taxa de sucesso geral de co-cristalização ou experimentos de imersão em cristais, quando os ligantes de interesse são introduzidos de forma exógena.

vistas estéreo do complexo ternário DHFR:FH2:NADP(H). O ciclo Met20 desordenado (resíduos entre Ile14 e Pro21) é indicado como linhas tracejadas pretas. O mapa fo-Fc omit a um nível de 3,0 σ é mostrado como malha vermelha. Estruturas secundárias são mostradas como desenhos animados e ligandos em uma representação de vara. Os átomos são coloridos da seguinte forma: carbono (branco), nitrogênio (azul), oxigênio( vermelho) e fósforo (laranja).)