az 1,2,3-triazolok Antivenom hatásai a Bothrops jararaca és a Lachesis muta kígyók ellen

absztrakt

a kígyómérgek mind enzimek, mind nemenzimek fehérjéinek komplex keverékei, amelyek számos biológiai hatás előidézéséért felelősek. A kígyócsípések által okozott emberi envenomáció, különösen a viperid családé, komplex patofiziológiai képet idéz elő, amelyet a hemosztázis látványos változásai jellemeznek, és gyakran vérzés is megfigyelhető. Jelen munka arról számol be, hogy az 1,2,3-triazol-származékok sorozatából hat képes gátolni bizonyos farmakológiai hatásokat, amelyeket a Bothrops jararaca és a Lachesis muta mérgei okoznak. Az In vitro vizsgálatok azt mutatták, hogy ezek a vegyületek koncentráció-függő módon károsodtak, a fibrinogén vagy a plazma alvadása, a hemolízis és a mindkét méreg által termelt proteolízis. Sőt, ezek a vegyületek in vivo is gátolták a biológiai hatásokat. Az ezekkel a vegyületekkel kezelt egerek teljes mértékben védettek voltak az ilyen mérgek által okozott vérzéses elváltozásoktól. De csak a B. a jararaca ödémát kiváltó aktivitást a triazolok semlegesítették. Tehát a triazolszármazékok gátló hatása a kígyómérgek egyes in vitro és in vivo biológiai vizsgálataival szemben ígéretes szempontokra utal, amelyek molekuláris modellekként jelezhetik őket a hatékony antivenom termelésének javítására vagy az antivenom semlegesítésének kiegészítésére, különösen a helyi kóros hatások, amelyeket az antivenomok részben semlegesítenek.

1. Bevezetés

a kígyómérgek fehérjék, köztük enzimek (metalloproteinázok, szerin proteinázok, foszfolipázok A2 és L-aminosav-oxidáz) és enzimatikus aktivitás nélküli fehérjék, például dezintegrinek, C-típusú lektinek, ciszteinben gazdag szekréciós fehérjék (CRISP) toxinok, natriuretikus peptidek és myotoxinok komplex keverékei. A mérges gödörviperák Bothrops jararaca és Lachesis muta felelősek az embereket érintő balesetekért Dél-Amerika több régiójában. Míg a B. jararaca Brazília déli részén, Paraguayban és Argentína északi részén található meg, L. a muta az Andoktól keletre eső egyenlítői erdőkben fordul elő, Kelet-Ecuadortól, Kolumbiától, Perutól, Észak-Bolíviától, Venezuela keleti és északi részétől Guyanáig, francia Guyanáig, Surinamig és Észak-Brazíliáig. A hatótávolságukon belül gyakran bőségesek, és a kígyómarások fontos okai . Ezeknek a kígyóknak a megjelenését elsősorban szisztémás (generalizált vérzés, koagulopátia, veseelégtelenség és sokk) és helyi hatások (vérzés, ödéma és nekrózis) jellemzik . Amint arról másutt beszámoltunk, a kígyómarások közegészségügyi problémát jelentenek Latin-Amerikában és más trópusi és szubtrópusi országokban, ahol az Egészségügyi Világszervezet (WHO) szerint elhanyagolt egészségügyi problémának tekintik őket . Dél-Amerikában a B. jararaca a harapások nagyobb gyakoriságát (95%) idézi elő, mint az L. muta (körülbelül 2%); azonban az L. muta harapások általában súlyosabb envenoming tünetekhez vezetnek, halálozási incidenciája pedig háromszor magasabb, mint a B. jararaca . Manapság az állati eredetű antivenom parenterális beadása az egyetlen specifikus kezelés a kígyómarás okozta envenoming kezelésére. Brazíliában mindkét Bothrops polivalens antivenom intravénás beadását alkalmazzák a Bothrops harapások vagy a L. muta és Bothrops (B. atrox) kígyócsípések okozta envenoming esetek kezelésére az amazóniai régiókban. Mint fentebb említettük, a Bothrops és a Lachesis kígyók által okozott közepes vagy súlyos envenomingokat helyi és szisztémás változások komplex sorozata jellemzi, mint például vérzés, myonecrosis, koagulopathia, kardiovaszkuláris sokk, veseelégtelenség és végül halál . Amint arról más szerzők beszámoltak, annak ellenére, hogy biztonságosak, Brazíliában néha nagy dózisú antivenomákat alkalmaznak bizonyított vagy feltételezett Bothrops/Lachesis envenoming betegek kezelésére, hozzájárulhatnak a korai anafilaxiás és késői (szérumbetegség) típusú reakciókhoz . Így a megfelelő minőségű antivenomok előállítása jelentős kihívást jelent. Ráadásul az antivenomák ára emelkedett, és néhány ország leállította a gyártást . Néhány antivenom hatékonyan semlegesíti a méreg szisztémás toxikus hatásait; azonban a helyi hatások nem blokkolódnak, és ez a helyzet amputációhoz vagy fogyatékossághoz vezethet .

az ilyen problémák miatt alternatív kezeléseket kerestek, és néhányuk olyan új molekulák keresését vonta maga után, amelyek képesek semlegesíteni a mérgek szisztémás és helyi hatásait. A növényekből és más természetes forrásokból (mint a tengeri élőlényekből) származó kivonatokat megvizsgálták, hogy képesek-e semlegesíteni a kígyóméreg különféle biológiai és toxikus hatásait. Különböző farmakológiailag aktív molekulákat azonosítottak, és számos hatást már felsoroltak rájuk , beleértve az antivenom képességüket is . Manapság számos új bioprospektív megközelítést vizsgálnak. Ezzel kapcsolatban azonban meg kell jegyezni, hogy a szerves szintézisből származó molekulák biológiai hatásait még nem vizsgálták jól. Az irodalom az 1,2,3-triazol vegyületet az öttagú nitrogén heterociklusos rendszer fontos osztályaként írta le, amely különböző farmakológiai profilokat mutat , mint például thrombocyta-gátló aktivitás , anticlotting , antivirális , trypanocid , antimikrobiális és/vagy a skizofrénia és a leishmaniasis kezelésében . Az 1,2,3-triazolgyűrűk felépítésére két általános módszer áll rendelkezésre: Huisgen 1,3-dipoláris cikloaddíciós reakciók , különösen a réz(I)-katalizált cikloaddíciós reakciók , valamint a ~ -szubsztituált ~ -diazokarbonilvegyületek intramolekuláris 1,5-elektrokiklizációja . Korábbi tanulmányaink azt mutatták, hogy hat új szintetikus 1,2,3-triazolvegyület (1-aril-szulfonil-amino-5-metil-1H-triazol-4-karbonsav-etil-észterek) gátolta az L. muta méreg által kiváltott hemolízist . Valójában az ilyen származékok a farmakológiai aktivitás széles skáláját mutatták .

ennek a munkának az volt a célja, hogy értékelje e hat –1-(p-klór-fenil)-1H–triazol-4-karbohidrazidon alapuló 1,2,3-triazol-származék képességét a Bothrops jararaca és a Lachesis muta mérgek in vivo és in vitro aktivitásával szemben.

2. Anyag

2.1. Méreg és Anyag

Bothrops jararaca, Lachesis muta liofilizált mérgek, és anti-Lachesis vagy anti-Bothropic antivenom biztosítottak Funda Ezequiel Dias, Belo Horizonte, MG, Brazília, és tárolt -20 kb a vizsgálatokig. A dimetil-szufoxidot (DMSO), a szarvasmarha-fibrinogént és az azokazeint a Sigma Chemical Co. Az összes többi reagens a rendelkezésre álló legjobb minőségű volt.

2.2. Szintetikus származékok

a hat 1-aril-szulfonil-amino-5-metil-1H-triazol-4-karbonsav-etil-észter származékot előző jelentésünk szerint szintetizáltuk, kémiai szerkezetüket az 1.ábra mutatja. Ezeket a vegyületeket dimetil-szufoxidban (DMSO) oldottuk fel, és szükség esetén 4CC-on tároltuk.

ábra 1

a hat 1,2,3-triazol-származék N’-1-(p-klór-fenil) – 1H-triazol-4-karbohidrazid kémiai szerkezete. A hat származékot számként tervezték, amint az az egyes származékok után zárójelben látható.

2.3. Állatok

BALB / c egereket (18-20 g) nyertünk a szövetségi Fluminense Egyetem n Oncleo de Animais de laborat Enterprio (NAL). Az állatokat ellenőrzött hőmérsékleti (C) és fényviszonyok között helyezték el. A kísérleteket az Uff állatkísérletek Etikai Bizottsága (297.számú protokoll) hagyta jóvá, amelyek összhangban voltak a brazil állatkísérleti Bizottság (Cobea) Irányelveivel és a nemzetközi törvényekkel és politikákkal.

3. Módszerek

3.1. Az indirekt hemolízis gátlása

az L. muta és a B. jararaca mérgei által okozott hemolízis mértékét közvetett hemolitikus teszttel határoztuk meg, humán eritrocitákat és tyúktojás tojássárgája emulziót használva szubsztrátként . Az L. muta és B mennyisége. a 100% – os hemolízist előállító jararaca mérget (~g/mL) minimális közvetett hemolitikus dózisnak (MIHD) jelöltük. Gátló kísérleteket végeztünk úgy, hogy a triazolszármazékokat egy MIHD-vel inkubáltuk 30 percig szobahőmérsékleten, majd a hemolitikus aktivitást értékeltük. A kontroll kísérleteket mérgek inkubálásával végeztük DMSO-val vagy sóoldattal.

3.2. Véralvadásgátló aktivitás

az L. muta és a B. jararaca mérgek véralvadási aktivitását digitális Amelung koagulométerrel, KC4A modellel határoztuk meg (Labcon, Németország). Különböző koncentrációjú L. a muta-mérget (10 6G/mL) és a B. jararaca-mérget (40 ml) szarvasmarha-fibrinogén oldattal (2 mg/mL) vagy humán plazmával keverték, és a fibrinogént vagy a plazmát 60 másodperc alatt alvadó méreg mennyiségét minimális koaguláns dózisként (MCD) jelölték. Gátló hatásuk értékeléséhez a triazolszármazékokat 30 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten egy MCD méreggel, majd az elegyet fibrinogénhez vagy plazmához adtuk, és rögzítettük az alvadási időt. A kontroll kísérleteket párhuzamosan végeztük DMSO vagy mérgekkel inkubált sóoldat hozzáadásával, a triazolok helyett.

3.3. Antiproteolitikus aktivitást

az L. muta és a B. jararaca mérgek proteolitikus aktivitását szubsztrátként azokazeinnel határoztuk meg (0,2% m/v, 20 mM-es Tris-HCl-ben, 8 mM-es CaCl2-ben, pH 8,8), kisebb módosítással . Az effektív koncentrációt (EC) úgy határoztuk meg, mint a méreg mennyiségét (6G/mL), amely képes variációt előállítani 420 nm-en körülbelül 0,2. A triazolszármazékokat egy EC méreggel inkubáltuk 30 percig szobahőmérsékleten, majd megmértük a proteolízist. A kontroll kísérleteket mérgek inkubálásával végeztük DMSO-val vagy sóoldattal.

3.4. Az antihemorrhagiás aktivitást

az L. muta és a B. jararaca mérgek által előidézett vérzéses elváltozásokat Kondo et al. , módosításokkal. Röviden, A mintákat intradermálisan (i.d.) injektáltuk az egerek hasi bőrébe. Két órával később az állatokat lefejezéssel eutanizálták, a hasi bőrt eltávolították, megnyújtották, és megvizsgálták a belső vizuális változásokat a vérzéses foltok lokalizálása érdekében. A vérzést a minimális vérzéses dózisként (MHD) határozták meg, amelyet a méreg mennyiségeként határoztak meg (mg/kg) képes 10 mm-es vérzéses halo előállítására . A triazolszármazékok gátló hatását úgy vizsgáltuk, hogy a vegyületeket két MHD L. muta vagy B. jararaca méreggel inkubáltuk 30 percig szobahőmérsékleten, majd az elegyet egerekbe injektáltuk, majd a vérzést mértük. A hemorrhagiás aktivitást a triazolszármazékok hiányában és jelenlétében a mérgek által kiváltott hemorrhagiás halo átlagos átmérőjében (milliméterben) fejeztük ki. Negatív kontroll kísérleteket végeztünk DMSO vagy sóoldat injektálásával.

3.5. Az antiedematogén aktivitást

az L. muta és a B. jararaca mérgek ödéma-indukáló aktivitását Yamakawa et al. , módosításokkal. Öt egérből álló csoportokat szubkután (s.c) injektáltunk a jobb lábpárnába 50 db-os méreggel, míg a bal oldali táplálékpárna 50 ml sóoldatot kapott. Egy órával az injekció beadása után az ödémát a jobb lábpárna súlyának a balhoz viszonyított növekedésének százalékában fejeztük ki. A triazolszármazékok gátló hatását úgy vizsgáltuk, hogy a vegyületeket L. muta vagy B. jararaca méreggel inkubáltuk 30 percig szobahőmérsékleten, majd az elegyet egerekbe injektáltuk (jobb lábpárna), majd az ödémát mértük.

3.6. Statisztikai analízis

az eredményeket a megadott számú állattal vagy elvégzett kísérletekkel kapott adatok szerint fejezzük ki. A kísérleti csoportok közötti különbségek statisztikai szignifikanciáját a hallgatói teszt segítségével értékeltük. A 0,05-ös értéket jelentősnek tekintették.

4. Eredmények és vita

figyelmet érdemel a hatékony, biztonságos, olcsóbb és hozzáférhetőbb antivenomák kifejlesztése, mivel a kígyómarások súlyos fogyatékosságot okozhatnak, és több ezer embert ölhetnek meg. Egyre több tanulmány foglalkozik a kígyómérgek inhibitorainak különféle forrásokból történő keresésével, legyen az természetes vagy szintetikus . A Suramin és a benzoil-fenil-benzoát szintetikus molekulák, amelyek képesek gátolni a különböző családokból származó kígyómérgek myotoxicitását, alvadását, foszfolipáz A2 és hialuronidáz aktivitását. A lakton analógokat szintetizálták és gátolták a myotoxicitást, valamint az ödéma-indukáló és enzimatikus aktivitást, amelyet a B. jararacussu-ból izolált foszfolipáz A2 indukált . Másrészt a tengeri bioaktív elvek széles körben elterjedt farmakológiai hatásuk miatt is felkeltették a figyelmet .

ebben a munkában hat 1-aril-szulfonil-amino-5-metil-1H-triazol-4-karbonsav-etil-észter képességét értékelték, hogy semlegesítsék a B. jararaca és L. által okozott in vitro (hemolízis, alvadás és proteolízis) és in vivo (vérzés és ödéma-indukáló) tevékenységeket. muta mérgek, mivel a korábbi eredmények azt mutatták, hogy ez a hat származék gátolta az L. muta méreg által kiváltott hemolízist, de különböző potenciállal . Ezért úgy gondolták, hogy érdemes lenne megvizsgálni az ilyen származékok hatását a kígyómarásokkal kapcsolatos egyéb fontos biológiai tevékenységekre, mint például a proteolízis, a véralvadás, a hemolízis, a vérzés és az ödéma. Kimutatták, hogy ezek a vegyületek gátolják a B. jararaca (50 6G/mL) és az L. muta (15) méreg által okozott hemolízist (2.A) ábra). A származékok gátló százaléka mindkét méreggel szemben 50% felett volt. A 6-os származék gátló profiljában azonban enyhe különbséget figyeltek meg, ahol a hemolízis 50% – os és 90% – os gátlását sikerült elérni a B. jararaca és az L. muta venom esetében. Sem a származékok, sem a DMSO nem vezette az eritrocitákat hemolízishez, sem a DMSO nem befolyásolta a mérgek által okozott hemolízis mértékét.

(a)

(b)

(a)
(b)

ábra 2

a származékok hatása a hemolízisre és a proteolízisre. Az 1-6-os származékokat (45 MHz) inkubáltuk B. jararaca-val (sötét oszlopok) vagy L. muta-val (szaggatott oszlopok) 30 percig szobahőmérsékleten, majd hemolitikus (A) és proteolitikus (b) aktivitást végeztünk. Az adatokat az egyes kísérletek átlagában fejezzük ki ().

ezeknek a kígyómarásoknak az Envenomációja súlyos vérzést okoz a cinkfüggő metalloproteáz vagy szerin proteáz magas tartalma miatt, amelyek megemésztik az extracelluláris mátrix fehérje komponenseit vagy véralvadási faktorokat fogyasztanak . B. jararaca és L. a muta venom koncentráció-függő módon hidrolizálta az azokazeint, ek-értéke 20, illetve 6, g/mL volt (az adatok nincsenek feltüntetve). A származékok gátolták a B. jararaca vagy L. muta által indukált proteolízist(2.b) ábra). Az 1, 2, 3 és 6 származékok 80% – ig gátolták mindkét méreg által indukált proteolízist, az 5 származék pedig 50% alatt gátolta ezt az aktivitást. Jelentős különbséget figyeltek meg a származékok gátló profiljában a 4.származék esetében, amelyben a B. jararaca vagy az L. muta méreg által indukált proteolízist 97% – kal, illetve 25% – kal gátolta (2. b) ábra).

amint az a 3. ábrán látható, az 1., 2., 4., 5. és 6. származék, de a 3. származék nem gátolta a B. jararaca (40 6 g/mL) vagy az L. muta (10 g/mL) mérgei által indukált fibrinogén alvadását koncentrációfüggő módon (23-94 m). Úgy tűnt, hogy a származékok hatékonyabban gátolják az L. muta-indukáló alvadást, mint a B. jararaca. A legmagasabb koncentrációban (94 dB) az 1-es, 2-es, 3-as, 5-ös és 6-os származékok megakadályozták az L. muta alvadását (3.b) ábra), míg a 2-es és 6-os származékok egyszer megakadályozták a B. jararaca kialakulását(3. B) ábra). 200 6m-ig terjedő koncentrációban az összes 1,2,3-triazol-származék hatékonyan megakadályozta a fibrinogén alvadását, amelyet mindkét méreg okozott, de 10 mm alatti koncentrációban ezen vegyületek egyike sem akadályozta meg a véralvadást. Azonban, amikor a származékokat (10 MHz) összerakták és inkubálták B. jararaca vagy L. muta méreggel, az alvadási idő kétszeresére késett. Megfigyelték, hogy ha a 2.vagy 6. származékot eltávolították a keverékből, akkor nem figyeltek meg gátló hatást az alvadásra. Ezenkívül a származékok megakadályozták a vérsejtek által kiváltott véralvadást is, amikor plazmát alkalmaztak. Sem a DMSO (1% v/v, végső koncentráció), sem a sóoldat nem befolyásolta a koagulációs folyamatokat.

(a)

(b)

(a)
(b)

ábra 3

a származékok hatása a fibrinogén alvadásra. Huszonhárom fő (szürke oszlop), 46 fő (fehér oszlop) vagy 94 fő (Fekete oszlop) származékot inkubáltunk 40 fő (B. jararaca (a)) vagy 10 fő (B) (L. muta) 30 percig szobahőmérsékleten. Ezután az elegyet hozzáadtuk a fibrinogénhez (2 mg/mL), és feljegyeztük az alvadási időt. A mérgeket sóoldattal inkubáltuk (C1); 1% V/v DMSO (C2); 1.származék (1. oszlop); 2. származék (2. oszlop); 3. származék (3. oszlop); 4. származék (4. oszlop); 5. származék (5. oszlop); és 6. származék (6. oszlop). # azt jelenti, hogy a fibrinogén 600 másodperces megfigyelésig nem alvadt meg. Az adatokat az egyes kísérletek átlagában fejezzük ki ().

a B. jararaca (12 mg/Kg) vagy L. muta (20 mg/Kg) méreg intradermális injekciója egerekben 20 mm-es vérzéses halo-t eredményezett. Egy ilyen halo két MHD mérget képvisel. Amikor minden mérget származékokkal kevertek (90 ft), majd egerekbe injektálták, teljes védelmet mutattak a vérzés ellen (az adatok nem jelennek meg). Ezzel szemben a korábbi eredmények azt mutatták, hogy az antilaketikus szérum nem gátolta az L. muta méreg által kiváltott vérzést . A DMSO, a származékok vagy a sóoldat injekciója nem okozott vérzést. Az ödéma kiváltása egy másik fontos hatás, amely a kígyómarást követi . A 4. ábra azt mutatja, hogy az ödéma által kiváltott 5 mg / Kg B. jararaca (4 (A) ábra) vagy 8 mg / Kg L. a muta-t (4. B) ábra) a derivatívák szignifikánsan csökkentették (90 MHz). Az 1., 2. és 4. triazolszármazékok 80% felett gátolták a B. jararaca által kiváltott ödémát, míg a 3., 5. és 6. származékok 70% körül gátolták (4. ábra(a)). Mint látható, az összes származék kevésbé gátolta az L. muta által kiváltott ödémás aktivitást(4.B) ábra).

(a)

(b)

(a)
(b)

ábra 4

a származékok hatása az ödéma-indukáló aktivitásra. A származékokat (90 MHz) 5 mg/Kg B. jararaca (A)-val vagy 8 mg/Kg L. muta (b) – val inkubáltuk 30 percig szobahőmérsékleten, majd ödéma-indukáló aktivitást végeztünk. Az oszlopok az 1. származék plusz méreg (1); A 2.származék plusz méreg (2); a 3. származék plusz méreg (3); A 4. származék plusz méreg (4); az 5. származék plusz méreg (5) és a 6. származék plusz méreg (6). Az adatokat az egyes kísérletek átlagában fejezzük ki ().

összefoglalva, az 1-aril-szulfonil-amino-5-metil-1H-triazol-4-karbonsav-etil-észter származékok prototípusként hasznosak lehetnek új molekulák tervezéséhez, hogy javítsák a B. jararaca és L. muta kígyócsípések jelenlegi kezelését. Ezeknek a származékoknak a gátló hatása változhat, vagy fokozódhat, ha mindet összerakják, valószínűleg szinergikusan hatva. Így alacsonyabb koncentrációra lenne szükség a B. jararaca és L. muta mérgek által okozott biológiai hatások teljes semlegesítéséhez. Továbbá, a származékok szerkezet-aktivitás kapcsolatának korábbi elemzése már megtörtént . A származékokat “Lipinski ötös szabálya” elemzésének vetették alá, amely azt jelzi, hogy egy kémiai molekula orálisan aktív gyógyszer lehet az emberekben, és egy ilyen szabály kimondja, hogy az alábbi szabályok bármelyikét megsértő molekula valószínűleg rosszul szívódik fel: (1) molekulatömege kevesebb, mint 500 Da, (2) a hidrogénkötés-donorok száma (OH vagy NH csoportok) egyenlő vagy kevesebb, mint 5, (3) a hidrogénkötés-akceptorok száma kevesebb, mint 10, és végül (4) kevesebb, mint 5 . Az eredmények azt mutatták, hogy minden származék teljesítette ezt a szabályt (molekulatömeg = 296,31–341,30; 2,6–3,4; nHBA = 8-11 és nHBD = 1-3), ami jó Elméleti Biológiai diszponibilitást mutat .

elismerések

ezt a munkát a Nemzetközi Tudományos Alapítvány (IFS Grant F/4571-1) és a következő Brazil finanszírozó ügynökségek támogatták: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico( CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro Carlos Chagas Anyját (Faperj), Coordinação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (köpeny), valamint Universidade Federal Fluminense/pró-recitoria de Pesquisa e Pós-graduação e Inovação (Uff/PROPPi).