Effetto regolatorio della melatonina sui disturbi delle citochine nei topi lupus indotti da Pristane

Abstract

Il lupus eritematoso sistemico (LES) si sviluppa in relazione a molti fattori ambientali. A nostro avviso, è più importante studiare l’effetto della melatonina sul LES ambientale. Nel presente studio, 0,5 ml di pristane sono stati utilizzati per indurre il LES in topi femmina BALB/C. La melatonina (0,01, 0,1, 1,0 mg/kg) è stata somministrata per via orale immediatamente dopo l’iniezione di pristane per 24 settimane. IgM anti ssDNA e anticorpi istonici sono stati rilevati dopo 0, 1, 2, 4, 8 settimane di iniezione pristane. I livelli di IL-2, IL-6 e IL-13 sono stati rilevati dopo 24 settimane. Sono state osservate anche lesioni renali. I risultati hanno mostrato che la melatonina ha antagonizzato i livelli crescenti di IgM anti ssDNA e autoanticorpi istonici. La melatonina potrebbe anche diminuire la produzione di IL-6 e IL-13 e aumentare la produzione di IL-2. Inoltre, la melatonina potrebbe ridurre le lesioni renali causate da pristane. Questi risultati hanno suggerito che la melatonina ha un effetto benefico sul lupus indotto da pristane attraverso la regolazione dei disturbi delle citochine.

1. Introduzione

Il lupus eritematoso sistemico (LES o Lupus) è una malattia autoimmune che può attaccare il tessuto e le cellule normali del corpo, con conseguente infiammazione e danno tissutale . SLE si verifica a qualsiasi età e in qualsiasi genere. Tuttavia, le donne hanno maggiori probabilità di avere SLE rispetto agli uomini . Inoltre, disturbi nella rete delle citochine sono stati segnalati anche nel LES, inclusi IL-1, IL-2, IL-6, IL-13 e IFN-. Queste citochine hanno strette relazioni con lo sviluppo del LES come la produzione di autoanticorpi e la nefrite immunocomplessa. Ma ci sono alcuni risultati contraddittori sui cambiamenti di alcune citochine in diversi rapporti.

Negli ultimi anni, è stata prestata sempre più attenzione ai fattori ambientali che possono essere implicati nella patogenesi del LES . Le malattie autoimmuni stanno diventando sempre più comuni nei paesi industrializzati e queste malattie possono essere influenzate da fattori ambientali . Pristane è un probabile candidato come innesco ambientale del LES nella popolazione suscettibile. Esperimenti su animali hanno dimostrato che pristane potrebbe indurre sintomi di malattia autoimmune simile al lupus in un ceppo di topi (BALB/c), come alti livelli di autoanticorpi e glomerulonefrite immunocomplessa . Alcune indagini epidemiologiche hanno anche dimostrato che tutte le persone con pristane nel loro sangue avevano distinte malattie autoimmuni o sintomi di malattia autoimmune . Inoltre, pristane trovato in olio minerale, olio di squalo, e molti alimenti sembra essere una possibile esposizione ambientale che può innescare SLE. Quindi potrebbe essere più appropriato ricercare i fattori ambientali coinvolti nel LES utilizzando un modello murino simile a SLE indotto da pristane.

La melatonina è sintetizzata e secreta principalmente dalla ghiandola pineale che può produrre recettori specifici dentro e fuori dal sistema nervoso centrale. La melatonina non solo può influenzare direttamente l’infiammazione e le cellule immunitarie, ma ha anche influenze indirette su di essa attraverso il talamencefalo . Ancora più importante, la melatonina è considerata un importante principio attivo nel sistema neuro-immunitario-endocrino . È in grado di regolare lo squilibrio della rete di citochine in alcune malattie autoimmuni come l’artrite reumatoide e l’artrite adiuvante . Alcuni esperimenti hanno studiato i suoi effetti sui topi MRL-lpr/lpr e hanno dimostrato che la melatonina era benefica per il LES spontaneo nei topi femmine . Poiché l’ambiente è un fattore importante nel LES nella società moderna, eravamo più interessati agli effetti della melatonina sul LES ambientale.

Per studiare il ruolo della melatonina nel LES, specialmente nel lupus correlato all’ambiente, sono stati utilizzati topi indotti da pristane. Sono stati inoltre determinati gli effetti della melatonina sui disturbi delle citochine e i seguenti cambiamenti nel modello SLE indotto da pristane.

2. Materiali e metodi

2.1. Animali

Sessanta topi BALB/c femmina di due mesi (g) sono stati forniti dal Centro sperimentale per animali dell’Anhui Medical University. Tutti i protocolli sperimentali descritti in questo studio sono stati approvati dal Comitato di revisione etica per la sperimentazione animale dell’Istituto di farmacologia clinica, Anhui Medical University.

2.2. Materiali

La melatonina è stata acquistata da Sigma. Pristane, DNA del timo di vitello denaturato a caldo (ssDNA), istone totale del timo di vitello (istone), concanavalin A (ConA) e lipopolisaccaridi (LPS) erano anche da Sigma. Sono stati acquistati anticorpi IgM coniglio-anti-topo coniugati con biotina e avidina etichettata con perossidasi di rafano . I corredi di ELISA di interleuchina-2 del topo ed i corredi di ELISA di interleuchina-6 sono stati acquistati da ADL. I kit ELISA interleuchina-13 del mouse sono stati acquistati da BIOO.

2.3. Protocolli sperimentali

Sessanta topi BALB/c femminili sono stati suddivisi casualmente in sei gruppi: gruppo di controllo normale, gruppo modello, gruppo di trattamento con prednisone che fungeva da gruppo di controllo positivo e gruppi di trattamento con melatonina (0,01, 0,1, 1,0 mg/kg) tra cui gruppo di melatonina uno (MT1), gruppo di melatonina due (MT2) e gruppo di melatonina tre (MT3). Ai topi del gruppo di controllo normale è stata somministrata un’iniezione intraperitoneale di 0.5 ml di soluzione salina normale (NS) e agli altri gruppi è stata somministrata un’iniezione intraperitoneale di 0,5 ml di pristane. I topi nel gruppo di controllo normale e nel gruppo di controllo modello hanno ricevuto la somministrazione intragastrica di NS al giorno dopo il primo trattamento. Ai topi nel gruppo di controllo positivo è stata somministrata una somministrazione intragastrica di 5 mg/kg di prednisone (Pre) al giorno. I topi del gruppo MT1 sono stati trattati intragastricamente con 0,01 mg/kg di melatonina, MT2 0,1 mg/kg di melatonina e MT3 1,0 mg/kg di melatonina. I sieri sono stati prelevati dalla vena della coda prima del trattamento (0) e 2, 4 e 8 settimane dopo il trattamento per misurare il livello di autoanticorpi. Ventiquattro settimane dopo la somministrazione di pristane, tutti i topi sono stati uccisi e gli spleens sono stati rimossi per rilevamenti immunologici; nel frattempo, i tessuti nefrici sono stati esaminati al microscopio ottico.

2.4. Saggi immunoassorbenti legati all’enzima (ELISA) per anticorpi anti-ssDNA e istone

Anticorpi anti-ssDNA e istone IgM sono stati rilevati con una tecnica ELISA simile a quella descritta in . 96-well piastre ELISA rivestite con 10 mg/L ssDNA o antigeni istonici sono stati incubati durante la notte a 4. Il giorno seguente, le piastre sono state lavate con PBS-Tween. Le piastre sono state incubate con tampone bloccante (PBS-2% albumina sierica bovina) durante la notte a 4 e lavate con PBS-Tween. Dopo aver incubato durante la notte a 4 con siero murino diluito a 1 : 250, le piastre sono state lavate di nuovo e poi incubate per 2 ore a 4 con anticorpi IgM antimouse di coniglio coniugato con biotina diluiti a 1: 200. Successivamente, le piastre sono state lavate e incubate per 2 ore a 4 con avidina marcata con perossidasi di rafano in diluizione 1 : 200. Le piastre sono state quindi lavate di nuovo e 100 L di substrato —tetrametilbenzidina (TMB) e soluzione di perossido di idrogeno sono stati aggiunti ai pozzetti per 30 minuti a 37. La reazione è stata terminata con l’aggiunta di 50 L di 2 M H2SO4 per pozzetto. L’intensità del colore giallo è stata letta a 490 nm in un lettore di micropiastre. I sieri di altri otto topi normali BALB / c sono stati raccolti e rilevati contemporaneamente e la densità media e la SD sono state calcolate per fungere da controllo. Gli indici enzimatici medi (EI) dei campioni in diversi gruppi sono stati calcolati come:

2.5. La coltura di cellule della milza e l’induzione di citochine

La coltura di cellule della milza e l’induzione di citochine sono state modifiche dei metodi descritti in . In breve, le sospensioni monocellulari sono state preparate da spleens asetticamente rimosse dai topi e coltivate in piastre di coltura a 24 pozzetti ad una concentrazione finale di cellule/ml. Le cellule sono state coltivate in RPMI-1640 integrate con siero di vitello fetale al 10%, glutammina 2 mm, piruvato di sodio 1 mM, 50 M 2-mercaptoetanolo e 10 ml di penicillina, streptomicina e soluzione antimicotica/L (Sigma). Le colture sono state stimolate con 3 mg/L ConA, 12 mg/L LPS, o mezzo da solo e incubate a 37 in aria umidificata con il 5% di CO2. Il surnatante è stato raccolto a 48 h e conservato a 20 per saggi di citochine.

2.6. Analisi delle citochine

Le concentrazioni di interleuchina-2 (IL-2), interleuchina-6 (IL-6) e interleuchina-13 (IL-13) nel surnatante sono state determinate utilizzando adeguate ELISA commerciali per la forma murina di queste citochine. L’intensità di ciascun campione è stata letta a 450 nm in uno spettrofotometro a micropiastra.

2.7. Tecniche istopatologiche

I reni raccolti durante il sacrificio dei topi sono stati fissati per 24 ore in formalina tamponata neutra prima dell’incorporamento di paraffina. Le sezioni sono state colorate con ematossilina ed Eosina e Jones silver metenamina e poi esaminate al microscopio ottico per la gravità della lesione renale. Sono state osservate glomerulonefrite, lesioni tubulari renali e infiammazione interstiziale e il grado di gravità delle lesioni istologiche caratteristiche della nefrite lupica è stato valutato come assente (), lieve (), moderato () e grave ().

2.8. Analisi statistica

I risultati sono stati espressi come SD. L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando il t-test bidirezionale dello studente con il livello minimo di significatività

3. Risultati

3.1. Effetti della melatonina sui livelli di anticorpi IgM anti-ssDNA e istonici nei Sieri

I livelli di anticorpi IgM anti-ssDNA e istonici erano significativamente diversi tra i gruppi di trattamento con pristane-injection e melatonina(Figure 1(a) e 1 (b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 1

La sera di topi in ciascun gruppo sono stati raccolti prima del trattamento (0), 2, 4 e 8 settimane dopo, e i livelli di IgM anti-ssDNA e Antihistone sono stati rilevati anticorpi da ELISA. EI è stato calcolato secondo la formula. (a) il livello di IgM anti-ssDNA anticorpo in ogni gruppo, (b) il livello di IgM antistone anticorpo in ogni gruppo. I dati sono stati forniti in media±DS (n=6-8). P * <.05, P * * <.01 versus sieri a 0 settimane, P P<.05, P P <.01 rispetto ai sieri nei topi di controllo del modello.

Due settimane dopo una singola iniezione intraperitoneale di pristane, il livello di anticorpi anti-ssDNA IgM nei sieri ha iniziato ad aumentare ovviamente, ha raggiunto il picco a 4 wk, poi ha iniziato a diminuire e infine è tornato alla normalità a 8 wk. Nel gruppo MT1, anche il livello di anticorpi anti-ssDNA IgM nei sieri è aumentato e ha raggiunto il picco a 4 wk, ma poi è diminuito in modo più evidente rispetto al gruppo di controllo modello (). Nel gruppo MT2, il livello di anticorpi anti-ssDNA IgM nei sieri è aumentato durante le prime quattro settimane, ma molto inferiore a quello del gruppo modello (), ed è rimasto normale in altri periodi. Nel gruppo MT3, il livello di anticorpi anti-ssDNA IgM non è aumentato (Figura 1(a)).

Gli anticorpi antistonici nei sieri sono aumentati di 1 settimana dopo l’iniezione, hanno raggiunto il picco a 4 settimane, poi sono diminuiti gradualmente e sono tornati alla normalità a 8 settimane. Nel gruppo MT1, i livelli di anticorpi antistonici nei sieri erano significativamente inferiori a quelli del gruppo di controllo modello () e sono tornati alla normalità a 4 settimane. Nei gruppi MT2 e MT3, i livelli di anticorpi sono aumentati durante le prime quattro settimane, ma molto più bassi rispetto al gruppo modello (), e sono rimasti normali negli altri periodi (Figura 1(b)).

3.2. Effetti della melatonina sulla produzione di citochine

Per ottenere una migliore comprensione dell’influenza della melatonina sulle citochine nel LES, la produzione di citochine di tipo Th1 e Th2 da parte degli splenociti stimolati con ConA o LPS è stata valutata durante il corso del lupus murino. I risultati hanno mostrato che la produzione di IL-2, IL-6 e IL-13 è cambiata nei topi SLE indotti da pristane (Figura 2). La produzione di IL-2 di splenociti da topi nel gruppo di controllo modello era inferiore a quella dei topi normali (), mentre la produzione di IL-6 e IL-13 di splenociti da topi nel gruppo di controllo modello era superiore a quella dei topi normali (). Nei gruppi MT2 e MT3, i livelli di IL-2 erano fino al livello normale e superiori a quello dei topi modello ovviamente (), mentre i livelli IL-6 e IL-13 erano inferiori a quelli dei topi modello ovviamente (, ) (Figura 2).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 2

Tutti i topi sono stati sacrificati alla fine di 24 settimane, e linfociti splenici sono state seminate a 1×106 cellule/pozzetto. Le concentrazioni di IL-2 nei linfociti splenici sono state stimolate per 48 ore con 3 mg/L di ConA. Le concentrazioni di IL-6 e IL-13 nei linfociti splenici sono state stimolate per 48 ore con 12 mg/L LPS. Le concentrazioni di IL-2, IL-6 e IL-13 nei supernatanti di coltura sono state rilevate da ELISA. I dati sono stati forniti in media± DS (n=4-5). P * * <.01, P * <.05 rispetto al gruppo di controllo normale, P P<.05, P P <.01 contro il gruppo di controllo del modello.

3.3. Effetti della melatonina sui cambiamenti istopatologici renali

I cambiamenti istopatologici renali dei topi sono mostrati nella Tabella 1 e nella Figura 3.

(a)

(b)

(c)

d)

(a)
(b)
c)
d)

Figura 3

I reni raccolti al momento del sacrificio sono stati colorati con H&E per l’esame istologico. (a) Gruppo di controllo normale (HE×200). (b) Gruppo di controllo modello (HE×200). (c) Gruppo di controllo modello (HE×400). (d) Gruppo MT (HE×200).

Come mostrato nella Figura 3(a), non sono state osservate anomalie renali nei topi normali. Il volume e il numero di cellule dei glomeruli erano normali. La parete capillare glomerulare era sottile. Non è stato osservato alcun cast proteico nel tubulo. L’infiltrazione dei linfociti e la proliferazione dei fibroblasti non sono state osservate nell’interstiziale renale.

Come mostrato nelle figure 3(b) e 3(c) e nella Tabella 1, la maggior parte dei topi iniettati con pristane ha rivelato anomalie renali che vanno da lievi a gravi. Alcuni glomeruli hanno mostrato atrofia glomerulare con dilatazione dei capillari e ispessimento delle pareti dei capillari. Alcune citazioni hanno rivelato la formazione di trombi. Sono stati osservati anche l’allargamento mesangiale e l’aumento degli strati cellulari. La parete della capsula glomerulare era spessa e lo spazio tra la parete della capsula e le cellule endoteliali scompariva nel glomerulo gravemente colpito. Alcuni tubuli renali hanno mostrato dilatazione e proliferazione delle cellule epiteliali. Sono stati osservati calchi proteici nei tubuli. Un’infiltrazione di cellule infiammatorie come monociti, linfociti e plasmacyte con aggregazione focale è stata osservata nell’interstiziale renale. Sono state osservate anche proliferazioni di fibroblasti interstiziali.

Ci sono stati alcuni miglioramenti di diversi gradi nei topi trattati con melatonina (Figura 3(d) e Tabella 1). L’atrofia glomerulare e l’ispessimento delle pareti dei capillari sono stati modificati in modo lieve o moderato. Anche l’allargamento mesangiale è stato migliorato. Lo spazio tra la parete della capsula e le cellule endoteliali era più piccolo di quello dei topi normali, ma c’era un miglioramento rispetto al gruppo modello non trattato. È stata osservata anche una leggera infiltrazione dei linfociti. Alcuni tubuli renali hanno mostrato una lieve dilatazione e alcuni calchi proteici. Tuttavia, tutti i cambiamenti erano meno gravi di quelli nei topi modello.

4. Discussione

In questo studio sono stati osservati i disturbi immunitari dei topi innescati da pristane e gli effetti della melatonina. Poiché gli anticorpi anti-DNA e istoni erano sensibili nel LES, abbiamo studiato i cambiamenti degli anticorpi anti-ssDNA e antistonici IgM e abbiamo trovato alti livelli di autoanticorpi nei topi iniettati con pristane. Lesioni renali sono state trovate anche nei topi. Questi risultati erano coerenti con le relazioni precedenti. Abbiamo anche scoperto che la melatonina ha antagonizzato i livelli crescenti di IgM anti-ssDNA e autoanticorpi istonici, e la melatonina potrebbe ridurre le lesioni renali causate da pristane. Pristane è un irritante peritoneale. È ben noto che la classe IgM è prodotta dal sottoinsieme delle cellule B B1 (CD5+) e il sottoinsieme B1 è altamente arricchito nella cavità peritoneale ed è espanso nei topi BALB/c, aumentando la possibilità che gli anticorpi anti-ssDNA e antistonici IgM indotti da ip pristane siano derivati dal sottoinsieme . Studi precedenti hanno riferito che la melatonina ha avuto effetti sulla prima risposta immunitaria anticorpale (IgM, IgG) . Alcuni studi hanno indicato che la melatonina aveva una modulazione bidirezionale sui linfociti . Quindi abbiamo pensato che la melatonina potesse migliorare i sintomi del LES modulando la sovrapproduzione di cellule B.

La rete di citochine svolge un ruolo importante nello sviluppo del LES. In alcuni esperimenti in vitro, la melatonina potrebbe inibire gli effetti immunitari di alcune citochine e linfociti T. Così abbiamo osservato gli effetti della melatonina sul disturbo della rete di citochine. IL-6 è pensato come una citochina infiammatoria che viene secreta da una varietà di cellule tissutali, compresi i macrofagi e le cellule Th2. IL livello IL-6 ha una correlazione positiva con l’indice di attività di SLE. I nostri risultati hanno mostrato che il livello di IL-6 è stato aumentato dopo l’iniezione di pristane, mentre la melatonina potrebbe diminuire la produzione di IL-6. Il livello crescente di IL-6 potrebbe indurre le cellule B a nascondere più anticorpi e promuovere lo sviluppo della nefrite . Quindi la downregulation della produzione di IL-6 da parte della melatonina è utile per inibire la produzione di anticorpi e le lesioni renali.

IL-2 è secreto dalle cellule Th1 e IL-13 è secreto dalle cellule Th2. Ci sono alcuni risultati contraddittori nei documenti sui cambiamenti di IL-2 e IL-13. Quindi, in questo modello SLE indotto da pristane, abbiamo studiato i livelli delle due citochine. I nostri risultati hanno rivelato che il livello di IL-2 nei topi iniettati con pristane era inferiore a quello nei topi normali, mentre il livello di IL-13 nei topi iniettati con pristane era superiore a quello nei topi normali. Abbiamo anche scoperto che la melatonina potrebbe diminuire la produzione di IL-13, ma ha aumentato la produzione di IL-2. Molti rapporti hanno mostrato che il livello di IL-2 è diminuito nel LES, specialmente nella fase attiva, e che IL-2 potrebbe ridurre l’attivazione dei linfociti B. Alcune ricerche hanno mostrato che la melatonina potrebbe regolare il livello dei recettori IL-2/IL-2 , che può essere il meccanismo dell’azione inibitoria della melatonina sulla produzione di IL-2. IL-13, una delle citochine più importanti nel lupus, è stato creduto per essere un fattore attivante delle cellule B che ha provocato l’eccessiva produzione di molti autoanticorpi . IL-13 ha relazione con le lesioni renali di SLE . Quindi la downregulation della produzione di IL-13 da parte della melatonina è anche utile per inibire la produzione di anticorpi e le lesioni renali.

Il livello decrescente di citochina di tipo Th1 e i livelli crescenti di citochina di tipo Th2 hanno anche indicato che c’è stato uno spostamento da Th1 verso Th2 nel lupus indotto da pristine. Alcuni rapporti hanno mostrato che la melatonina esogena potrebbe attivare le cellule T e promuovere significativamente le citochine di tipo Th1, che partecipano alla regolazione dei disturbi immunitari . I nostri risultati hanno mostrato che la melatonina potrebbe upregulate le citochine di tipo Th1 e downregulate le citochine di tipo Th2. E che ha indicato la melatonina potrebbe modulare il disturbo della rete di citochine nei topi SLE regolando lo squilibrio di Th1 / Th2.

Il prednisone, che è un farmaco comune per SLE, è stato servito come farmaco positivo in questo studio. Abbiamo scoperto che il prednisone ha avuto un effetto regolatore sul LES indotto da pristane. Rispetto al prednisone, la melatonina ha avuto un effetto simile o poco precedente sui sintomi del LES. Come sappiamo, le reazioni avverse del prednisone sono più comuni e gravi della melatonina. Così abbiamo pensato che la melatonina possa essere un potenziale farmaco per SLE.

In conclusione, il lupus indotto da pristane mostra disturbi nel sistema immunitario, come un alto livello di autoanticorpi e uno squilibrio della rete di citochine, che induce la nefrite seguita. I cambiamenti sono simili al lupus umano e pristane è comune nell’ambiente; quindi questo modello è appropriato per studiare gli effetti della melatonina sul LES ambientale. D’altra parte, abbiamo anche dimostrato che la somministrazione di melatonina inibiva i cambiamenti nel lupus indotto da pristane. E questo ha suggerito che la melatonina avesse un effetto benefico sul lupus ambientale. I meccanismi potrebbero comportare la sua modulazione dei disturbi nel sistema immunitario, specialmente nella rete di citochine. Tuttavia, ulteriori studi dovrebbero essere necessari per una migliore comprensione del processo di regolazione e del fattore chiave per la sua azione sulle malattie autoimmuni.