La beta-ciflutrina formulata mostra un’ampia divergenza nella tossicità tra le specie di uccelli

Abstract

Si presume generalmente che la tossicità degli insetticidi piretroidi per gli uccelli sia trascurabile, sebbene poche specie siano state testate. La tossicità acuta orale della beta-ciflutrina formulata è stata determinata per i canarini (Serinus sp.= = Note = = = = altri progetti = = = = collegamenti esterni = = * sito ufficiale Dosi singole sono state somministrate agli adulti mediante sonda gastrica. Le dosi letali approssimative 50 () e i loro intervalli di confidenza sono stati determinati da un design D-ottimale approssimativo. I canarini sono risultati essere sostanzialmente più sensibili alla beta-ciflutrina formulata ( mg/kg) rispetto alle altre due specie testate (mg/kg e mg/kg, resp.). Il risultato ottenuto per le canarie è stato anche notevolmente inferiore ai valori di tossicità tipici disponibili in letteratura per i piretroidi. Questo studio sottolinea la necessità di testare una gamma più ampia di specie con insetticidi potenzialmente tossici, utilizzando moderni test su e giù con un numero minimo di uccelli.

1. Introduzione

L’uso diffuso di pesticidi contribuisce al declino della popolazione e alla mortalità degli uccelli negli agroecosistemi . Tra le varie categorie di pesticidi, gli insetticidi presentano in genere un rischio più elevato di effetti acuti a causa delle loro elevate tossicità intrinseche e dell’elevato potenziale di esposizione. I casi documentati di mortalità di massa per intossicazione e i vari studi che riportano gli effetti negativi degli insetticidi sugli uccelli sono una chiara prova del rischio rappresentato dagli insetticidi sulle specie di uccelli selvatici (ad esempio ). Un caso di mortalità di massa di uccelli che ha ricevuto molta attenzione in Argentina è stata la mortalità 1995-1996 dei falchi di Swainson causata da monocrotophos, un insetticida organofosforico . Dopo questo evento, la registrazione di monocrotophos è stata annullata in Argentina mentre gli insetticidi piretroidi hanno guadagnato in importanza e popolarità.

Tra gli insetticidi, i piretroidi sono una classe di insetticidi sintetici neurotossici ampiamente utilizzati a causa della loro relativa sicurezza per mammiferi e uccelli, alta potenza insetticida a bassi dosaggi e rapida biodegradazione . I canali del sodio dell’assone degli insetti sono 100 volte più sensibili agli esteri piretroidi rispetto ai canali dei mammiferi . Per questi motivi, i piretroidi hanno gradualmente sostituito gli insetticidi organoclorurati, organofosfati e carbammati nel campo. Diversi studi sui piretroidi sono stati condotti su vertebrati (ad esempio, ), la maggior parte su roditori (ad esempio, ). La neurotossicità dei piretroidi nei mammiferi dipende dalla configurazione stereochimica e dalla struttura piretroide . Al contrario, si sa poco della tossicità dei piretroidi per gli uccelli, probabilmente perché questa classe di insetticidi è generalmente considerata una tossicità trascurabile per gli uccelli.

Beta-ciflutrina (cyano-(4-fluoro-3-phenoxyphenil)-methyl-3-(2,2-dichloroethenyl)-2,2-dimethyl-cyclopropanecarboxylate) è il principio attivo delle formulazioni insetticide utilizzate per controllare un’ampia varietà di parassiti sulle colture di cotone, mais, girasole e soia. Come altri piretroidi, la beta-ciflutrina presenta un’interazione stereoselettiva con una frazione dei canali del sodio delle membrane neuronali, con conseguente prolungamento delle correnti di sodio interne evocate nei neuroni da ogni impulso in entrata di stimolazione eccitatoria . La beta-ciflutrina è una miscela di quattro diastereomeri, con diastereomeri II e IV predominanti e determinanti le proprietà chimiche e fisiche della sostanza . La beta-ciflutrina è un piretroide di tipo II, con un caratteristico gruppo ciano sul carbonio alfa. I piretroidi di tipo II presentano una maggiore efficacia insetticida e una maggiore tossicità rispetto ai piretroidi di tipo I. Gli esteri di tipo II mantengono aperto il canale del sodio per un periodo di tempo più prolungato rispetto agli esteri di tipo I. I principali segni di intossicazione dei piretroidi di tipo II nei mammiferi includono coreoatetosi e salivazione (CS) .

La LD50 riportata di beta-ciflutrina agli uccelli nel manuale dei pesticidi è >2000 mg/kg nella quaglia giapponese. L’USEPA nel suo database” ECOTOX ” (http://cfpub.epa.gov/ecotox/) fornisce lo stesso valore, ma associato al bobwhite settentrionale. Tuttavia, le informazioni non pubblicate citate in un rapporto senza dettagli sul veicolo o sulla formulazione hanno dato una LD50 di ca. 100 mg / kg per la beta-ciflutrina nelle Canarie, nonché i valori più usuali per il bobwhite settentrionale e l’anatra reale di >2000 mg / kg . Questo valore per i canarini, se reale, getta dubbi sulla saggezza generale che i piretroidi non sono tossici per gli uccelli. Il presente studio ha avuto per la conferma indipendente oggettiva della LD50 di beta-ciflutrina alle Canarie e determinare la tossicità orale acuta della beta-ciflutrina formulata commercialmente a due specie nuove e selvatiche, il cowbird lucido (Molothrus bonariensis) e la colomba dalle orecchie (Zenaida auriculata).

2. Materiali e metodi

2.1. Sito e condizioni generali di studio

Lo studio è stato condotto nelle strutture di ricerca dell’INTA (Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria) presso la Stazione sperimentale agricola di Paraná (31°50’53″S, 60°32’19″W). Lo studio è stato condotto in una voliera di 20 × 10 m, compresa un’area di acclimatazione con 6 gruppi di recinti (ciascuno 3 × 2 × 3 m) e 24 singole gabbie di prova (ciascuna 0,5 × 0,5 × 0,5 m). Sono stati registrati il fotoperiodo e la temperatura media della sala prove durante il dosaggio (Tabelle 2 e 3). La ventilazione è stata controllata in modo da mantenere le condizioni interne di temperatura e umidità all’interno delle gamme ambientali esterne.

2.2. Selezione, cattura e alloggiamento di uccelli

Gli uccelli selvatici, i cowbirds lucenti e le colombe dalle orecchie sono stati selezionati in base al loro gran numero nei campi circostanti, il che ha assicurato la loro disponibilità, abbondanza e successo di cattura. I cowbirds lucenti sono stati catturati con reti di nebbia e colombe dalle orecchie con trappole per esche. Sono stati usati canarini allevati in cattività. Gli uccelli adulti sani sono stati ponderati e raggruppati per sesso prima di essere acclimatati a condizioni sperimentali per almeno 14 giorni. Almeno tre posatoi da 1,5 m sono stati collocati in ciascuna penna. I cowbirds lucenti sono stati nutriti cibo commerciale certificato insettivoro, colombe dalle orecchie sono stati offerti un mix di grano e semi di girasole, e canarini, un mix di semi commerciali e uova macinate. L’acqua in bottiglia per il consumo umano è stata offerta ad libitum a tutte le specie. A causa dell’assenza di un comitato per la cura degli animali costituito presso l’INTA o presso l’università locale (Universidad Nacional del Litoral) che ha fornito la supervisione accademica di questa ricerca, sono state seguite le linee guida del Denver Wildlife Research Center del Dipartimento dell’Agricoltura degli Stati Uniti per la cattura, il trasporto, l’alloggio, la cura, l’eutanasia e

2.3. Chimica e Dose

Per ottenere le dosi di prova (mg beta-ciflutrin/kg di peso corporeo), abbiamo utilizzato una formulazione commerciale (Bulldock di Bayer CropScience), una sospensione di 12,5 g a.i./100 mL di ingredienti inerti non dichiarati. Abbiamo ipotizzato che la concentrazione in etichetta sia stata correttamente segnalata e abbiamo somministrato agli uccelli il volume necessario di prodotto formulato corrispondente alla dose richiesta di beta-ciflutrina. È noto che la tossicità piretroide può essere fortemente influenzata dal veicolo di dosaggio . Poiché gli uccelli selvatici sono esposti a prodotti formulati, abbiamo scelto di testare la formulazione senza un veicolo aggiuntivo dove possibile e con acqua distillata come diluente per diverse dosi per i canarini (vedi diluizioni nelle note a piè di pagina della tabella 3).

Le dosi sono state calcolate in base alle equazioni standard per ciascuna fase del progetto D-ottimale approssimativo, in milligrammi di a. i. per chilogrammo di peso corporeo, come mostrato nella Tabella 3. I volumi di dosaggio sono stati calcolati in base al peso corporeo individuale misurato entro 12 ore dalla somministrazione (Tabella 1). Per prevenire il rigurgito, i volumi di dosaggio più elevati (>0,17 mL per i canarini, >0,45 mL per i cowbirds lucidi e >1,0 mL per le colombe dalle orecchie) sono stati suddivisi e somministrati in un massimo di quattro aliquote separate da 15 minuti. Questa somministrazione frazionata delle dosi ha avuto luogo per tutte le specie del test limite, per un canarino nella prima fase del test completo e per tutti gli uccelli selvatici e le colombe dalle orecchie lucide in tutte le fasi del test completo (tabella 1). I volumi di dosaggio non hanno mai superato i 16 ml/kg di peso corporeo nelle Canarie, i 27 ml/kg di peso corporeo nei cowbirds lucenti e i 26 mL/kg di peso corporeo nelle colombe dalle orecchie. La sostanza in esame formulata è stata somministrata mediante sonda gastrica. Il catetere è stato lubrificato con vaselina per diminuire il possibile disagio quando introdotto. Gli individui che hanno rigurgitato parte o tutta una dose e che sono sopravvissuti alla dose sono stati sostituiti per altri a causa del fatto che il rigurgito modifica la dose e impedisce la corretta approssimazione della LD50 . Quarantasei per cento dei cowbirds lucidi, 33% delle colombe eared e 16% dei canaries rigurgitato, pur essendo digiunato prima della dose.

2.4. Procedura

Le prove di tossicità orale acuta sono state effettuate seguendo il progetto di orientamento 223 dell’Organizzazione per la cooperazione e lo sviluppo economico . Questa procedura riduce al minimo il numero di uccelli utilizzati e ha un’ampia convalida statistica.

In primo luogo, cinque individui di ciascuna specie sono stati trattati con una dose limite di 2000 mg/kg di sostanza chimica in esame. A seguito di qualsiasi mortalità a questa dose limite, la DL50 è stata stimata in fasi sequenziali con la progettazione approssimativa D-ottimale (test completo; Figura 1). Nelle Canarie, la prima fase del test completo è stata effettuata per confermare e migliorare la stima iniziale della LD50 delle Canarie (250 mg/kg, sulla base del valore della letteratura sopra menzionato e del risultato di un test limite). Un ulteriore stadio è stato aggiunto per ottenere un maggiore livello di precisione.

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Figura 1

Schema della metodologia utilizzata.

I volatili sono stati assegnati in modo casuale a ciascun test e sono stati osservati per 14 giorni dopo la dose. Sono stati registrati mortalità, sintomi clinici, variazione di peso tra l’inizio e la fine dello studio, rigurgiti, tempo di morte (in ore) e recupero.

Sia gli animali di prova che quelli di controllo sono stati esaminati mediante necroscopia per determinare le differenze macroscopiche. Sono state esaminate le dimensioni, la posizione e l’aspetto di tutti gli organi e l’intero tratto g.i. Inoltre, sono stati pesati fegati e cuori e calcolati i loro pesi relativi (1), al fine di rilevare qualsiasi patologia associata a qualsiasi perdita o aumento della massa di questi organi (epatomegalia, necrosi, ipertrofia, ecc.).

2.5. Analisi statistica

Adattiamo un modello probit ai dati combinati di tutte le fasi (STAT-SAS 6.1) per ottenere le stime della DL50, intervalli di confidenza confidenze e pendenze delle curve dose-risposta. Sia i pesi corporei iniziali che finali e i pesi relativi di cuori e fegati sono stati confrontati da ANOVA a senso unico utilizzando SPSS v. 10 per Windows.

3. Risultati

3.1. Test limite

Le stime iniziali di LD50 ottenute per i test limite erano di 2247 mg/kg sia per i cowbirds lucenti che per le colombe dalle orecchie perché il 40% degli individui è morto in entrambe le specie. Al contrario, tutti i canarini trattati sono morti ed è stato quindi impossibile ottenere una stima iniziale di LD50 con il test limite (Tabella 2).

3.2. Test completo

Con le canarie, i valori di LD50 stimati in ogni fase sequenziale erano rispettivamente di 68 mg / kg, 110 mg/kg e 170 mg/kg. Durante la fase aggiuntiva (simile alla terza fase, eseguita al fine di ridurre gli intervalli di confidenza della LD50), due dei quattro individui che hanno ricevuto la dose più alta hanno rigurgitato e, per questo motivo, non sono stati inclusi nei risultati. Per i cowbirds lucidi e le colombe dalle orecchie, sebbene le dosi somministrate nel secondo stadio fossero le stesse a causa di risultati simili nel test limite, la mortalità era diversa (Tabella 3). Le stime della DL50 dopo il secondo stadio sono state rispettivamente di 1589 mg/kg e 2338,6 mg/kg per i cowbirds lucidi e le colombe dalle orecchie. Le stime finali della DL50, ottenute adattando un modello probit ai dati combinati di tutte le fasi per ciascuna specie, sono state di 170 ± 41 mg/kg per le canarie, 2234 ± 544 mg/kg per gli uccelli codardi lucenti e 2271 ± 433 mg/kg per le colombe dalle orecchie. Le curve dose-risposta sono mostrate nella Figura 2.

Figura 2

Curve dose-risposta.

I segni clinici includevano aspetto increspato, salivazione (evidenziata da movimenti di deglutizione costante e scuotimento della testa), diminuzione dell’attività, prostrazione, ansimante, respiro affannoso, tremore corporeo, perdita di equilibrio e/o convulsioni. I segni sono comparsi poco dopo la somministrazione e sono durati da pochi minuti a poche ore. C’erano dosi che non producevano segni clinici e altre che permettevano il recupero di individui con segni di intossicazione, comprese le convulsioni (Tabelle 2 e 3). Tutti i recuperi sono stati effettuati entro le prime 24 ore dopo il dosaggio. I pesi predose e postdose di 14 giorni sono riportati nella Tabella 4. Non ci sono state differenze significative tra il peso corporeo dei sopravvissuti prima della somministrazione e 14 giorni dopo la dose, ad eccezione delle canarie nella terza fase del test completo in cui i pesi post-dose di 14 giorni erano più alti dei pesi da predosio (). Il tempo massimo per morire era 1.75 ore nelle Canarie, 3 ore nelle colombe dalle orecchie e 5 ore nei cowbirds lucenti. Solo i canarini hanno mostrato una tendenza verso un tempo di morte più breve con l’aumento della dose (Figura 3).

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Figura 3

Tempo di morte come una funzione della dose (solo le dosi che ha causato la morte sono visualizzate).

Tutti gli uccelli morti presentavano rigidità degli arti anteriori e posteriori. Abbiamo osservato un liquido denso bianco in diverse sezioni del tratto g. i., attribuibile alla formulazione insetticida. Non sono state rilevate differenze macroscopiche tra gli organi degli individui trattati e di controllo. I pesi relativi di cuore e fegato ( e ) non variavano (in tutti i casi).

4. Discussione

Il valore LD50 che abbiamo ottenuto alle Canarie si avvicina al valore presentato nel rapporto sulla beta-ciflutrina della Commissione Europea , confermandolo come moderatamente tossico o di classe II per questa specie. I valori LD50 per la beta-ciflutrina formulata ottenuta in uccelli cowbirds lucidi (un’altra specie di passeriformi) e colombe dalle orecchie, sono vicini ai valori riportati per quaglia bobwhite e quaglia giapponese , confermando beta-ciflutrina per essere praticamente non tossico o classe III per quelle specie. Alcune cure sono necessarie prima di attribuire queste differenze di sensibilità esclusivamente alla filogenesi. La variazione nelle procedure di dosaggio potrebbe aver introdotto variazioni indesiderate nei nostri risultati. Questi sono discussi in dettaglio di seguito.

La diversa sensibilità alla beta-ciflutrina tra canarini e altri uccelli testati può essere dovuta a differenze nelle caratteristiche dei siti di azione tossica, nell’assorbimento intestinale, nel metabolismo e/o nell’eliminazione di questa sostanza. Ad esempio, la bassa tossicità acuta della cipermetrina alla quaglia era stata spiegata da un’elevata resistenza del SNC delle quaglie agli effetti letali della cipermetrina, un metabolismo più esteso a un gran numero di prodotti e una rapida eliminazione negli escrementi . È possibile che meccanismi fisiologici simili si verifichino nei cowbirds lucenti e nelle colombe dalle orecchie, spiegando la loro bassa suscettibilità alla beta-ciflutrina. Inoltre, sia le differenze significative nella sensibilità nei siti di azione tossica che le differenze metaboliche e le diverse principali vie di disintossicazione e attività enzimatiche possono svolgere un ruolo importante nelle risposte differenziali a questi insetticidi. D’altra parte, le differenze nelle dimensioni del corpo tra le tre specie di uccelli incluse in questo studio potrebbero aver influenzato i risultati. Sulla base di ricerche allometriche condotte da Mineau et al. , le piccole dimensioni del corpo del canarino rispetto alle altre due specie potrebbero aver contribuito alla maggiore sensibilità.

I fattori relativi all’impostazione sperimentale e alle nostre procedure potrebbero aver influenzato i risultati di questo studio. Una relazione tra la temperatura e gli effetti tossici dei piretroidi è stata dimostrata per diversi gruppi di animali, tra cui insetti, anfibi e mammiferi . Nel nostro studio, sono state notate variazioni nelle temperature ambiente al momento di ogni fase del test (Tabella 3). Tuttavia, anche quando la variazione era leggermente più alta nel caso di cowbirds lucenti, è improbabile che abbia influenzato i risultati perché abbiamo ottenuto la LD50 attraverso dati combinati da stadi sequenziali con temperature diverse. Inoltre, i volumi di dose variabili e le somministrazioni frazionate possono avere aumentato la variabilità tra gli animali da esperimento . Nel nostro lavoro ai canarini è stato somministrato un volume ben inferiore a quello utilizzato per le altre due specie (Tabella 1). Wolansky et al. ha dimostrato che l’aumento della quantità di olio di mais consegnato con una dose di bifenthrin, un altro piretroide sintetico, ha cambiato il corso del tempo e la potenza del pesticida nei ratti (una doppia differenza di potenza è stata osservata per un aumento di 5 volte nell’olio di mais). L’uso di olio come agente di dosaggio deve essere evitato quando vengono testati pesticidi altamente lipofili. Speriamo di aver evitato questo problema dosando con la formulazione ordinata dove possibile, e quindi non modificando la concentrazione relativa di pesticidi nella soluzione di dosaggio. Confrontando il numero di aliquote (Tabella 1) con la mortalità nei test (Tabella 3), suggerisce che il regime di dosaggio esatto probabilmente non ha influenzato i nostri risultati dei test in larga misura. Infine, poiché abbiamo testato il materiale formulato (con inerti sconosciuti) piuttosto che il principio attivo, non possiamo accertare definitivamente se il canarino è più sensibile al principio attivo o ad uno dei formulanti. Tuttavia, la somiglianza con il valore citato per l’a. i. dall’Unione Europea e la relativa mancanza di tossicità dei formulanti nelle altre due specie (con valori LD50 simili a quelli ottenuti in quaglia o germano reale con il solo principio attivo) suggerisce differenze di sensibilità al piretroide e non agli inerti inclusi nel materiale formulato.

I sintomi clinici osservati in risposta a dosi elevate nelle tre specie di uccelli sono in accordo con quelli descritti da Sheets et al. nei ratti trattati con beta-ciflutrina e quelli osservati da Qadri et al. , che ha testato permetrina e cipermetrina nei polli. Questi sintomi consistevano in diminuzione dell’attività, tremori in tutto il corpo, salivazione, respirazione agitata, postura appiattita e coreoatetosi. I sintomi di intossicazione nervosa sono stati osservati poco dopo l’assunzione e sono durati fino a poche ore, indicando che la rimozione dei piretroidi dal sistema nervoso è rapida . I sopravvissuti di tutte le specie non hanno mostrato perdita di peso corporeo, almeno alla fine del periodo di osservazione di 14 giorni (Tabella 4). Inoltre, il peso corporeo dei canarini è aumentato significativamente durante la terza fase del test completo. Singh et al hanno osservato un aumento del peso corporeo dopo trattamento acuto con beta-ciflutrina su ratti albini. Questi autori postulano che l’aumento del peso corporeo può essere dovuto all’eccessiva assunzione di cibo e acqua e all’aumento dell’efficienza di conversione alimentare dei gruppi trattati rispetto a quelli controllati.

Tutti i decessi si sono verificati entro 24 ore dopo la dose, probabilmente perché i livelli di picco nel sangue, nel fegato, nei muscoli e nel cervello sono stati raggiunti il primo giorno di trattamento . I tempi di morte nei cowbirds lucenti e nelle colombe dalle orecchie erano abbastanza simili a quelli ottenuti con fenvalerate da Mumtaz e Menzer nelle quaglie giapponesi (da 4 a 8 ore). Il recupero rapido è una caratteristica dell’avvelenamento con piretroidi nei mammiferi . Nelle tre specie di uccelli, anche gli individui a cui sono state somministrate dosi che si avvicinano alla DL50 si sono ripresi rapidamente (Tabella 3). Pascual et al. ha riportato un’alta frequenza di rigurgito nelle colombe come abbiamo fatto noi. I rigurgiti non erano così frequenti nelle Canarie, suggerendo differenze nella loro capacità fisiologica di rigurgitare. Poiché gli individui che hanno rigurgitato sono stati sostituiti per altri, i risultati non sono stati influenzati dal rigurgito in questo studio.

Studi acuti e subacuti hanno dimostrato che i piretroidi ad alte dosi causano ipertrofia epatica e, se la morte non si verifica, questi cambiamenti hanno dimostrato di essere reversibili . Tuttavia e come in Yavasoglu et al. , che ha lavorato con cipermetrina in ratti, i pesi relativi del fegato () – come misura indiretta dei cambiamenti nella salute o nella funzione del fegato-non hanno mostrato alcun effetto della dose. Sebbene ci siano studi in vitro sugli effetti dei piretroidi sul muscolo cardiaco di ratti e cavia , gli effetti associati alla perdita o all’aumento della massa cardiaca non sono stati rilevati qui.

In conclusione, sebbene vi fossero fattori che potrebbero esacerbare le differenze di suscettibilità all’interno o tra le specie (ad esempio, volumi di dose variabili, schema di dosaggio multiplo, temperature ambiente variabili, dimensioni corporee, ecc.), l’alta sensibilità delle canarie alla beta-ciflutrina è stata corroborata. D’altra parte, la beta-ciflutrina formulata è risultata praticamente non tossica per i cowbirds lucidi e le colombe dalle orecchie. Questi risultati sottolineano la necessità di testare una gamma più ampia di specie prima di generalizzare la tossicità dei piretroidi (e possibilmente di altri pesticidi) per gli uccelli. Nel caso specifico della beta-ciflutrina, sebbene siano generalmente utilizzati bassi tassi di applicazione sul campo (7,5-20 g a.i./ha secondo Tomlin ), è necessario considerare la potenziale variazione della tossicità di questo pesticida al fine di valutare pienamente la sua sicurezza per gli uccelli. Nel caso in esame, un approccio alla sensibilità delle specie suggerirebbe che altre specie di uccelli, in particolare le specie di piccolo corpo, mostreranno una maggiore sensibilità ai piretroidi. Sono necessarie ricerche future per spiegare perché le canarie sono più sensibili alla beta-ciflutrina, per determinare se le canarie sono similmente più sensibili ad altri piretroidi e, cosa più importante, se le specie selvatiche legate filogeneticamente alle canarie presentano anche un’alta sensibilità ai piretroidi.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano Environment Canada e Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) che hanno finanziato e sostenuto questo lavoro. Inoltre, ringraziano il Dr. Brian Collins per la sua collaborazione statistica essenziale; Dr. Julie Brodeur per la sua recensione, personale INTA, e Natalia Bossel che ha collaborato su catture e fornitura di materiali; Juan Carlos Reboreda, per il suo prezioso contributo su shiny cowbird husbandry; entrambi i direttori del EEA-Paraná come il Centro regionale Entre Ríos, che ha sostenuto questo lavoro nella Stazione sperimentale di Paraná; infine due arbitri anonimi che hanno fornito commenti utili su bozze precedenti.