1,2,3-トリアゾールの抗毒素効果RopsjararacaおよびLachesis mutaヘビ

概要

ヘビ毒は、酵素と非酵素の両方のタンパク質の複雑な混合物であり、いくつかの生物学的効果を産生する原因となっている。 ヘビのかみ傷による人間のenvenomationはhemostasisの豪華な変更によって特徴付けられる複雑な病態生理学的な映像を特にviperid家族誘導し、頻繁に出血はまた見られます。 本研究は、Bothrops jararacaとLachesis mutaの毒によって引き起こされるいくつかの薬理学的効果を阻害する一連の1,2,3-トリアゾール誘導体の六つの能力を報告しています。 Ｉｎｖｉｔｒｏアッセイでは，これらの化合物は濃度依存的に障害され，フィブリノーゲンまたは血しょう凝固，溶血，および両方の毒によって産生される蛋白質分解であることが示された。 さらに，これらの化合物はｉｎｖｉｖｏでの生物学的効果も阻害した。 これらの化合物で処理したマウスは、そのような毒によって引き起こされる出血性病変から完全に保護された。 しかし、唯一のB。 ｊａｒａｒａｃａ浮腫誘導活性はトリアゾールによって中和された。 したがって、ヘビ毒のいくつかのin vitroおよびin vivo生物学的アッセイに対するトリアゾール誘導体の阻害効果は、効果的な抗毒素の産生を改善したり、抗毒素の中和、特に抗毒素によって部分的に中和される局所病理学的効果を補完する分子モデルとしてそれらを示す可能性がある有望な側面を指摘している。

1. はじめに

ヘビ毒は、酵素（メタロプロテイナーゼ、セリンプロテイナーゼ、ホスホリパーゼA2、L-アミノ酸オキシダーゼ）を含むタンパク質と、酵素活性のないタンパク質、例えばディステイン、C型レクチン、システインが豊富な分泌タンパク質（クリスプ）毒素、ナトリウム利尿ペプチド、ミオトキシンの複雑な混合物である。 毒のあるピットバイパー Bothrops jararacaとLachesis mutaは、南アメリカのいくつかの地域で人間が関わる事故の原因となっています。 B.jararacaはブラジル南部、パラグアイ、アルゼンチン北部で発見されているが、L. ムタは、エクアドル東部、コロンビア、ペルー、ボリビア北部、ベネズエラ東部と北部、ガイアナ、フランスのガイアナ、スリナム、ブラジル北部に至るまで、アンデス山脈の東の赤道林に分布している。 その範囲内で、彼らはしばしば豊富であり、ヘビの重要な原因です。 これらのヘビによってEnvenomingは全身（一般化された出血、coagulopathy、腎不全および衝撃）およびローカル効果（出血、浮腫および壊死）によって主に特徴付けられます。 他の場所で報告されているように、ヘビの咬傷は、ラテンアメリカおよび他の熱帯および亜熱帯諸国で公衆衛生問題を構成し、世界保健機関（WHO）によると、 南アメリカでは、B.jararacaはl.muta（およそ2%）よりかみ傷（95%）の高い発生を引き起こします;但し、L.mutaのかみ傷は通常より厳しいenvenoming徴候をもたらし、致死の発生はB.jararaca この頃は、動物得られた抗毒素の非経口的な管理はsnakebitesによってenvenomingのための唯一の特定の処置です。 ブラジルでは，Ｂｏｔｈｒｏｐｓ多価抗毒素のいずれかの静脈内投与が，アマゾン地域のｌ．mutａおよびｂｏｔｈｒｏｐｓ（ｂ．ａｔｒｏｘ）ヘビ咬傷に対するｂｏｔｈｒｏｐｓ咬傷または多価ｂｏｔｈｒｏｐｉｃ-ｌａｃｈｅｔｉｃ血清によって引き起こされるenvenoming症例を治療するために使用される。 上記のように、中等度から重度の環境は、出血、筋壊死、凝固障害、心血管ショック、腎不全、最終的には死などの局所的および全身的変化の複雑なシリーズによ 他の著者によって報告されているように、安全であるにもかかわらず、証明されたか疑われたBothrops/Lachesis envenomingと患者を扱うのにブラジルで時々使用される抗毒素の高用量は早いanaphylacticおよび遅い（血清の病気）タイプ反作用に貢献するかもしれません。 したがって、適切な品質の抗毒素の生産はかなりの課題を提示する。 さらに、抗毒素の価格が上昇し、一部の国では製造が中止されています。 ある抗毒素は効率的に毒の全身の毒性作用を中和します;但し、ローカル効果は妨げられないし、この状態は切断か不能の原因となる場合があります。

このような問題のために、代替治療法が模索されており、そのうちのいくつかは毒の全身的および局所的影響を中和することができる新しい分子 植物および他の天然源（海洋生物からのものなど）からの抽出物は、ヘビ毒の様々な生物学的および毒性作用を中和する能力について試験されている。 様々な薬理学的に活性な分子が同定されており、それらの抗毒素能力を含む多くの効果が既に記載されている。 今日では、多くの新しいバイオプロスペクティングアプローチが調査されています。 しかしながら、これに関連して、有機合成に由来する分子の生物学的効果はまだ十分に検討されていないことに留意すべきである。 文献はantiplatelet活動、anticlotting、抗ウィルス性、trypanocidal、抗菌、および/または統合失調症およびleishmaniasisの処理の使用のような異なった病理学のプロフィールを、表わす5メンバー窒素の複素環式システムの重要なクラスとして1,2,3-トリアゾールの混合物を記述しました。 1,2,3-トリアゾール環の構築には、ハウスゲン1,3-双極子環化付加反応、特に銅(I)触媒環化付加反応、およびβ-置換-α-ジアゾカルボニル化合物の分子内1,5-電気環化反応が利用可能である。 我々の以前の研究は、六つの新しい合成1,2,3-トリアゾール化合物（1-アリールスルホニルアミノ-5-メチル-1H-トリアゾール-4-カルボン酸エチルエステル）は、L.muta毒 実際には、このような誘導体は、薬理学的活性の広い範囲を表示しました。

この研究の目的は、Bothrops jararacaとLachesis muta毒のin vivoおよびin vitro活性に対する–1-(p-クロロフェニル)-1H-トリアゾール-4-カルボヒドラジドに基づいて、これらの六つの1,2,3-トリアゾール誘導体の能力を評価することであった。

2. 素材

2.1. 毒および材料

Bothrops jararaca、Lachesis muta凍結乾燥毒、および抗Lachesisまたは抗Bothropic抗毒素をFundação Ezequiel Dias、Belo Horizonte、MG、ブラジルから提供し、アッセイまで-20℃で保存した。 ジメチルスホキシド（ＤＭＳＯ），ウシフィブリノゲン，アゾカセインをＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から得た。 他のすべての試薬は、利用可能な最高グレードのものであった。

2.2. 合成誘導体

六つの1-アリールスルホニルアミノ-5-メチル-1H-トリアゾール-4-カルボン酸エチルエステル誘導体は、以前の報告に従って合成され、その化学構造は図1に示されている。 これらの化合物をジメチルスホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、必要になるまで４℃で保存した。

フィギュア1

六つの1,2,3-トリアゾール誘導体N’-1-(p-クロロフェニル)-1H-トリアゾール-4-カルボヒドラジドの化学構造。 6つの導関数は、各導関数の後の括弧に示すように、数値として設計されました。

2.3. 動物＜８ ６ １ ９＞＜１ ４ ４ ９＞ＢＡＬＢ／ｃマウス（１ ８〜２ ０ｇ）を、Ｆｅｄｅｒａｌ Ｆｌｕｍｉｎｅｎｓｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＮｅｕｃｌｅｏ ｄ Ｅ Ａｎｉｍａｉｓ ｄ ｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏ（ＮＡＬ）から入手した。 動物は、温度（°C）および光の制御された条件下で収容した。 実験は、ブラジル動物実験委員会（COBEA）のガイドラインおよび国際法および政策に従ったUFF Institutional Committee for Ethics in Animal Experiment（プロトコル番号297）によって承認された。

3. メソッド

3.1. 間接溶血の阻害

L.mutaおよびB.jararacaの毒によって引き起こされる溶血の程度は、ヒト赤血球および鶏の卵黄エマルジョンを基質として用いた間接溶血 L.mutaおよびBの量。 100％溶血を生じたジャララカ毒（μ g/mL）は、最小間接溶血用量（MIHD）として示された。 トリアゾール誘導体を一つのMIHDで室温で30分間インキュベートすることにより阻害実験を行い、溶血活性を評価した。 対照実験は、ＤＭＳＯまたは生理食塩水で毒液をインキュベートすることによって行った。

3.2. 抗凝固活性＜８ ６ １ ９＞＜１ ４ ４ ９＞ｌ．ｍｕｔａおよびＢ．ｊａｒａｒａｃａ毒の凝固活性を、ｄｉｇｉｔａｌ Ａｍｅｌｕｎｇ ｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒ、ｍｏｄｅｌ ＫＣ４Ａ（Ｌａｂｃｏｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて決定した。 Lの異なる濃度。 ムタ（10μ g/mL）およびB.jararaca（40μ g/mL）毒は、ウシフィブリノゲン溶液（2mg/mL）またはヒト血漿と混合され、60秒でフィブリノゲンまたは血漿のいずれかを凝固させた毒の量は、最小凝固剤用量（MCD）として示された。 それらの阻害効果を評価するために、トリアゾール誘導体は、毒の一つのMCDと室温で30分間インキュベートし、その後、混合物をフィブリノーゲンまたは血漿 対照実験は、トリアゾールの代わりに、毒液でインキュベートしたＤＭＳＯまたは生理食塩水を添加することによって並行して行った。

3.3. 抗タンパク質分解活性

L.mutaとB.jararaca毒のタンパク質分解活性は、基質としてアゾカセインを用いて決定した（0.2％w/v、20mMトリス-HCl、8mM Cacl2、pH8.8）、マイナー 有効濃度(EC)は、約0.2の420nmで変動を生じることができる毒の量(μ g/mL)として定義された。 トリアゾール誘導体は、室温で30分間毒の一つのECとインキュベートし、その後、タンパク質分解を測定しました。 対照実験は、ＤＭＳＯまたは生理食塩水で毒液をインキュベートすることによって行った。

3.4. 抗出血活性

L.mutaおよびB.jararaca毒によって産生された出血性病変を、Kondo et al.によって記載された手順を用いて定量した。 、修正付き。 手短に言えば、試料をマウスの腹部皮膚に皮内（i.d.）に注入した。 二時間後、動物は断頭によって安楽死させ、腹部皮膚を除去し、引き伸ばし、出血性スポットを局在化させるために、内部側面の視覚的変化を検査した。 出血は、10mmの出血性ハローを生成することができる毒の量（mg/kg）として定義される最小出血性用量（MHD）として定量化された。 トリアゾール誘導体の阻害効果は、L.mutaまたはB.jararaca毒の二つのMHDと化合物を室温で30分間インキュベートした後、混合物をマウスに注入し、出血を測定した。 出血活性は，トリアゾール誘導体の非存在下および存在下で毒によって誘発される出血性ハローの平均直径（ミリメートル単位）として表された。 陰性対照実験は、ＤＭＳＯまたは生理食塩水を注入することによって行った。

3.5. 抗浮腫活性

L.mutaおよびB.jararaca毒の浮腫誘導活性をYamakawa et al. 、修正付き。 ５匹のマウスの群を、右足パッドに５ ０μ ｌの毒液を皮下注射したが、一方、左の食物パッドには５ ０μ ｌの生理食塩水を投与した。 注射の１時間後、浮腫を評価し、左足パッドと比較した右足パッドの重量の増加の割合として表した。 トリアゾール誘導体の阻害効果は、l.mutaまたはB.jararaca毒と化合物を室温で30分間インキュベートし、混合物をマウス（右足パッド）に注入し、浮腫を測定した。

3.6. 統計分析

結果は、示された数の動物または実施された実験で得られた平均±SEMとして表される。 実験群間の差の統計的有意性をスチューデント検定を用いて評価した。 ≤0.05の値は重要であると考えられました。

4. 結果と議論

ヘビの咬傷は重度の障害を引き起こし、何千人もの人々を殺す可能性があるため、効果的で、安全で、安価で、よりアクセスしやすい抗毒素の開発には注意が必要である。 ますます多くの研究が、天然または合成の様々な供給源からのヘビ毒の阻害剤の探索に焦点を当ててきた。 Suraminおよびベンゾイルフェニル安息香酸塩は異なった家族からのヘビの毒のmyotoxicity、凝固およびホスホリパーゼA2およびヒアルロニダーゼの活動を禁 ラクトン類似体を合成し、筋毒性を阻害し、b.jararacussuから単離されたホスホリパーゼA2によって誘導される浮腫誘導および酵素活性のいずれかを阻害した。 一方、海洋生物活性原理は、その薬理作用が広く普及しているために注目されている。

この研究では、1-アリールスルホニルアミノ-5-メチル-1H-トリアゾール-4-カルボン酸エチルエステルが、B.jararacaおよびLによって引き起こされるいくつかのin vitro（溶血、凝固、タンパク質分解）およびin vivo（出血、浮腫誘導）活性を中和する能力を評価した。 以前の結果から、これらの六つの誘導体は、L.muta毒によって誘導される溶血を阻害するが、異なる効力を有することが示されているので、muta毒。 このため、タンパク質分解、凝固、溶血、出血、浮腫など、ヘビ咬傷に関連する他の重要な生物学的活性に対するそのような誘導体の作用を調べることは価 これらの化合物は、B.jararaca（50μ g/mL）およびL.muta（15μ g/mL）毒によって引き起こされる溶血を阻害することが示された（図2（a））。 誘導体の阻害率は、両方の毒に対して50％を超えていた。 しかし、阻害プロファイルのわずかな違いは、溶血の50％と90％の阻害は、それぞれ、B.jararacaとL.muta毒のために達成された誘導体6のために観察されました。 誘導体もＤＭＳＯも赤血球を溶血させなかったし，ｄｍｓｏも毒による溶血の程度を妨げなかった。

(a)

(b))

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フィギュア2

溶血およびタンパク質分解に対する誘導体の効果。 誘導体1-6(45μ m)B.jararaca(暗いカラム)またはL.muta(破線のカラム)と室温で30分間インキュベートし、溶血(a)とタンパク質分解(b)活性を行った。 データは、個々の実験の平均±ＳＥＭ（）として表される。

これらのsnakebitesによるEnvenomationは細胞外マトリックスの蛋白質の部品を消化するか、または血液凝固の要因を消費する亜鉛依存したmetalloproteaseかセリンプロテアーゼの高 B.jararacaおよびL. ムタ毒は、それぞれ２ ０μ ｇ／ｍｌおよび６μ ｇ／ｍｌのＥＣで濃度依存的にアゾカゼインを加水分解した（データは示されていない）。 この誘導体は、B.jararacaまたはL.mutaによって誘導されるタンパク質分解を阻害した（図2（b））。 誘導体1、2、3、および6は、両方の毒によって誘導されるタンパク質分解を80％まで阻害し、誘導体5は50％以下のこのような活性を阻害した。 誘導体4では、それぞれB.jararacaまたはL.muta毒によって誘導されるタンパク質分解を97％および25％阻害した（図2（b））誘導体の阻害プロファイルに顕著な差が観察された。

図3に見られるように、誘導体1、2、4、5および6は、誘導体3ではなく、濃度依存的に（23-94μ m）、B.jararaca（40μ g/mL）またはL.muta（10μ g/mL）の毒によって誘導されるフィブリ 誘導体はＢ．ｊａｒａｒａｃａよりもｌ．ｍｕｔａ誘導凝固をより効率的に阻害すると考えられた。 最高濃度（94μ m）では、誘導体1、2、3、5および6はL.muta凝固を防止し（図3（b））、誘導体2および6はB.jararacaを一度防止した（図3（b））。 200μ mまでの濃度では、すべての1,2,3-トリアゾール誘導体は効果的に両方の毒によって引き起こされるフィブリノーゲン凝固を防止したが、10μ m以下の濃度では、これらの化合物のどれも凝固を防止しなかった。 しかし、誘導体（10μ m）をすべて一緒に入れ、B.jararacaまたはL.muta毒のいずれかとインキュベートしたとき、凝固時間は二倍遅れた。 混合物から誘導体2または6を除去した場合、凝固時の阻害効果は観察されなかったことが注目された。 さらに，これらの誘導体は，血しょうを用いたときに毒によって誘発される凝固を防止した。 DMSO（1％v/v、最終濃度）も生理食塩水も凝固プロセスを妨げなかった。

(a)
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(b))

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フィギュア3

フィブリノーゲン凝固に対する誘導体の効果。 二十三μ m誘導体（灰色のカラム）、46μ m（白色のカラム）、または94μ m（黒色のカラム）は、40μ g/mL B.jararaca（a）または10μ g/mL L.muta（b）と室温で30分間インキュベートした。 次いで、混合物をフィブリノーゲン（２ｍｇ／ｍｌ）に添加し、凝固時間を記録した。 毒物を、生理食塩水（Ｃ１）；１％ｖ／ｖ ＤＭＳＯ（Ｃ２）；誘導体１（列１）；誘導体２（列２）；誘導体３（列３）；誘導体４（列４）；誘導体５（列５）；および誘導体６（列６）とインキュベートした。 #フィブリノゲンが観察の600秒まで凝固しなかったことを意味します。 データは、個々の実験の平均±ＳＥＭ（）として表される。

B.jararaca（12mg/Kg）またはL.muta（20mg/Kg）毒の皮内注射は、マウスで20mmの出血ハローを生産した。 このようなハローは、毒の二つのMHDを表しています。 各毒物を誘導体（９ ０μ Ｍ）と混合し、次いでマウスに注射したときに、出血からの完全な防御が見られた（データは示されていない）。 対照的に，抗弛緩血清はｌ．mutａ毒によって誘発される出血を阻害しないことを示した。 ＤＭＳＯ，誘導体または生理食塩水の注入は出血を生じなかった。 浮腫誘導は、ヘビの咬傷に続くもう一つの重要な効果です。 図4は、5mg/KgのB.jararaca（図4（a））または8mg/KgのLによって誘発される浮腫を示す。 ムタ(図4(b))は誘導体(90μ m)によって有意に減少した。 トリアゾール誘導体1、2、および4は、B.jararacaによって誘導される浮腫を80％以上阻害したのに対し、誘導体3、5、および6は約70％阻害した（図4（a））。 見られるように、すべての誘導体は、より少ないL.muta誘導浮腫形成活性を阻害した（図4（b））。

(a)
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(b))

((a)
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(b)
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フィギュア4

浮腫誘導活性に対する誘導体の効果。 誘導体（９ ０μ Ｍ）を５ｍｇ／ＫｇのＢ．ｊａｒａｒａｃａ（ａ）または８ｍｇ／ＫｇのＬ．ｍｕｔａ（Ｂ）と室温で３ ０分間インキュベートし、次いで浮腫誘導活性を行った。 列は、導関数1プラス毒（1）、導関数2プラス毒（2）、導関数3プラス毒（3）、導関数4プラス毒（4）、導関数5プラス毒（5）および導関数6プラス毒（6）である。 データは、個々の実験の平均±ＳＥＭ（）として表される。

結論として、1-アリールスルホニルアミノ-5-メチル-1H-トリアゾール-4-カルボン酸エチルエステル誘導体は、B.jararacaとL.mutaヘビ咬傷のために使用される現在の処 これらの誘導体の阻害効力は、おそらく相乗的に作用して、それらがすべて一緒に置かれたときに変化し得るか、または増強され得る。 したがって、B.jararacaおよびL.muta毒によって引き起こされる生物学的効果の完全な中和に到達するためには、それらのより低い濃度が必要であろう。 さらに，誘導体の構造-活性関係の以前の解析は既に行われている。 この誘導体は、化学分子がヒトにおいて経口活性薬物である可能性があることを示す”Lipinski’s rule of five”の分析に提出され、(1)分子量が500Da未満、(2)水素結合ドナー（OHまたはNH基）の数が5以下、(3)水素結合アクセプターの数が10未満、最後に(4)計算された5未満であることが示された。 結果は、すべての誘導体がこの規則（分子量=296.31–341.30;2.6–3.4;nHBA=8-11およびnHBD=1-3）を満たしていることを示し、良好な理論的生物学的disponibilityを示した。

謝辞

この研究は、国際科学財団（IFS Grant F/4571-1）および以下のブラジルの資金提供機関によって支援されました: コンセリョ-ナシオナル-デ-デセンヴォルヴィメント-シエンティフィコ-エ-テクノロヒコ（CNPq）、フンダサン-デ-アンパロ-デ-ペスキサ-ド-エスタド-ド-リオ-デ-ジャネイロ-カルロス-チャガス-フィーリョ（Faperj）、コーディナサン-デ-アペルフェイアメント-デ-ペソアル-デ-ニヴェル-スペリオル（岬）、およびUniversidade Federal Fluminense/pró-recitoria de Pesquisa e Pós-graduação e Inovação（Uff/proppi）。