Antivenom Effekter av 1,2,3-Triazoler mot Bothrops jararaca Og Lachesis muta Snakes

Abstract

Slangegift er komplekse blandinger av proteiner av både enzymer og ikke-enzymer, som er ansvarlig for å produsere flere biologiske effekter. Human envenomation av slangebitt spesielt de av viperid familien induserer et komplekst patofysiologisk bilde preget av spektakulære endringer i hemostase og ofte blødning er også sett. Det nåværende arbeidet rapporterer evnen til seks av en serie 1,2,3-triazolderivater for å hemme noen farmakologiske effekter forårsaket Av giftene Til Bothrops jararaca og Lachesis muta. In vitro-analyser viste at disse forbindelsene ble svekket på en konsentrasjonsavhengig måte, fibrinogen eller plasmaklotting, hemolyse og proteolyse produsert av begge venomer. Videre hemmet disse forbindelsene biologiske effekter in vivo også. Mus behandlet med disse forbindelsene var fullt beskyttet mot hemorragiske lesjoner forårsaket av slike giftstoffer. Men bare B. jararaca ødeminduserende aktivitet ble nøytralisert av triazolene. Så den hemmende effekten av triazolderivater mot noen in vitro og in vivo biologiske analyser av slangegift peker på lovende aspekter som kan indikere dem som molekylære modeller for å forbedre produksjonen av effektiv antivenom eller for å utfylle antivenom nøytralisering, spesielt de lokale patologiske effektene, som delvis er nøytralisert av antivenomer.

1. Innledning

Slangegift er komplekse blandinger av proteiner, inkludert enzymer (metalloproteinaser, serinproteinaser, fosfolipaser A2 og L-aminosyreoksidase) og proteiner uten enzymatisk aktivitet, som disintegriner, c-type lektiner, cysteinrike sekretoriske proteiner (SKARPE) toksiner, natriuretiske peptider og myotoksiner. De giftige pit vipers Bothrops jararaca og Lachesis muta er ansvarlige for ulykker som involverer mennesker i flere regioner I Sør-Amerika. Mens b. jararaca er funnet i det sørlige Brasil, Paraguay, og nordlige Argentina, L. muta er utbredt i ekvatorialskogen øst For Andesfjellene, som strekker seg fra Østlige Ecuador, Colombia, Peru, Nordlige Bolivia og østlige Og nordlige Venezuela, Til Guyana, fransk Guyana, Surinam og nordlige Brasil. Innenfor deres rekkevidde, de er ofte rikelig og er viktig årsak til slangebitt . Envenoming av disse slangene er hovedsakelig preget av systemisk (generalisert blødning, koagulopati, nyresvikt og sjokk) og lokale effekter (blødning, ødem og nekrose) . Som rapportert andre steder utgjør slangebitt et folkehelseproblem i Latin-Amerika og i andre tropiske og subtropiske land, der de anses som et forsømt helseproblem, Ifølge Verdens Helseorganisasjon (WHO) . I Sør-Amerika induserer b. jararaca en høyere forekomst av biter (95%) enn l. muta (ca 2%); Imidlertid Fører l. muta biter vanligvis til mer alvorlige envenoming symptomer og dødeligheten er tre ganger høyere Enn b. jararaca . I dag er parenteral administrering av dyreavledet antivenom den eneste spesifikke behandlingen for envenoming av slangebitt. I Brasil, intravenøs administrasjon Av Enten Bothrops polyvalent antivenom brukes til å behandle envenoming tilfeller forårsaket Av Bothrops biter eller polyvalent bothropic-lakhetic serum for l. muta Og Bothrops (B. Atrox) slangebitt I Amazonas regioner. Som nevnt ovenfor er moderate til alvorlige envenomings påført Av Bothrops og Lachesis slanger preget av en kompleks serie lokale og systemiske endringer som blødning, myonekrose, koagulopati, kardiovaskulær sjokk, nyresvikt og til slutt død . Som rapportert av andre forfattere, til tross for å være trygge, kan høye doser av motgift noen ganger brukt i Brasil for å behandle pasienter med påvist Eller mistenkt Bothrops/Lachesis envenoming bidra til tidlig anafylaktisk og sen (serumsykdom) type reaksjoner . Dermed gir produksjonen av motgift av tilstrekkelig kvalitet en betydelig utfordring. Videre har prisene på motgift økt, og noen land har stoppet produksjonen . Noen antiviromer nøytraliserer effektivt de systemiske toksiske effektene av giftet; de lokale effektene er imidlertid ikke blokkert, og denne situasjonen kan føre til amputasjon eller funksjonshemning .

på grunn av slike problemer har alternative behandlinger blitt søkt, og noen av dem har involvert søket etter nye molekyler som kan nøytralisere systemiske og lokale effekter av giftstoffer. Ekstrakter fra planter og andre naturlige kilder (som de fra marine organismer) har blitt testet for deres evne til å nøytralisere en rekke biologiske og toksiske effekter av slangegift. Ulike farmakologisk aktive molekyler har blitt identifisert , og mange effekter er allerede oppført for dem, inkludert deres antivenom evne . I dag blir mange nye bioprospekteringsmetoder undersøkt. I forbindelse med dette skal det imidlertid bemerkes at de biologiske effektene av molekyler avledet fra organisk syntese ennå ikke er godt utforsket. Litteratur har beskrevet 1,2,3-triazolforbindelse som en viktig klasse av fem-medlem nitrogen heterocyklisk system som utviser forskjellige farmakologiske profiler , som antiplatelet aktivitet , anticlotting , antiviral , trypanocidal , antimikrobiell og/eller deres bruk i behandling av schizofreni og leishmaniasis . To generelle metoder er tilgjengelige for bygging av 1,2,3-triazolringer: Huisgen 1,3-dipolar sykloaddisjonsreaksjoner, spesielt kobber (I)-katalysert sykloaddisjon , og intramolekylær 1,5-elektrosyklisering av β-substituerte-α-diazokarbonylforbindelser . Våre tidligere studier har indikert at seks nye syntetiske 1,2,3-triazolforbindelser (1-arylsulfonylamino-5-metyl-1h-triazol-4-karboksylsyreetylestere) hemmet hemolysen indusert Av l. muta gift . Faktisk viste slike derivater et bredt spekter av farmakologiske aktiviteter .

målet med dette arbeidet var å evaluere evnen til disse seks 1,2,3-triazolderivatene basert på –1-(p-klorfenyl)-1h–triazol-4-karbohydrazid mot In vivo og in vitro aktiviteter Av Bothrops jararaca og Lachesis muta venoms.

2. Materiale

2.1. Gift Og Materiale

Bothrops jararaca, Lachesis muta lyophilized venoms, og anti-Lachesis eller Anti-Bothropic antivenom ble gitt Fra Fundaçã Ezequiel Dias, Belo Horizonte, mg, brasil, og lagret ved -20 ° c til analyser. Dimetylsufoksid (DMSO), bovint fibrinogen og azokasein ble oppnådd Fra Sigma Chemical Co. Alle andre reagenser var av beste klasse tilgjengelig.

2.2. Syntetiske Derivater

de seks 1-arylsulfonylamino-5-metyl-1h-triazol-4-karboksylsyre etylestere derivater ble syntetisert i henhold til vår tidligere rapport og deres kjemiske strukturer er vist I Figur 1. Disse forbindelsene ble oppløst i dimetylsufoksid (DMSO) og lagret ved 4°C, inntil det var nødvendig.

Figur 1

Kjemiske strukturer av de seks 1,2,3-triazolderivatene n ‘ –1 – (p-klorfenyl) – 1h — triazol-4-karbohydrazid. De seks derivatene ble utformet som tall, som vist i parentesen etter hvert derivat.

2.3. Dyr

BALB / c-mus (18-20 g) ble hentet fra Nú De Animais De Laborató (NAL) Fra Det Føderale Fluminense-Universitetet. Dyrene ble plassert under kontrollerte forhold med temperatur (°C) og lys. Eksperimenter ble godkjent AV UFF Institutional Committee for Ethics In Animal Experimentation (protokoll nummer 297) som var i samsvar med retningslinjene Fra Den Brasilianske Komiteen For Dyreforsøk (COBEA) og internasjonale lover og retningslinjer.

3. Metoder

3.1. Hemming Av Indirekte Hemolyse

graden av hemolyse forårsaket Av giftene Til L. muta og b. jararaca ble bestemt ved den indirekte hemolytiske testen ved bruk av humane erytrocytter og hønseeggemulsjon som substrat . Mengden l. muta og B. jararaca gift (µ / mL) som ga 100% hemolyse ble betegnet som minimum indirekte hemolytisk dose (MIHD). Inhibitoriske eksperimenter ble utført ved å inkubere triazolderivater med EN MIHD i 30 minutter ved romtemperatur, og deretter ble hemolytisk aktivitet evaluert. Kontrollforsøk ble gjort ved å inkubere giftstoffer med DMSO eller saltoppløsning.

3.2. Anticlotting Aktivitet

koagulasjonsaktiviteten Til l. muta og b. jararaca-venomer ble bestemt ved hjelp av et digitalt Amelungkoagulometer, MODELL KC4A (Labcon, Tyskland). Ulike konsentrasjoner Av L. muta (10 µ/mL) og b. jararaca (40 µ/mL) gift ble blandet med bovin fibrinogenoppløsning (2 mg / mL) eller med humant plasma, og mengden gift som koagulerte enten fibrinogen eller plasma i løpet av 60 sekunder ble betegnet som minimum koagulantdose (MCD). For å evaluere deres hemmende effekt ble triazolderivatene inkubert i 30 minutter ved romtemperatur med EN MCD av giftstoffer, og deretter ble blandingen tilsatt til fibrinogen eller plasma og koaguleringstid registrert. Kontrollforsøk ble utført parallelt ved å tilsette DMSO eller saltvann inkubert med venomer, i stedet for triazolene.

3.3. Antiproteolytisk Aktivitet

Proteolytisk aktivitet Av l. muta og b. jararaca-venomer ble bestemt ved bruk av azokasein som substrat (0,2% w / v, i 20 mM Tris-HCl, 8 mM CaCl2, pH 8,8), med mindre modifikasjon . En effektiv konsentrasjon (EC) ble definert som mengden gift (µ/mL) som kunne produsere en variasjon ved en 420 nm på ca.0,2. Triazolderivater ble inkubert med en EC gift i 30 minutter ved romtemperatur og deretter ble proteolyse målt. Kontrollforsøk ble gjort ved å inkubere giftstoffer med DMSO eller saltoppløsning.

3.4. Antihemoragisk Aktivitet

Hemorragiske lesjoner produsert Av l. muta og b. jararaca-venomer ble kvantifisert ved hjelp av en prosedyre beskrevet Av Kondo et al. , med modifikasjoner. Kort sagt ble prøver injisert intradermalt (i.d.) i bukhuden hos mus. To timer senere ble dyrene euthanized av halshugging, abdominal hud fjernet, strukket og inspisert for visuelle endringer i det indre aspektet for å lokalisere hemorragiske flekker. Blødning ble kvantifisert som MINIMUM hemorragisk dose (MHD), definert som mengden gift (mg/kg) som kunne produsere en hemorragisk halo på 10 mm . Den hemmende effekten av triazolderivater ble undersøkt ved å inkubere forbindelser med To MHD Av L. muta eller b. jararaca gift i 30 minutter ved romtemperatur og deretter ble blandingen injisert i mus og blødning ble målt. Hemoragisk aktivitet ble uttrykt som gjennomsnittlig diameter (i millimeter) av hemoragisk halo indusert av venomer i fravær og nærvær av triazolderivatene. Negative kontrollforsøk ble utført ved å injisere DMSO eller saltoppløsning.

3.5. Antiedematogen Aktivitet

Ødeminduserende aktivitet Av l. muta og b. jararaca-venomer ble bestemt i henhold Til Yamakawa et al. , med modifikasjoner. Grupper på fem mus ble injisert subkutant (s. c) i høyre fotpute med 50 µ gift, mens venstre matpute fikk 50 µ saltvann. En time etter injeksjon ble ødem evaluert og uttrykt som prosentandelen av økning i vekten av høyre fotpute sammenlignet med den venstre. Den hemmende effekten av triazolderivater ble undersøkt ved å inkubere forbindelser Med L. muta eller b. jararaca gift i 30 minutter ved romtemperatur og deretter ble blandingen injisert i mus (høyre fotpute) og ødem ble målt.

3.6. Statistisk Analyse

Resultatene er uttrykt som betyr ± SEM oppnådd med angitt antall dyr eller eksperimenter utført. Den statistiske signifikansen av forskjeller mellom eksperimentelle grupper ble evaluert ved Hjelp Av Studentens test. En verdi på ≤ 0.05 ble ansett som signifikant.

4. Resultater Og Diskusjon

utviklingen av effektive, trygge, billigere og mer tilgjengelige motgift fortjener oppmerksomhet, siden slangebitt kan forårsake alvorlige funksjonshemninger og drepe tusenvis av mennesker også. Et økende antall studier har vært fokusert på søket etter inhibitorer av slangegifter fra en rekke kilder, enten de er naturlige eller syntetiske . Suramin og benzoylfenylbenzoat er syntetiske molekyler som er i stand til å hemme myotoksisitet, koagulering og fosfolipase A2 og hyaluronidase-aktiviteter av slangegifter fra forskjellige familier. Laktonanaloger ble syntetisert og hemmet myotoksisitet, og ødeminduserende og enzymatiske aktiviteter indusert av en fosfolipase a2 isolert fra b. jararacussu heller . På den annen side har marine bioaktive prinsipper også tiltrukket seg oppmerksomhet på grunn av deres brede spredte farmakologiske handlinger .

i dette arbeidet ble det evaluert evnen til seks 1-arylsulfonylamino-5-metyl-1h-triazol-4-karboksylsyreetylestere for å nøytralisere noen in vitro (hemolyse ,koagulering og proteolyse) og in vivo (blødning og ødeminduserende) aktiviteter forårsaket Av b. jararaca og L. muta venoms, siden tidligere resultater indikerte at disse seks derivater hemmet hemolyse indusert Av l. muta gift, men med forskjellige potenser . Av denne grunn ble det antatt at det ville være verdt å undersøke handlingene av slike derivater på andre viktige biologiske aktiviteter knyttet til slangebitt, som proteolyse, koagulering, hemolyse, blødning og ødem. Det ble vist at disse forbindelsene hemmet hemolysen forårsaket Av b. jararaca (50 µ/mL) og l. muta (15 µ/mL) gift (Figur 2(a)). Den hemmende prosentandelen av derivatene var over 50% mot begge giftstoffene. Det ble imidlertid observert en liten forskjell på den hemmende profilen for derivat 6, hvor en 50% og 90% hemming på hemolyse ble oppnådd for Henholdsvis b. jararaca og l. muta venom. Verken derivater eller DMSO førte erytrocytter til hemolyse, OG DMSO interfererte heller ikke med graden av hemolyse forårsaket av giftstoffer.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 2

effekt av derivater på hemolyse og proteolyse. Derivater 1-6 (45 µ) ble inkubert Med B. jararaca (mørke kolonner) eller Med l. muta (stiplede kolonner) i 30 minutter ved romtemperatur, og deretter ble hemolytiske (a) og proteolytiske (b) aktiviteter utført. Data er uttrykt som gjennomsnittlig ± SEM av individuelle eksperimenter ().

Envenomering av disse slangebittene gir alvorlig blødning på grunn av det høye innholdet av sinkavhengig metallprotease eller serinprotease som fordøyer proteinkomponenter i den ekstracellulære matriksen eller forbruker blodproppsfaktorer . B. jararaca Og L. muta venom hydrolyserte azokasein på en konsentrasjonsavhengig måte med HENHOLDSVIS 20 µ/mL og 6 µ/mL (data er ikke vist). Derivatene hemmet proteolyse indusert Av b. jararaca eller L. muta (Figur 2 (b)). Derivatene 1, 2, 3 og 6 hemmet proteolyse indusert av begge venomer opp til 80% og derivatet 5 hemmet en slik aktivitet under 50%. En markert forskjell på inhibitorisk profil av derivater ble observert for derivat 4, hvor den hemmet 97% og 25% proteolysen indusert av Henholdsvis b. jararaca eller l. muta-gift (Figur 2 (b)).

som vist i Figur 3, derivater 1, 2, 4, 5 og 6, men ikke derivatet 3 hemmet på en konsentrasjonsavhengig måte (23-94 µ), koagulering av fibrinogen indusert Av giftene B. jararaca (40 µ / mL) Eller L. muta (10 µ/mL). Det virket som derivater hemmet Mer effektivt l. muta-inducing clotting enn B. jararaca. Ved høyeste konsentrasjon (94 µ) forhindret derivatene 1, 2, 3, 5 og 6 l. muta koagulering (Figur 3 (b)), mens derivatene 2 og 6 forhindret b. jararaca en gang (Figur 3(b)). Ved konsentrasjoner opp til 200 µ forhindret alle 1,2,3-triazolderivatene effektivt koagulering av fibrinogen forårsaket av begge venomer, men ved konsentrasjoner under 10 µ forhindret ingen av disse forbindelsene koagulering. Men når derivater (10 µ) ble satt sammen og inkubert med Enten b. jararaca eller L. muta gift, ble koagulasjonstiden to ganger forsinket. Det ble lagt merke til at hvis derivat 2 eller 6 ble fjernet fra blandingen, ble det ikke observert hemmende effekt ved koagulering. Videre forhindret derivatene også koagulering indusert av giftstoffer når plasma ble brukt. VERKEN DMSO (1% v/v, sluttkonsentrasjon) eller saltoppløsning interfererte med koagulasjonsprosesser.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 3

Effekt av derivater på fibrinogen koagulering. Tjuetre µ derivater (grå kolonner), 46 µ (hvite kolonner) eller 94 µ (svarte kolonner) ble inkubert med 40 µ/mL b. jararaca (a) eller med 10 µ/mL L. muta (b) i 30 minutter ved romtemperatur. Deretter ble blandingen tilsatt til fibrinogen (2 mg / mL) og koaguleringstid ble registrert. Venomer ble inkubert med saltvann (C1); 1% V/V DMSO (C2); derivat 1 (kolonne 1); derivat 2 (kolonne 2); derivat 3 (kolonne 3); derivat 4 (kolonne 4); derivat 5 (kolonne 5); og med derivat 6 (kolonne 6). # betyr at fibrinogen ikke koagulerte til 600 sekunder med observasjon. Data er uttrykt som gjennomsnittlig ± SEM av individuelle eksperimenter ().

Intradermal injeksjon av b. jararaca (12 mg/Kg) eller l. muta (20 mg / Kg) gift ga en blødningshaloie på 20 mm i mus. En slik halo representerer to MHD av venomer. Når hver gift ble blandet med derivater (90 µ) og deretter injisert i mus, ble det sett en fullstendig beskyttelse mot blødning (data ikke vist). I kontrast viste tidligere resultater at antilaketisk serum ikke hemmet blødning indusert Av l. muta gift . Injeksjon AV DMSO, derivater eller saltoppløsning ga ikke blødning. Ødem-induserende er en annen viktig effekt som følger slangebitt . Figur 4 viser at ødem indusert av 5 mg/Kg b. jararaca (Figur 4(a)) eller 8 mg / Kg L. muta(Figur 4 (b)) ble signifikant redusert av derivatene (90 µ). Triazolderivatene 1, 2 og 4 hemmet over 80% ødemet indusert Av b. jararaca, mens derivater 3, 5 og 6 hemmet rundt 70% (Figur 4 (a)). Som sett hemmet alle derivater mindre l. muta-indusert edematogen aktivitet (Figur 4 (b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 4

Effekt av derivater på ødemfremkallende aktivitet. Derivatene (90 µ) ble inkubert med 5 mg / Kg b. jararaca (a) eller Med 8 mg/Kg l. muta (b) i 30 minutter ved romtemperatur, og deretter ble ødeminduserende aktivitet utført. Kolonner er derivat 1 pluss gift (1); derivat 2 pluss gift (2); derivat 3 pluss gift (3); derivat 4 pluss gift (4); derivat 5 pluss gift (5) og derivat 6 pluss gift (6). Data er uttrykt som gjennomsnittlig ± SEM av individuelle eksperimenter ().

til slutt kan 1-arylsulfonylamino-5-metyl-1h-triazol-4-karboksylsyreetylestere-derivater være nyttige som prototyper for å designe nye molekyler for å forbedre den nåværende behandlingen som brukes Til b. jararaca og L. muta slangebitt. Den hemmende potens av disse derivatene kan variere eller kan forbedres når de ble satt sammen, sannsynligvis opptrer synergistisk. Dermed vil en lavere konsentrasjon av dem være nødvendig for å nå en fullstendig nøytralisering av de biologiske effektene forårsaket Av b. jararaca og l. muta venoms. Videre har tidligere analyse av struktur-aktivitetsforhold av derivater allerede utført . Derivatene ble sendt til analysen av «Lipinski’ s rule of five » som indikerer at et kjemisk molekyl kan være et oralt aktivt legemiddel hos mennesker, og en slik regel sier at et molekyl som bryter to av følgende regler, sannsynligvis vil bli dårlig absorbert: (1) molekylvekt mindre enn 500 Da, (2) antall hydrogenbindingsdonorer (OH eller NH-grupper) lik eller mindre enn 5, (3) antall hydrogenbindingsacceptorer mindre enn 10, og til slutt (4) beregnet mindre enn 5 . Resultatene viste at alle derivater oppfylte denne regelen (molekylvekt = 296,31-341,30; 2,6–3,4; nHBA = 8-11 og nHBD = 1-3) peker på god teoretisk biodisponibility .

Anerkjennelser

dette arbeidet ble støttet Av International Foundation For Science (Ifs Grant F / 4571-1) og Av Følgende Brasilianske finansieringsorganer: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico( CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado Rio de Janeiro Carlos Chagas Filho (Faperj), Coordinação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (kapper), og Universidade Federal Delen av/pró-recitoria de Pesquisa e Pós-graduação e Inovação (Uff/PROPPi).