krystallstrukturen til en tetrahydrofolatbundet dihydrofolatreduktase avslører opprinnelsen til langsom produktfrigivelse

Isolering ved krystallisering av det endogene (6s)-5,6,7,8-tetrahydrofolatbundet E. coli DHFR-kompleks

strukturen til edhfr:fh4 binært kompleks ble bestemt ved molekylær erstatning ved bruk av edhfr:folat:nadp+ Lukket Ternært Kompleks (Pdb id: 7dfr)50. Som vist I Fig. 2, den klare elektrontettheten bekrefter den ko-rensede endogene liganden som FH4 basert på den tetraedrale geometrien av sp3 C6 i samsvar med en 6s stereoisomer. Dette står i kontrast til den trigonale plan geometri av sp2 C6 i et fh2 binært kompleks oppnådd fra lignende krystalliseringsforhold.

Sammenligning av ligandstrukturer av eDHFR: FH4 (grønn, toppfigur) og eDHFR:fh2 (oransje, bunnfigur) komplekser. De Fo-Fc utelate elektrontetthetskart formet rundt ligander er vist på 3.0 σ nivå. Synspunktene til høyre roteres 90° mot klokken om den vertikale aksen fra perspektivene vist til venstre. FH4 og FH2 er vist som pinner. C6-karbonatomet er farget i magenta, og dets forskjellige hybridiseringstilstander I FH4 og FH2 er indikert med magenta pekepiler. Alle andre atomer er farget som følger: oksygen i rødt, nitrogen i blått, karbon i grønt og oransje for HENHOLDSVIS fh4 og FH2. Bare ikke-hydrogenatomer er vist for enkel visning

I et forsøk på å forstå hvorfor VI får FH4-komplekset, mens andre har mislyktes, identifiserte vi at opprinnelsen til de to forskjellige ligandkompleksene (FH4 vs FH2) er tidspunktet for krystallhøsting, og dermed varigheten av krystallvekst. En tid kurs studie vist I Fig. 3 som følger endringene av elektrondensiteter av bundet ligand på forskjellige dager med krystallvekst viste at FH4 TIL FH2 forfall (reflektert i sp3 til sp2 overgang Ved C6 posisjon) skjedde omtrent 2-3 dager etter krystallisering satt opp.

Stereo utsikt over tiden løpet Av Fo-Fc utelate elektrontetthetskart endringer som tilsvarer konvertering AV FH4 TIL FH2. De Fo-Fc utelate elektrontetthetskart formet rundt ligander er vist på 3.0 σ nivå. EDHFR:FH4 binære komplekse krystaller ble dyrket i mørket ved romtemperatur. På hvert tidspunkt ble en enkelt krystall fra en uavhengig krystalldråpe høstet ved flashfrysing for røntgendiffraksjon. Ligandstrukturer AV FH4 OG FH2 av fullstendig raffinerte binære komplekse strukturer på henholdsvis 2 og 14 dager, vises i hver figur som referanser for å sammenligne med endringen av elektrondensiteter. Utelatelseskartene for krystallene høstet på 3 og 6 dager ble generert etter innledende strukturell forfining uten å innføre ligander eller løsningsmidler. Superposisjon av proteinstrukturer ble utført ved Bruk Av PyMOL69

Dette er første gang vi vet at et autentisk FH4-bundet ENKELTDOMENE DHFR-kompleks er blitt isolert. Vi har validert protokollen for å reprodusere krystalliseringen av eDHFR: FH4-komplekset og bekreftet tidsforløpet AV FH4 TIL FH2-forfall med minst to uavhengige replikater ved hvert tidspunkt for krystallhøsting (Supplerende Fig. 1). Mellom elektron tettheter langs tiden løpet av ligand forfall tydelig vise sp3 til sp2 overgang På c6 posisjon og samtidig rotasjon av benzoyl ring av bundet ligand (Fig . 3). Dette kan ligne overgangen tilstand ligand konformasjon i fremover katalytisk retning. Det observerte FH4 TIL FH2 forfall under krystallvekst reflekterer sannsynligvis ikke omvendt katalyse VED DHFR som involverer konvertering AV FH4 TIL FH2. Det er også sannsynligvis ikke indusert av lys, med tanke på at krystallisasjonsdråpene ble inkubert ved romtemperatur i mørket under krystallvekst, og tiden FOR FH4 TIL FH2 forfall er i rekkefølge av dager. Vi har også testet ko-krystallisering med reduksjonsmidlene dithiothreitol(DTT) eller Tris (2-carboxyethyl)fosfin (TCEP) ved 2-3 mM konsentrasjon, samt innføring AV DTT eller TCEP i opptil 20 min krystall soaking før høsting på 2 dager, 3 dager, 14 dager opp til 7,5 måneder. Igjen påvirket disse prosedyrene ikke reproduserbarheten av ligandelektrontetthetsendringer kvalitativt langs forfallstidsforløpet til eDHFR: FH4-komplekset i krystallinsk form identifisert i denne studien(Supplerende Fig. 1). Således er det sannsynlig at den nåværende krystalliseringsprotokollen fortrinnsvis krystalliserer det endogene FH4-komplekset som er renset i eDHFR-proteinprøvene, og dets forfall i krystallet er irreversibelt under de forhold vi testet, sannsynligvis på grunn av oksidasjon ved et endelig nivå av oksygen. Selv om den raske frem katalytiske reaksjonen for å produsere FH4 FRA FH2 er termodynamisk favorisert i nærvær AV overskytende MENGDE NADPH som in vivo, kan det langsomme forfallet AV FH4-komplekset tilbake til ET FH2-kompleks forekomme uten fortsatt tilførsel AV NADPH som vi observerte her under in vitro krystallisasjonstilstanden. Dermed er mysteriet om hvorfor DET lenge forfulgte FH4-komplekset var vanskelig å oppnå, åpenbart å være dets iboende ustabilitet. Det er svært sannsynlig at nøkkelen til vår suksess med å skaffe den kjemisk labile fh4-komplekse strukturen er rettidig høsting av brønndiffracting krystaller innen 2 dagers vekst under krystallisasjonstilstanden identifisert her. I tillegg viser EN undersøkelse AV DHFR-feltet at mange krystallografiske19,20,24,28,29,32,43,45,47,48,50,51,52 og NMR12,13,15,17,19,25,26 STUDIER AV DHFR anvendt dialyse for å fjerne endogene ligander før innføring av eksogene ligander av interesse. Vi identifiserte en krystallisasjonstilstand som isolerer det endogene FH4-bundne DHFR-komplekset uten dialyse av proteinprøven eller innføring av ytterligere substrater eller produkter. Vi postulerer at den nåværende krystalliseringsbetingelsen for eDHFR: FH4-komplekset favoriserer FH4-bundet form over andre former som eDHFR: FH2: NADP (H) ternært kompleks.

Strukturell karakterisering av eDHFR: FH4 complex

FH4 complex vedtar en okkludert konformasjon i eDHFR (se Figs. 4 og 5). Dette er i samsvar med tidligere funn som tyder på at alle grunntilstand fh4 binære og trefoldige komplekser av katalytisk syklus (posthydrid overføring og sp2 til sp3 konvertering Ved C6) forekommer i okkluderte konformasjoner. Dette skyldes sterisk sammenstøt av den vippede pterinringen AV FH4 med nikotinamidringen AV NADP (H), som ville oppstå i den lukkede konformasjonen Av Met20-sløyfen (Fig. 5)12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,35,36,37,38. Som angitt I Fig. 4, FH4 har van Der Waals kontakter og gunstige polare interaksjoner med aktive sted rester og farvann. Spesielt forankrer to bidentatsaltbroer Med Asp27 og Arg57 de to endene av fh4, henholdsvis aminopyrimidin (n3 og eksosyklisk-NH2) og α-karboksylat i nær identiske posisjoner som i substrat/analoge komplekser12, 20, 24,45.

den aktive nettstedstrukturen til eDHFR: FH4-komplekset vises i stereovisninger. En sidekjede (cyan) innen 4 Å AV FH4 (grønn) og Met20-sløyfen (gul) vises som pinner. Sekundære strukturer vises som tegneserier i grått, og farvann innen 3,5 Å AV FH4 som kuler. Polar interaksjoner MED FH4 er indikert med stiplede linjer. Fo-Fc elektrontetthetskartet som utelater FH4 vises på et 3,5 σ-nivå i rødt og 2fo-Fc utelatelseskartet på et 1,0 σ-nivå vises i blått for rester og vann. De tre konformatorer Av Ile14-Gly15 amide bindinger er angitt med en stiplet sirkel og røde piler. b en utvidet visning Av ile14-Gly15-koblingen

Superposisjon AV FH4-komplekset med fh2 og fh4 analoge komplekser. De nåværende FH4, FH2 og rapporterte eDHFR-komplekser og det rapporterte 5-formyl-FH4-komplekset sammen med deres okkluderte Met20-sløyfekonformasjoner, Phe31-rester og tilhørende ligander er farget i henholdsvis grønt, magenta og gult. Alle andre strukturer FRA PDB IDs: 1DYJ (ddFH4)45, 5CCC (ddFH4:NADP+)12, 1RF7 (FH2)24, 4PDJ (FH2:NADPH)20 og 4PSY (folat:NADP+)20 er farget grå. Den røde stiplede sirkelen indikerer foreslåtte π-π-interaksjoner Mellom Phe31 og ligand benzoyl-gruppene som vedtar to distinkte orienteringer avhengig av de bundne ligandene. FH4 og 5-formyl-FH4 tilhører en klynge i motsetning til ddFH4, FH2 og folat, mens Phe31 – sidekjedene holder seg i nesten samme posisjon i alle justerte strukturer. Met20-løkkene er kategorisert i tre generelle konformasjonelle tilstander, lukket, delvis lukket og okkludert. Bare de lukkede konformasjonene kan strukturelt imøtekomme nikotinamidgruppen AV NADP (H) – kofaktoren som kommer inn på det aktive stedet

det er to vannmolekyler som bygger bro Mellom met20-sløyfen og FH4 via et hydrogenbindingsnettverk som involverer Gly15 (C = O)-wat1-FH4(N5) og Glu17(NH)-wat2-FH4(N10) (Fig. 4). Disse interaksjonene er fraværende i tidligere rapporterte (6R)-5,10-dideazatetrahydrofolat (ddFH4) komplekser12,45 på Grunn Av n Til C-erstatning ved 5 og 10 stillinger i analogen. Dette kan forårsake den observerte forskjellen I Met20-konformasjonen i analogen sammenlignet MED fh4-komplekset (Fig. 5). DE eneste tilgjengelige strukturer I PDB som ligner Met20 loop konformasjon I FH4 komplekset er en 5-formyl-FH4 kompleks (Fig. 5, PDB ID: 1JOM) 51 og to eDHFR-nanobody allosteriske hemmende komplekser som er rettet mot ULIKE DHFR epitoper med nanomolar affinitet (Supplerende Fig. 2, PDB Id: 3k74 OG 4EIG) 28,29. 5-formyl-FH4-komplekset bevarer brovannet Mellom Glu17(NH) og FH4 (N10) som I FH4-komplekset, til tross for deres forskjellige romgrupper P61 og P212121 henholdsvis. 5-Formyl-FH4, også kjent som folinsyre eller leucovorin, ER ET FDA-godkjent» rescue » – stoff for å forhindre skadelige effekter av metotrexat under kjemoterapi53. Den γ-karboksylgruppen AV FH4 viser liten elektrontetthet (Fig. 4), noe som tyder på uorden eller mer frihet til obligasjonsrotasjon rundt Cß-Cy eller Cy-Cδ C-aksen enn i andre deler av ligandene.

i tillegg til vannnettverket fant vi den strukturelle opprinnelsen til de stabiliserende interaksjonene I FH4-komplekset og langsom produktutgivelse basert på strukturell sammenligning av nåværende fh4-og fh2-binære komplekser og tidligere rapporterte eDHFR-strukturer. For det første resulterer van Der Waals-kontakten med Glu17-sidekjeden i ytterligere skjerming AV FH4 fra løsemiddel (Fig. 4) som er fraværende i substrat eller produktanalog (6R)-5,10-dideazatetrahydrofolatkomplekser12,20,24, 45. For det andre antyder den klare elektrontettheten av tre alternative ryggradskonformasjoner av den konserverte Ile14-Gly15-amidforbindelsen et entropisk bidrag TIL stabiliteten TIL FH4-komplekset fra den lokale fleksibiliteten Ved Met20-sløyfeanker(Fig . 4). Spesielt viste tidligere mutagenesestudier Ile14 er avgjørende for å kontrollere fleksibiliteten Til Met20-sløyfen, mens i14v, I14A og i14g-varianter alle viste en langsommere hydridoverføringshastighet, høyere fleksibilitet Av Met20-sløyfen som observert i en åpen konformasjon i krystallstrukturer, økt temperaturavhengighet av primær kinetisk isotopeffekt og en høyere overgangsstatusaktiveringsenergi beregnet fra hybrid QM / MM-simulasjoner23, 40. For det tredje fører rotasjon av benzoylringen til elektrostatisk gunstige kant-til-ansikt π-π interaksjoner med den konserverte Phe31 I FH4-komplekset i motsetning til proton-nær-proton (kant-til-kant) repulsive interaksjoner I FH2 -, folat-og ddFH4-komplekser uavhengig AV NADP(H) – binding (Fig. 5, utvidet visning, Fig. 6)54,55. Den funksjonelle implikasjonen av denne strukturelle endringen støttes også av observasjonen av den samtidige rotasjonen av benzoylringen og sp3 til sp2-overgangen Ved C6-posisjonen til den bundne liganden i løpet AV FH4 TIL FH2-forfall i komplekset (Fig . 3). Phe31s rolle i å kontrollere produktfrigivelse er ytterligere bekreftet av tidligere mutagenesestudier56, som viste AT f31v og F31Y varianter av eDHFR viste en todelt økning av steady-state-hastighetskonstanten kcat og en estimert 20 til 50 ganger økning i frekvensen av produktfrigivelse i tillegg til mutasjonenes effekt på å senke hydrid-overføringen.

Elektrostatiske interaksjoner mellom π-π Se refs 54,55 for detaljer

Med tanke på de dynamiske egenskapene til det spesielle E. coli DHFR-systemet, kan det stabile okkluderte eDHFR:FH4-komplekset (et lavfri energi-mellomprodukt på det dynamiske landskapet) som observeres her, med rimelighet ligge til grunn for den langsomme produktfrigjøringskinetikken (koff-frekvensen AV FH4-dissosiasjon, det hastighetsbegrensende trinnet i eDHFR-katalytisk syklus). IFØLGE tidligere NMR – avslappingsdispersjonsstudier følger hvert trinn I den katalytiske syklusen Av E. coli DHFR et «konformasjonsvalg» i stedet for» indusert fit » – mekanisme15. Følgelig avhenger den mikroskopiske hastigheten for hvert trinn langs reaksjonskoordinaten av den konformative samplingshastigheten til enzymet15(f. eks. Dette innebærer at jo mer stabil grunntilstanden, og jo mer forskjellig den er fra det eksiterte substratet, desto større er den frie energikostnaden som kreves for å prøve slike konformasjoner. For eDHFR vil dette nødvendigvis innebære omorganisering av det aktive stedet og den fleksible Met20-sløyfen. DET ble foreslått I NMR avslapping dispersjon studier av eDHFR15 at subpopulated opphisset tilstand for hydrid overføring kjemiske trinn vedtar en okkludert konformasjon (hvis grunntilstand Michaelis komplekset er i en lukket konformasjon). Imidlertid vedtar den subpopulerte eksiterte tilstanden for produktutgivelsestrinnet en lukket konformasjon (hvis grunntilstand FH4-kompleks er i en okkludert konformasjon). Langs reaksjonskoordinaten ligger det nåværende observerte eDHFR: FH4 binære komplekset mellom eDHFR: FH4: NADP+ og eDHFR: FH4:NADPH mellomkompleksene (Fig. 1). Begge adopterer okkluderte konformasjoner, hvor nikotinamiddelen av kofaktoren peker bort fra det aktive site15. For å prøve «lukket opphisset substate» under rate-begrensende produkt utgivelsen trinn 15, må aktiv området omorganisering fra okkludert grunntilstanden skje. Dette er representert ved det stabile katalytiske mellomproduktet eDHFR: FH4 fanget i denne studien. Produktdissosiasjonsraten koff AV FH4 ble økt ved kofaktorbinding med en to ganger økning for eDHFR: FH4: NADP + sammenlignet med eDHFR:FH4, og en åtte ganger økning for eDHFR: FH4: NADPH sammenlignet med eDHFR:FH4 målt ved både pH 6 og pH 9 ved konkurranseforskere35. Dette indikerer akselerert produktutgivelse og økt konformasjons samplingsfrekvens når en kofaktor er bundet. Selv om en autentisk eDHFR: FH4: NADPH ternær kompleks grunntilstandsstruktur aldri ble rapportert før, hypoteser vi at det kan være merkbar likhet med eDHFR: FH4 binærkompleks, da alle FH4-bundne mellomstater vedtar en okkludert konformasjon15. Vi forventer imidlertid at kofaktorbinding vil øke befolkningen i de spente substatene, foreslått tidligere basert PÅ NMR-avslapningsdispersjonsstudier, for å være i en lukket konformasjon15. I samsvar med dette observerte vi at I et ternært kompleks av eDHFR:FH2:NADP(H) – strukturen (også bestemt i vår studie under separate krystalliseringsforhold) Ble Met20-sløyfen uordnet. Dette antyder en generell mekanisme for kofaktor tilrettelagt ligand utveksling ved å øke konformasjons samplingsfrekvens når kofaktoren er bundet med sin nikotinamid del peker bort fra det aktive stedet.

i FH4–komplekset er avstanden MELLOM FH4 benzoyl-ringen (C1ʹ) og Phe31 (Cz) 4.93 Å, som er betydelig kortere med (~0.3-0.6 Å) enn de tilsvarende avstandene i gjeldende FH2 og tidligere rapporterte FH2-komplekser (PDB ID: 1RF7, 4pdj)20,24, som er henholdsvis 5.22, 5.55 og 5.32 Å. En lignende trend med avstandsforkortelse langs reaksjonskoordinaten til eDHFR ble vektlagt i to uavhengige beregningsstudier. EN QM / MM-studie beregnet at den tilsvarende avstanden forkortes med ~0,3 Å fra Michaelis-komplekset til overgangstilstanden ettersom hydridoverføringsreaksjonen oppstår, og at det er liten forskjell i denne avstanden (~0,01 Å) mellom overgangstilstanden og reaksjonsproduktet27. En annen studie ved bruk av blandet kvantum / klassisk molekylær dynamikk foreslo en mer dramatisk forkortelse av den tilsvarende avstanden med ~1 Å da reaksjonen utvikler seg fra reaktanten til overgangsstaten18. Derfor er våre krystallografiske observasjoner generelt enige med tidligere beregningsmodellering som tyder på AT FH4-komplekset til en viss grad bevarer overgangsstatens fysiske natur. Dette er også i samsvar med tidligere observasjoner på dynamisk energi landskapet i eDHFR kartlagt VED NMR avslapping dispersjon som hver mellomliggende i katalytisk syklus prøver lavtliggende opphisset tilstander som konformasjoner ligne grunn-tilstand strukturer av foregående eller følgende intermediates15. Siden enzymer stabiliserer overgangsstaten, kan langsom produktutgivelse AV DHFR-familien skyldes overføringen av den fysiske naturen til overgangsstaten til reaksjonsproduktkomplekset. Dette er foreslått fra det lenge forfulgte FH4-komplekset som er bestemt her, i tillegg til artsspesifikke konformasjonsendringer som kreves under katalytisk syklus32.

Karakterisering av et okkludert kompleks av eDHFR med en nanomolar bindingsaffinitets sakte innsettende inhibitor

røntgenkrystallografi viser at komplekset av eDHFR MED EN SAKTE innsettende tight inhibitor AMPQD46 også viser okkludert konformasjon. Met20-sløyfen vedtok en konformasjon I AMPQD-komplekset som ligner det ternære komplekset med en anti-diabetisk biguanid phenformin OG NADP+ (PDB ID: 5UIH) 52. PÅ DEN annen side BLE FDA-godkjent kjemoterapeutisk middel metotreksat tidligere demonstrert Ved røntgenkrystallografi24, 47, NMR48 og enkeltmolekylskinetikk49 for å binde i den lukkede DHFR-konformasjonen (Fig. 7). Denne uoverensstemmelsen i proteinkonformasjoner var uventet siden alle tre inhibitorene deler en felles strukturell funksjon: biguanidgruppen phenformin, diaminopyrimidingruppen AMPQD og diaminopteringruppen metotreksat, hver koblet til en fenylgruppe med en fleksibel linker. Men en nærmere undersøkelse fra den strukturelle superposisjon av de tilsvarende eDHFR-inhibitor komplekser (Fig. 7) viste at metylaminobindingsgruppen av metotrexatet (fraværende i phenformin OG AMPQD) okkuperte en posisjon som ville resultere i en potensiell sterisk sammenstøt Med Met20-sløyfen hvis den vedtok en okkludert konformasjon som i phenformin OG AMPQD-kompleksene. VI har tidligere vist AT AMPQD viste en relativt høyere preferanse (en tredoblet reduksjon I IC-50 og Ki) for å hemme eDHFR over human DHFR46. En enda høyere art-spesifisitet For E. coli over human DHFR (~30 ganger) observeres for modersubstansen TIL AMPQD, som mangler aminofenylhale-gruppen og metylenlinker46. Den nåværende krystallstrukturen til det okkluderte komplekset av eDHFR med AMPQD gir en plausibel mekanistisk forklaring på dens artsspesifisitet, som kan tilskrives forskjeller i konformasjonelle likevekter av menneskelig DHFR vs. eDHFR. Førstnevnte observeres utelukkende i lukkede konformasjoner, mens sistnevnte viser høyere konformasjonsfleksibilitetsprøvetaking i både lukkede og okkluderte konformasjoner,som diskutert neste.

Struktur av eDHFR: AMPQD-hemmende kompleks. En Stereovisning av de aktive nettstedinteraksjonene MED AMPQD med Fo-Fc utelater kartet på et 3,5 σ nivå. Proteinsidekjeder (cyan) innen 4 Å AV AMPQD (grønn) vises som pinner, inkludert to rester Fra Met20-sløyfen (gul). Polare interaksjoner er angitt med stiplede linjer. B Superposisjon AV AMPQD (grønn), phenformin( gul, PDB: 5UIH) 52, og metotreksat komplekser(grå vist som tynne pinner FRA PDB: 1RA3, 1DDS) 20,47. Met20 sløyfer vises som tegneserier og ligander som pinner. Ligandernes kjemiske strukturer er trukket på toppen. NADP (H) vises ikke i noen av strukturene for enkel visning

Sammenligning AV DHFR konformasjoner basert på clustering

en clustering AV DHFR PDB strukturer ved HJELP AV RMSD Av Met20 loop backbone Ca atomer som avstanden metriske (Fig. 8 Og Utfyllende Fig. 3) indikerer at menneskelig DHFR utelukkende vedtar en lukket konformasjon (katalytisk kompetent FOR NADPH-binding), mens eDHFR er mye mer fleksibel med både lukkede og okkluderte konformasjoner. De okkluderte konformasjonene ses sjeldnere (17%) i eDHFR-strukturer. Både det hastighetsbegrensende produktfrigjøringskomplekset MED FH4 og det sakte hemmende komplekset MED AMPQD adopterer en okkludert konformasjon av eDHFR (Fig. 9) det er sjelden representert I PDB (Supplerende Fig. 3). Interessant, både FH4 og AMPQD dele egenskapene til nanomolar affinitet og langsom frigjøring fra eDHFR35,36, 46 med plasseringen av de viktigste nitrogenatomer på heterocycles sterkt bevart, og forskjeller tydelig i haler. Dette antyder en ny strategi for å utvikle DHFR-hemmere ved å målrette okkluderte eDHFR-konformasjoner. Vi foreslår også en strategi for å bekjempe narkotikaresistens. Som vist I Supplerende Fig. 4, ved å sammenligne konformasjonen AV AMPQD TIL FH4 og trimethoprim TIL FH4, er det subtile forskjeller i van Der Waals-konvoluttene. Trimetoprim eDHFR escape varianter Av E. coli DHFR har mutasjoner som også blokkerer den hemmende funksjonen TIL AMPQD57. Ved å studere forskjellene i interaksjoner, kan man søke etter andre ligander som minimerer disse interaksjonsforskjellene MED FH2 og FH4. Dette kan sikre at mutasjoner, som reduserer inhibitorbindingen, også vil redusere bindingsaffiniteten TIL FH2 og FH4.

Clustering av 162 DHFR-strukturer basert pa deres parvis Ca RMSD av Met20-loopene. DHFR-strukturer er representert av sirkler fylt i blå (mennesker), grønn (eDHFR) og rød (i denne studien). Kantlengden (farget i lilla for den okkluderte og gull for de lukkede konformasjonene, henholdsvis) er proporsjonal med maksimal RMSD For Met20 loop conformers. Se et mer detaljert klyngediagram i Tilleggsinformasjonen

Superposisjon AV AMPQD (grønn) og FH4 komplekser (gul). Met20-løkkene vises som tegneserier og ligander som pinner. Visningen til høyre roteres 90° med klokken om den vertikale aksen fra perspektivet vist til venstre

Karakterisering av et ternært kompleks av eDHFR

Til Slutt, i en eDHFR: FH2:NADP (H) ternært kompleks med både ko-renset endogen ligand og kofaktorer (Fig. 10), fant vi At Met20-sløyfen blir uordnet. Dette støtter rollen som kofaktorbinding i å forbedre konformasjonsprøvetaking for rask ligandutveksling eller lette produktfrigjøring via en allosterisk mekanisme (TS‡2, Fig. 1)12,13,14,15. Nikotinamid ribose-delen svinger bort fra det aktive stedet (Fig. 10) ligner på det okkluderte FH4 ternære komplekset12. Dens redoks tilstand er ukjent basert på elektrontettheten. Evnen til å isolere forskjellige endogene ligandbundne, binære og ternære eDHFR-komplekser i varierende krystalliseringsforhold antyder at eDHFR inneholder en blanding av molekylære arter med forskjellige bundne ligander og et ensemble av konformasjoner. Effektiviteten av krystallografisk tilnærming anvendt her utnytter den molekylære inhomogenitet ved å utelate dialyse trinn for å isolere en lang forfulgt OG kjemisk labil FH4 kompleks krystallstruktur. Dette er i motsetning til den typiske prosessen som involverer forbehandling AV DHFR-prøver ved dialyse, som fjerner spor endogene ligander og øker prøvehomogeniteten. Forbedret homogenitet generelt forbedrer den totale suksessrate på ko-krystallisering eller krystall soaking eksperimenter, når ligander av interesse er eksogent innført.

Stereo utsikt OVER DHFR: FH2: NADP (H) ternær kompleks. Den uordnede met20-sløyfen (rester mellom Ile14 Og Pro21) er angitt som svarte stiplede linjer. Fo-Fc utelate-kartet på et 3,0 σ-nivå vises som rødt nett. Sekundære strukturer vises som tegneserier og ligander i en stavrepresentasjon. Atomer er farget som følger: karbon (hvit), nitrogen( blå), oksygen (rød) og fosfor (oransje)