regulerend Effect van melatonine op Cytokinestoornissen in de Pristane-geïnduceerde Lupus Muizen

Abstract

systemische lupus erythematosus (SLE) ontwikkelt zich in relatie tot vele omgevingsfactoren. Naar onze mening is het belangrijker om het effect van melatonine op het milieugerelateerde SLE te onderzoeken. In dit onderzoek werd 0,5 ml pristane gebruikt om SLE te induceren bij vrouwelijke BALB/c muizen. Melatonine (0,01, 0,1, 1,0 mg / kg) werd oraal toegediend onmiddellijk na pristane-injectie gedurende 24 weken. IgM anti ssDNA en Histon antilichamen werden gedetecteerd na 0, 1, 2, 4, 8 weken pristane injectie. De spiegels van IL-2, IL-6 en IL-13 werden na 24 weken gedetecteerd. Er werden ook nierlaesies waargenomen. De resultaten toonden aan dat melatonine de stijgende niveaus van IgM anti ssDNA en histone autoantilichamen tegenwerkte. Melatonine kan ook de IL-6-en IL-13-productie verlagen en de IL-2-productie verhogen. Bovendien kan melatonine de nierlaesies verminderen die door pristane worden veroorzaakt. Deze resultaten suggereren dat melatonine een gunstig effect heeft op pristane-geïnduceerde lupus door het reguleren van de cytokines stoornissen.

1. Inleiding

systemische lupus erythematosus (SLE of Lupus) is een auto-immuunziekte die de normale weefsels en cellen van het lichaam kan aanvallen, met ontsteking en weefselschade tot gevolg . SLE komt voor op elke leeftijd en in elk geslacht. Vrouwen hebben echter meer kans op SLE dan mannen . Bovendien is er ook melding gemaakt van verstoringen in het cytokinenetwerk in SLE , waaronder IL-1, IL-2, IL-6, IL-13 en IFN-. Deze cytokines hebben nauwe relaties met de ontwikkeling van SLE, zoals de productie van auto-antilichamen en immuuncomplex nefritis. Maar er zijn enkele tegenstrijdige resultaten over de veranderingen van sommige cytokines in verschillende rapporten.

In de afgelopen jaren is steeds meer aandacht besteed aan omgevingsfactoren die betrokken kunnen zijn bij de pathogenese van SLE . Auto-immuunziekten komen steeds vaker voor in geïndustrialiseerde landen, en deze ziekten kunnen worden beïnvloed door omgevingsfactoren . Pristane is een waarschijnlijke kandidaat als een milieu-trigger van SLE bij vatbare populatie. Dierexperimenten toonden aan dat pristane lupus-achtige auto-immuunziekteverschijnselen kon veroorzaken bij een stam van muizen (BALB/c), zoals hoge niveaus van auto-antilichamen en immuuncomplex glomerulonefritis . Sommige epidemiologische onderzoeken toonden ook aan dat alle personen met pristane in hun bloed verschillende auto-immuunziekten of symptomen van auto-immuunziekte hadden . Bovendien, ongerepte gevonden in minerale olie, haaienolie, en veel voedingsmiddelen lijkt een mogelijke blootstelling aan het milieu die SLE kan triggeren. Het zou dus beter zijn om omgevingsfactoren die betrokken zijn bij SLE te onderzoeken met behulp van pristane-geïnduceerde SLE-achtige muriene model.

melatonine wordt voornamelijk gesynthetiseerd en uitgescheiden door de pijnappelklier, die specifieke receptoren in en uit het centrale zenuwstelsel kan aanmaken. Melatonine kan niet alleen direct invloed hebben op ontsteking en immuuncellen, maar heeft ook indirecte invloeden op het door thalamencephalon . Nog belangrijker is dat melatonine wordt beschouwd als een belangrijke werkzame stof in het neuro-immuun-endocriene systeem . Het is in staat om de onbalans van cytokine netwerk in sommige auto-immuunziekten zoals reumatoïde artritis en adjuvante artritis regelen . Sommige experimenten onderzochten de effecten ervan op MRL-lpr/LPR muizen en toonden aan dat melatonine gunstig was voor spontane SLE bij vrouwtjesmuizen . Omdat milieu een belangrijke factor is in SLE in de moderne samenleving, waren we meer geïnteresseerd in de effecten van melatonine op de milieugerelateerde SLE.

om de rol van melatonine in SLE te onderzoeken, met name in de milieugerelateerde lupus, werden pristane-geïnduceerde muizen gebruikt. De effecten van melatonine op de cytokine stoornissen en de volgende veranderingen in het pristane-geïnduceerde SLE-model werden ook bepaald.

2. Materialen en methoden

2.1. Dieren

zestig vrouwelijke BALB / c muizen van twee maanden oud (g) werden geleverd door het Experimental Animal Center van de Anhui Medical University. Alle experimentele protocollen beschreven in deze studie werden goedgekeurd door de Ethische Toetsingscommissie voor dierproeven van het Instituut voor Klinische Farmacologie, Anhui Medical University.

2.2. Materialen

melatonine werd gekocht van Sigma. Pristane, warmte-gedenatureerd kalf thymus DNA (ssDNA), totaal kalf thymus histone (histone), concanavalin a (ConA), en lipopolysacchariden (LPS) waren ook van Sigma. Biotine-geconjugeerde konijn-anti-muis IgM antilichamen en mierikswortel peroxidase-geëtiketteerde avidin werden gekocht van . Muis interleukin-2 ELISA kits en interleukin-6 ELISA kits werden gekocht van ADL. Mouse interleukin-13 ELISA kits werden gekocht van BIOO.

2.3. Experimentele protocollen

zestig vrouwelijke BALB / c muizen werden willekeurig verdeeld in zes groepen: normale controlegroep, modelgroep, prednison-behandelingsgroep die als positieve controlegroep diende, en melatonine (0,01, 0,1, 1,0 mg/kg) behandelingsgroepen waaronder melatonine groep één (MT1), melatonine groep twee (MT2) en melatonine groep drie (MT3). De muizen in de normale controlegroep kregen een Intraperitoneale injectie van 0.5 ml normale zoutoplossing (NS)en de andere groepen kregen een Intraperitoneale injectie van 0,5 ml pristane. De muizen in de normale controlegroep en de model controlegroep kregen intragastrische toediening van NS per dag na de eerste behandeling. De muizen in de positieve controlegroep kregen intragastrische toediening van 5 mg / kg prednison (Pre) per dag. De muizen in de MT1-groep werden intragastrisch behandeld met 0,01 mg/kg melatonine, MT2 0,1 mg/kg melatonine en MT3 1,0 mg/kg melatonine. Voor de behandeling (0) en 2, 4 en 8 weken na de behandeling werden Sera uit de staartader verzameld om het niveau van auto-antilichamen te meten. Vierentwintig weken na pristane toediening, werden alle muizen gedood, en milten werden verwijderd voor immunologische detecties; ondertussen, werden nefrische weefsels onderzocht door lichtmicroscopie.

2.4. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (Elisa ‘ s) voor Anti-ssDNA en Histon antilichamen

Anti-ssDNA en Histon IgM antilichamen werden gedetecteerd met een ELISA techniek vergelijkbaar met degene zoals beschreven in . 96-wells ELISA-platen gecoat met 10 mg/L ssDNA of Histon-antigenen werden ‘ s nachts bij 4 geïncubeerd. De volgende dag werden de borden gewassen met PBS-Tween. De platen werden geïncubeerd met blokkerende buffer (PBS-2% runderserumalbumine) ‘ s nachts op 4 en gewassen met PBS-Tween. Na ‘ s nachts geïncubeerd op 4 met muriene serum verdund tot 1: 250, werden de platen opnieuw gewassen en vervolgens geïncubeerd voor 2 uur op 4 met biotine-geconjugeerde-konijn antimouse IgM antilichamen verdund tot 1 : 200. Vervolgens werden de platen gewassen en geïncubeerd gedurende 2 uur op 4 met mierikswortel peroxidase-gelabeld avidine in 1: 200 verdunning. De platen werden vervolgens opnieuw gewassen, en 100 L substraat-tetramethylbenzidine (TMB) en waterstofperoxide-oplossing werden toegevoegd aan de putten voor 30 minuten bij 37. De reactie werd beëindigd door toevoeging van 50 L van 2 M H2SO4 per putje. De intensiteit van de gele kleur werd afgelezen bij 490 nm in een microplaatlezer. De sera van andere acht normale balb / c muizen werden tegelijkertijd verzameld en gedetecteerd, en de gemiddelde dichtheid en SD werden berekend om als controle te dienen. De gemiddelde enzymindexen (EI) van de monsters in verschillende groepen werden berekend als:

2,5. Miltcelkweek en inductie van Cytokine

Miltcelkweek en inductie van cytokines waren wijzigingen van de methoden zoals beschreven in . Kort, werden eencellige suspensies bereid uit milten aseptisch verwijderd van muizen en gekweekt in 24-well kweekplaten bij een uiteindelijke concentratie van cellen/ml. De cellen werden gekweekt in RPMI-1640 aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 2 mm glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 50 m 2-mercaptoethanol, en 10 ml penicilline, streptomycine en antimycotische oplossing/l (Sigma). Culturen werden gestimuleerd met 3 mg / l ConA, 12 mg / L LPS, of medium alleen en geïncubeerd op 37 in bevochtigde lucht met 5% CO2. Het supernatant werd bij 48 uur geoogst en bij 20 bewaard voor cytokinebepalingen.

2.6. Cytokinebepalingen

de concentraties van interleukine-2 (IL-2), interleukine-6 (IL-6) en interleukine-13 (IL-13) in het supernatans werden bepaald met behulp van geschikte commerciële Elisa ‘ s voor de muriene vorm van deze cytokines. De intensiteit van elk monster werd afgelezen bij 450 nm in een microplaatspectrofotometer.

2.7. Histopathologische technieken

de nieren die werden verzameld tijdens het offeren van muizen werden gedurende 24 uur gefixeerd in neutraal gebufferde formaline voordat paraffine werd ingebed. Secties werden gekleurd met hematoxyline en eosine en Jones zilver methenamine en vervolgens onder een lichtmicroscoop onderzocht op de ernst van de nierlaesie. Glomerulonefritis, renale tubulaire laesies en interstitiële ontsteking werden waargenomen en de ernst van histologische laesies die kenmerkend zijn voor lupus nefritis werd beoordeeld als afwezig (), mild (), matig () en ernstig ().

2.8. Statistische analyse

resultaten werden uitgedrukt als SD. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de tweerichtings-t-test van de Student met als minimale significantieniveau

3. Resultaten

3.1. Effecten van melatonine op de spiegels van Anti-Ssdna-en Histonantilichamen van IgM in Sera

waren de spiegels van anti-ssDNA-en histonantilichamen van IgM significant verschillend tussen pristane-injectie-en melatoninebehandelingsgroepen (, figuur 1(A) en 1(b)).

(een)

b)

(a)
b)

Figuur 1

De sera van muizen in elke groep werden verzameld vóór de behandeling (0), 2, 4 en 8 weken later, en de niveaus van IgM-anti-ssDNA en Antihistone antilichamen werden ontdekt door ELISA. EI werd berekend volgens de formule. (A) het niveau van IgM anti-ssDNA antilichaam in elke groep, (b) het niveau van IgM Antihiston antilichaam in elke groep. De gegevens werden gegeven in gemiddelde ± SD (n=6-8). P*<.05, P* * <.01 versus sera bij 0 wk, ∆p<.05,∆∆p<.01 versus sera in modelcontrolemuizen.

twee weken na een enkele Intraperitoneale injectie van pristane begon het niveau van anti-Ssdna IgM-antilichamen in sera duidelijk te stijgen, bereikte een piek bij 4 weken, begon vervolgens te dalen en keerde uiteindelijk terug naar normaal bij 8 weken. In de MT1-groep nam het niveau van anti-Ssdna IgM-antilichamen in sera ook toe en bereikte de piek bij 4 wk, maar nam toen duidelijker af in vergelijking met de modelcontrolegroep (). In de MT2-groep nam het niveau van anti-Ssdna IgM-antilichamen in sera gedurende de eerste vier weken toe, maar veel lager dan dat van de modelgroep (), en bleef normaal in andere perioden. In de MT3-groep nam het niveau van anti-Ssdna IgM-antilichamen niet toe (figuur 1(a)).

Antihiston antilichamen in sera namen 1 wk na injectie toe, bereikten een piek bij 4 wk, Namen daarna geleidelijk af en keerden terug naar normaal bij 8 wk. In de MT1-groep waren de spiegels van Antihistonantilichamen in de sera significant lager dan die in de modelcontrolegroep () en waren weer normaal bij 4 weken. In MT2-en MT3-groepen namen de concentraties antilichamen tijdens de eerste vier weken toe, maar veel lager dan in de modelgroep (), en bleven ze normaal in de andere perioden (figuur 1(b)).

3.2. Effecten van melatonine op Cytokines productie

om een beter inzicht te krijgen in de invloed van melatonine op cytokines in SLE werd de productie van th1-type en Th2-type cytokines door splenocyten gestimuleerd met ConA of LP ‘ s onderzocht tijdens de loop van de muriene lupus. De resultaten toonden aan dat de productie van IL-2, IL-6 en IL-13 veranderde bij pristane-geïnduceerde SLE-muizen (Figuur 2). IL-2 productie van splenocyten van muizen in de modelcontrolegroep was lager dan die van normale muizen (), terwijl IL-6 en IL-13 productie van splenocyten van muizen in de modelcontrolegroep hoger was dan die van normale muizen (). In MT2 en MT3 groepen, IL-2 niveaus waren tot het normale niveau en hoger dan dat van model muizen duidelijk (), terwijl de IL-6 en IL-13 niveaus waren lager dan die van de model muizen duidelijk (,) (Figuur 2).

(een)

b)

c)

(a)
b)
c)

Figuur 2

Alle muizen geofferd werden aan het eind van 24 weken, en splenic lymfocyten werden gezaaid op 1×106 cellen/well. IL – 2 concentraties in miltlymfocyten werden gedurende 48 uur gestimuleerd met 3 mg/l ConA. IL-6-en IL-13-concentraties in miltlymfocyten werden gedurende 48 uur gestimuleerd met 12 mg/L LPS. IL-2 -, IL-6-en IL-13-concentraties in kweeksupernatanten werden gedetecteerd met ELISA. De gegevens werden gegeven in gemiddelde ± SD (n=4-5). P* * <.01, P * <.Vergeleken met de normale controlegroep, ∆p<.05, ∆∆p<.01 versus model controlegroep.

3.3. Effecten van melatonine op Nierhistopathologische veranderingen

de nierhistopathologische veranderingen van de muizen worden weergegeven in Tabel 1 en Figuur 3.

(een)

b)

c)

d)

(a)
b)
c)
d)

Figuur 3

De nieren zijn verzameld op het moment van het offer werden gekleurd met H&E voor histologisch onderzoek. a) normale controlegroep (HE×200). B) modelcontrolegroep (HE×200). c) modelcontrolegroep (HE×400). d) MT-groep (HE×200).

zoals getoond in Figuur 3 (a), werden bij normale muizen geen nierafwijkingen gezien. Het volume en het aantal cellen van glomeruli waren normaal. Glomerulaire capillaire wand was dun. In tubulus werd geen eiwitgips gezien. Lymfocyteninfiltratie en proliferatie van fibroblasten werden niet waargenomen in interstitiële niercellen.

zoals weergegeven in Figuur 3 (b) en 3(c) en Tabel 1, vertoonden de meeste pristane geïnjecteerde muizen nierafwijkingen variërend van lichte tot ernstige patronen. Sommige glomeruli vertoonden glomerulaire atrofie met verwijding van de haarvaten en verdikking van de capillaire wanden. Sommige cites onthulden trombusvorming. Mesangiale verbreding en cellagen die toenemen werden ook waargenomen. Glomerulaire capsulewand was dik, en de ruimte tussen capsulewand en endotheliale cellen verdween in ernstig aangetaste glomerulus. Sommige niertubuli toonden dilatatie en de epitheliale cellen proliferatie. Eiwitafgietsel werd gezien in tubulus. Een infiltratie van inflammatoire cellen zoals monocyten, lymfocyten, en plasmacytes met focale aggregatie werd gezien in renale interstitiële. Proliferaties van interstitiële fibroblasten werden ook waargenomen.

er waren enkele verbeteringen van verschillende gradaties bij met melatonine behandelde muizen (Figuur 3(d) en Tabel 1). Glomerulaire atrofie en verdikking van de capillaire wanden werden in lichte of matige mate veranderd. Ook de mesangiale verbreding werd verbeterd. De ruimte tussen capsulewand en endothelial cellen was kleiner dan dat van normale muizen maar er was een verbetering in vergelijking met de niet-behandelde modelgroep. Lichte lymfocyteninfiltratie werd ook waargenomen. Sommige niertubuli toonden milde verwijding en een paar eiwit afgietsels. Toch waren alle veranderingen minder ernstig dan die bij modelmuizen.

4. Discussie

In deze studie werden immuunstoornissen waargenomen bij muizen met pristane voorbehandeling en de effecten van melatonine. Aangezien anti-DNA en histone antilichamen gevoelig waren in SLE, onderzochten we de veranderingen van anti-ssDNA en Antihistone antilichamen IgM en vonden we hoge niveaus van auto-antilichamen in de pristane geïnjecteerde muizen. Bij de muizen werden ook nierlaesies gevonden. Deze resultaten waren in overeenstemming met de vorige verslagen. We vonden ook dat melatonine de toenemende niveaus van IgM anti-ssDNA en histone autoantilichamen tegenwerkte, en melatonine kon de nierletsels verminderen die door pristane worden veroorzaakt. Pristane is een peritoneale irriterende stof. Het is bekend dat de IgM-klasse door de B1 (CD5+) B-cel subset wordt geproduceerd , en de B1 subset hoogst verrijkt in de peritoneale holte en in balb/C muizen wordt uitgebreid , die de mogelijkheid opheffen dat IgM anti-ssDNA en antihistone antilichamen door I.p. pristane worden veroorzaakt uit de subset worden afgeleid . Eerdere studies meldden dat melatonine effecten had op de eerste antilichaamimmuunrespons (IgM, IgG) . Sommige studies toonden aan dat melatonine tweerichtingsmodulatie had op lymfocyten . We dachten dat melatonine de SLE-symptomen kon verbeteren door de overproductie van B-cellen te moduleren.

het Cytokinenetwerk speelt een belangrijke rol bij de ontwikkeling van SLE. In sommige in vitro experimenten kon melatonine de immuuneffecten van sommige cytokines en T-lymfocyten remmen . We observeerden de effecten van melatonine op de verstoring van het cytokinenetwerk. IL-6 wordt gedacht als ontstekingscytokine dat door een verscheidenheid van weefselcellen, met inbegrip van macrofagen en Th2-cellen wordt afgescheiden. IL-6-niveau heeft een positieve correlatie met de activiteitsindex van SLE. Onze resultaten toonden aan dat het niveau van IL-6 werd verhoogd na pristane injectie, terwijl melatonine de IL-6 productie kon verminderen. Het toenemende niveau van IL-6 kan ertoe leiden dat B-cellen meer antilichamen geheim houden en de ontwikkeling van nefritis bevorderen . Dus de downregulatie van IL-6 productie door melatonine is nuttig bij het remmen van de antilichamen productie en renale laesies.

IL-2 wordt uitgescheiden door Th1-cellen, en IL-13 wordt uitgescheiden door Th2-cellen. Er zijn enkele tegenstrijdige resultaten in de documenten over de veranderingen van IL-2 en IL-13. In dit ongerepte SLE-model onderzochten we de niveaus van de twee cytokines. Onze resultaten toonden aan dat het niveau van IL-2 in de pristane geïnjecteerde muizen lager was dan dat in de normale muizen, terwijl het niveau van IL-13 in de pristane geïnjecteerde muizen hoger was dan dat in de normale muizen. We vonden ook dat melatonine de IL-13 productie kon verminderen, maar de IL-2 productie verhoogde. Veel rapporten toonden aan dat het niveau van IL-2 in de SLE daalde, vooral in het actieve stadium, en dat IL-2 de activering van B-lymfocyten kon verlagen . Sommige onderzoeken toonden aan dat melatonine het niveau van IL-2/IL-2-receptoren kon reguleren , wat het mechanisme kan zijn van de remmende werking van melatonine op de IL-2-productie. IL-13, één van de belangrijkste cytokines in de lupus, werd verondersteld om een B-cel activerende factor te zijn die in de bovenmatige productie van vele autoantilichamen resulteerde . IL-13 heeft betrekking op de nierlaesies van SLE . Dus de downregulation van IL-13 productie door melatonine is ook nuttig in het remmen van de antilichamen productie en renale laesies.

het dalende niveau van th1-type cytokine en de stijgende niveaus van Th2-type cytokine duidden ook op een verschuiving van Th1 naar Th2 in ongerepte lupus. Sommige rapporten toonden aan dat exogene melatonine de T-cellen kon activeren en de th1-type cytokines beduidend kon bevorderen, die in het regelen van de immune verstoringen deelnemen . Onze resultaten toonden aan dat melatonine de th1-type cytokines kon opreguleren en de Th2-type cytokines. En dat gaf aan dat melatonine de verstoring van het cytokinenetwerk in de SLE muizen kon moduleren door de onbalans van Th1/Th2 te reguleren.

prednison, een veel voorkomend geneesmiddel voor SLE , werd in dit onderzoek als positief geneesmiddel gebruikt. We vonden dat prednison een regulerend effect had op pristane-geïnduceerde SLE. In vergelijking met prednison had melatonine een vergelijkbaar of iets eerder effect op de SLE-symptomen. Zoals bekend komen de bijwerkingen van prednison vaker voor en zijn ze ernstiger dan melatonine. Zo dachten we dat melatonine een potentieel medicijn voor SLE kan zijn.Concluderend kan worden gesteld dat door pristane geïnduceerde lupus stoornissen in het immuunsysteem vertoont, zoals een hoog niveau van auto-antilichamen en een onbalans in het cytokinenetwerk, wat de volgende nefritis induceert. De veranderingen zijn vergelijkbaar met de menselijke lupus, en pristane is gebruikelijk in het milieu; dus dit model is geschikt om de effecten van melatonine op milieu-gerelateerde SLE te bestuderen. Anderzijds hebben we ook aangetoond dat de toediening van melatonine de veranderingen in de pristane-geïnduceerde lupus remde. Dat suggereerde dat melatonine een gunstig effect had op lupus. De mechanismen kunnen zijn modulatie van verstoringen in het immuunsysteem, vooral in cytokines netwerk betrekken. Voor een beter begrip van het regelproces en de sleutelfactor voor de werking ervan op auto-immuunziekten moet echter nader onderzoek nodig zijn.