działanie 1,2,3-triazoli przeciw wężom jararaca i Lachesis Muta

Streszczenie

jadu węża są złożonymi mieszaninami białek zarówno enzymów, jak i nieenzymów, które są odpowiedzialne za wytwarzanie kilku efektów biologicznych. Zazdrość człowieka przez ukąszenia węży, szczególnie tych z rodziny viperid, wywołuje złożony obraz patofizjologiczny charakteryzujący się spektakularnymi zmianami hemostazy i często obserwuje się również krwotok. W niniejszej pracy opisano zdolność sześciu z serii pochodnych 1,2,3-triazolu do hamowania niektórych efektów farmakologicznych wywołanych przez jadowity Bothrops jararaca i Lachesis muta. Testy in vitro wykazały, że związki te były zaburzone w sposób zależny od stężenia, krzepnięcia fibrynogenu lub osocza, hemolizy i proteolizy wytwarzanej przez oba jadu. Ponadto związki te hamowały również efekty biologiczne in vivo. Myszy leczone tymi związkami były w pełni chronione przed uszkodzeniami krwotocznymi spowodowanymi takimi jadami. Ale tylko B. aktywność wywołująca obrzęk jararaca została zneutralizowana przez triazole. Tak więc hamujące działanie pochodnych triazoli przeciwko niektórym biologicznym testom in vitro i In vivo jadów węży wskazuje na obiecujące aspekty, które mogą wskazywać je jako modele molekularne w celu poprawy produkcji skutecznego środka przeciwwirusowego lub w celu uzupełnienia neutralizacji przeciwwirusowej, zwłaszcza lokalnych skutków patologicznych, które są częściowo neutralizowane przez środki przeciwwirusowe.

1. Wprowadzenie

jadu węża są złożonymi mieszaninami białek, w tym enzymów (metaloproteinaz, proteinaz serynowych, fosfolipaz A2 i oksydazy l-aminokwasowej) i białek bez aktywności enzymatycznej, takich jak dezintegryny, lektyny Typu C, białka wydzielnicze bogate w cysteinę (ostre) toksyny, peptydy natriuretyczne i miotoksyny. Jadowite żmije Bothrops jararaca i Lachesis muta są odpowiedzialne za wypadki z udziałem ludzi w kilku regionach Ameryki Południowej. Podczas gdy B. jararaca występuje w południowej Brazylii, Paragwaju i północnej Argentynie, L. muta występuje w lasach równikowych na wschód od Andów, od wschodniego Ekwadoru, Kolumbii, Peru, Północnej Boliwii i Wschodniej i północnej Wenezueli, po Gujanę, Gujanę Francuską, Surinam i północną Brazylię. W ich zasięgu są często obfite i są ważną przyczyną węży . Envenoming przez te węże charakteryzuje się głównie ogólnoustrojowe (uogólnione krwawienie, koagulopatia, niewydolność nerek i wstrząs) i lokalne skutki (krwotok, obrzęk i martwica) . Jak donoszono w innym miejscu, ukąszenia węży stanowią problem zdrowia publicznego w Ameryce Łacińskiej oraz w innych krajach tropikalnych i subtropikalnych, w których są uważane za zaniedbany problem zdrowotny, według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) . W Ameryce Południowej B. jararaca wywołuje większą częstość występowania ukąszeń (95%) niż L. muta (około 2%); jednak ukąszenia L. muta zwykle prowadzą do bardziej nasilonych objawów envenoming i jego śmiertelność jest trzykrotnie wyższa niż B. jararaca . Obecnie, pozajelitowe podawanie zwierzęcych leków przeciwwirusowych jest jedynym specyficznym sposobem na envenoming przez węży. W Brazylii dożylne podawanie wielowartościowego środka przeciwwirusowego Bothrops stosuje się w leczeniu przypadków wywołanych ukąszeniami Bothrops lub wielowartościowego surowicy bothropic-lachetic dla ukąszeń węża L. muta i Bothrops (B. atrox) w regionach Amazonii. Jak wspomniano powyżej, umiarkowane do ciężkich envenomings zadane przez Bothrops i Lachesis węże charakteryzują się złożoną serią lokalnych i systemowych zmian, takich jak krwotok, martwica mięśni, koagulopatia, wstrząs sercowo-naczyniowy, niewydolność nerek i ostatecznie śmierć . Jak donoszą inni autorzy, pomimo tego, że są bezpieczne, Wysokie dawki leków przeciwwirusowych czasami stosowane w Brazylii w leczeniu pacjentów z udowodnionym lub podejrzewanym bothrops/Lachesis envenoming mogą przyczyniać się do wczesnych reakcji anafilaktycznych i późnych (choroba posurowicza) typu . W związku z tym Produkcja środków przeciwwirusowych o odpowiedniej jakości stanowi spore wyzwanie. Co więcej, ceny surowic wzrosły, a niektóre kraje zaprzestały ich produkcji . Niektóre leki przeciwwirusowe skutecznie neutralizują ogólnoustrojowe toksyczne działanie jadu; jednak lokalne efekty nie są blokowane i sytuacja ta może prowadzić do amputacji lub niepełnosprawności .

z powodu takich problemów poszukiwano alternatywnych metod leczenia, a niektóre z nich obejmowały poszukiwanie nowych cząsteczek zdolnych do neutralizacji ogólnoustrojowych i lokalnych skutków jadu. Ekstrakty z roślin i innych naturalnych źródeł (jak te z organizmów morskich) zostały przetestowane pod kątem ich zdolności do neutralizacji różnych biologicznych i toksycznych skutków jadu węża. Zidentyfikowano różne farmakologicznie aktywne cząsteczki i wymieniono już dla nich wiele efektów, w tym ich zdolność przeciwwirusową . Obecnie bada się wiele nowych metod bioprospekcji. W związku z tym należy jednak zauważyć, że jak dotąd nie zbadano dobrze biologicznych skutków cząsteczek pochodzących z syntezy organicznej. W literaturze opisano związek 1,2,3-triazolowy jako ważną klasę pięcioczłonowego układu heterocyklicznego azotu, który wykazuje różne profile farmakologiczne , takie jak aktywność przeciwpłytkowa , przeciwlotting , przeciwwirusowe , trypanobójcze , przeciwdrobnoustrojowe i/lub ich zastosowanie w leczeniu schizofrenii i leiszmaniozy . Dostępne są dwie ogólne metody budowy pierścieni 1,2,3-triazolowych: reakcje cykloaddycji 1,3-dipolowej Huisgena, w szczególności cykloaddycja katalizowana miedzią (I) i wewnątrzcząsteczkowa 1,5-elektrocyklizacja związków β-podstawionych-α-diazokarbonylowych . Nasze poprzednie badania wykazały, że sześć nowych syntetycznych związków 1,2,3-triazolowych (estry etylowe kwasu 1-arylosulfonyloamino-5-metylo-1H-triazolo-4-karboksylowego) hamowało hemolizę indukowaną przez jad L. muta . W rzeczywistości takie pochodne wykazywały szeroki zakres działań farmakologicznych .

celem pracy była ocena zdolności tych sześciu pochodnych 1,2,3-triazolowych opartych na –1-(P-chlorofenylo)-1h–triazolo-4-węglowodanów do aktywności in vivo i in vitro jadów Bothrops jararaca i Lachesis muta.

2. Materiał

2.1. Jad i materiał

Bothrops jararaca, Lachesis Muta liofilizowane jadowite i anty-Lachesis lub anty-Bothropic antivenom dostarczono z Fundação Ezequiel Dias, Belo Horizonte, MG, Brazylia i przechowywano w temperaturze -20°C do czasu testów. Dimetylosufoksyd (DMSO), fibrynogen bydlęcy i azokaseinę otrzymano z Sigma Chemical Co. Wszystkie inne odczynniki były najlepszej dostępnej klasy.

2.2. Syntetyczne pochodne

sześć pochodnych estrów etylowych kwasu 1-arylosulfonyloamino-5-metylo-1h-triazolo-4-karboksylowego zsyntetyzowano zgodnie z naszym poprzednim raportem, a ich struktury chemiczne przedstawiono na fig.1. Związki te rozpuszczono w dimetylosulfotlenku (DMSO) i przechowywano w temperaturze 4°C, dopóki nie jest to wymagane.

Rysunek 1

struktury chemiczne sześciu pochodnych 1,2,3-triazoli N ’ –1-(P-chlorofenylo) – 1h–triazolo-4-węglowodanów. Sześć pochodnych zostało zaprojektowanych jako liczby, jak pokazano w nawiasie po każdej pochodnej.

2.3. Zwierzęta

myszy BALB/c (18-20 g) pozyskano z núcleo de Animais de Laboratório (NAL) Federalnego Uniwersytetu Fluminense. Zwierzęta trzymano w kontrolowanych warunkach temperatury (°C) i światła. Eksperymenty zostały zatwierdzone przez UFF Institutional Committee for Ethics in Animal Experimentation (protokół nr 297), które były zgodne z wytycznymi brazylijskiego Komitetu ds.

3. Metody

3.1. Hamowanie hemolizy pośredniej

stopień hemolizy spowodowanej jadami L. muta I B. jararaca określono w pośrednim teście hemolitycznym z użyciem ludzkich erytrocytów i emulsji żółtka jaja kurzego jako substratu . Ilość L. muta i B. jad jararaca (µg / mL), który powodował 100% hemolizy, oznaczono jako minimalną pośrednią dawkę hemolityczną (mihd). Eksperymenty hamujące przeprowadzono przez inkubację pochodnych triazolu z jednym MIHD przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie oceniono aktywność hemolityczną. Eksperymenty kontrolne przeprowadzono przez inkubację jadów z DMSO lub roztworem soli fizjologicznej.

3.2. Aktywność przeciwzakrzepowa

aktywność krzepnięcia jadów L. muta I B. jararaca oznaczono za pomocą cyfrowego koagulometru Amelunga, model KC4A (Labcon, Niemcy). Różne stężenia L. jad muta (10 µg/mL) i jad B. jararaca (40 µg/mL) zmieszano z bydlęcym roztworem fibrynogenu (2 mg/mL) lub z ludzkim osoczem, a ilość jadu, która skrzepła fibrynogen lub osocze w ciągu 60 sekund, oznaczono jako minimalną dawkę koagulanta (MCD). Aby ocenić ich działanie hamujące, pochodne triazolu inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej z jednym MCD jadów, a następnie mieszaninę dodano do fibrynogenu lub osocza i zarejestrowano czas krzepnięcia. Eksperymenty kontrolne przeprowadzono równolegle, dodając DMSO lub sól fizjologiczną inkubowaną z jadami, zamiast triazoli.

3.3. Aktywność Antyproteolityczna

aktywność proteolityczna jadów L. muta i B. jararaca oznaczano przy użyciu azokaseiny jako substratu (0,2% wagowych, w 20 mM Tris-HCl, 8 mM CaCl2, pH 8,8), z niewielką modyfikacją . Skuteczne stężenie (EC) zdefiniowano jako ilość jadu (µg/mL) zdolnego do wytworzenia zmienności przy 420 nm około 0,2. Pochodne triazolu inkubowano z jednym EC jadu przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zmierzono proteolizę. Eksperymenty kontrolne przeprowadzono przez inkubację jadów z DMSO lub roztworem soli fizjologicznej.

3.4. Działanie przeciwkrwotoczne

zmiany krwotoczne wywołane przez L. muta i B. jararaca venoms oznaczono ilościowo za pomocą procedury opisanej przez Kondo i wsp. , z modyfikacjami. Krótko, próbki wstrzykiwano śródskórnie (i.d.) w skórę brzucha myszy. Dwie godziny później zwierzęta zostały uśmiercone przez ścięcie głowy, skórę brzucha usunięto, rozciągnięto i sprawdzono pod kątem zmian wizualnych w aspekcie wewnętrznym w celu zlokalizowania plam krwotocznych. Krwotok został określony jako minimalna dawka krwotoczna (MHD), zdefiniowana jako ilość jadu (mg/kg) zdolnego do wytworzenia halo krwotocznego 10 mm . Działanie hamujące pochodnych triazolu badano przez inkubację związków z dwoma MHD jadu L. muta lub B. jararaca przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie mieszaninę wstrzyknięto myszom i mierzono krwotok. Aktywność krwotoczną wyrażono jako średnią średnicę (w milimetrach) halo krwotocznego wywołanego przez jadowity przy braku i obecności pochodnych triazolu. Eksperymenty z kontrolą negatywną przeprowadzono przez wstrzyknięcie DMSO lub roztworu soli fizjologicznej.

3.5. Aktywność przeciwedematogenna

aktywność wywołująca obrzęk jadów L. muta i B. jararaca oznaczono zgodnie z Yamakawa et al. , z modyfikacjami. Grupy pięciu myszy wstrzyknięto podskórnie (s.c) do prawej części stopy 50 µL jadu, podczas gdy lewa część żywności otrzymała 50 µL soli fizjologicznej. Godzinę po wstrzyknięciu oceniano obrzęk i wyrażano go jako procent wzrostu masy prawej poduszki stopy w porównaniu do lewej. Działanie hamujące pochodnych triazolu badano przez inkubację związków z jadem L. muta lub B. jararaca przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie mieszaninę wstrzyknięto myszom (poduszka prawej stopy) i zmierzono obrzęk.

3.6. Analiza statystyczna

wyniki są wyrażone jako średnie ± sem uzyskane przy wskazanej liczbie zwierząt lub przeprowadzonych eksperymentów. Istotność statystyczną różnic między grupami eksperymentalnymi oceniano za pomocą testu studenta. Wartość ≤ 0,05 została uznana za znaczącą.

4. Wyniki i dyskusja

na uwagę zasługuje opracowanie skutecznych, bezpiecznych, tańszych i bardziej dostępnych leków przeciwwirusowych, ponieważ ukąszenia węży mogą powodować poważne upośledzenia i zabijać tysiące ludzi. Coraz więcej badań koncentruje się na poszukiwaniu inhibitorów jadów węży z różnych źródeł, zarówno naturalnych, jak i syntetycznych . Suramina i benzoilofenylobenzoesan są syntetycznymi cząsteczkami zdolnymi do hamowania miotoksyczności, krzepnięcia oraz aktywności fosfolipazy A2 i hialuronidazy jadów węży z różnych rodzin. Analogi laktonowe zsyntetyzowano i hamowano miotoksyczność, a także indukujące obrzęki i enzymatyczne działania indukowane przez fosfolipazę A2 wyizolowaną z B. jararacussu . Z drugiej strony, morskie Zasady bioaktywności również przyciągnęły uwagę ze względu na ich szeroko rozpowszechnione działania farmakologiczne .

w tej pracy oceniono zdolność sześciu estrów etylowych kwasu 1-arylosulfonyloamino-5-metylo-1h-triazolo-4-karboksylowego do neutralizacji niektórych aktywności in vitro (hemoliza, krzepnięcie i proteoliza) i In vivo (krwotok i obrzęk) wywołanych przez B. jararaca i L. Muta venoms, ponieważ poprzednie wyniki wskazywały, że te sześć pochodnych hamowało hemolizę indukowaną przez jad L. muta, ale o różnej sile działania . Z tego powodu uważano, że warto byłoby zbadać działanie takich pochodnych na inne ważne działania biologiczne związane z ukąszeniami węży, takie jak proteoliza, krzepnięcie, hemoliza, krwotok i obrzęk. Wykazano, że związki te hamowały hemolizę wywołaną przez jad B. jararaca (50 µg/mL) i L. muta (15 µg/mL) (Fig. Procent hamujący pochodnych wynosił powyżej 50% w stosunku do obu jadów. Jednakże zaobserwowano niewielką różnicę w profilu hamującym pochodną 6, gdzie 50% i 90% hamowanie hemolizy uzyskano odpowiednio dla jadu B. jararaca i L. muta. Ani pochodne, ani DMSO nie prowadziły erytrocytów do hemolizy, ani DMSO nie ingerowały w Stopień hemolizy spowodowanej przez jady.

(a)

(b)

(a)
(b))

Rysunek 2

wpływ pochodnych na hemolizę i proteolizę. Pochodne 1-6 (45 µM) inkubowano z B. jararaca (ciemne kolumny) lub z L. muta (przerywane kolumny) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wykonywano czynności hemolityczne (a) i proteolityczne (B). Dane są wyrażone jako średnia ± SEM poszczególnych eksperymentów ().

Envenomation przez tych węży powoduje poważny krwotok ze względu na wysoką zawartość metaloproteazy zależnej od cynku lub proteazy serynowej, które trawią składniki białkowe macierzy zewnątrzkomórkowej lub zużywają czynniki krzepnięcia krwi . B. jararaca i L. jad muta zhydrolizował azokaseinę w sposób zależny od stężenia z EC odpowiednio 20 µg / mL i 6 µg / mL (dane nie pokazane). Pochodne hamowały proteolizę indukowaną przez B. jararaca lub L. muta (fig. 2 (b)). Pochodne 1, 2, 3 i 6 hamowały proteolizę indukowaną przez oba jadu do 80%, a pochodna 5 hamowała taką aktywność poniżej 50%. Zaobserwowano wyraźną różnicę w profilu hamowania pochodnych dla pochodnej 4, w której hamowała ona 97% i 25% proteolizę indukowaną odpowiednio przez jad B. jararaca lub L. muta (fig. 2(B)).

jak widać na fig.3, pochodne 1, 2, 4, 5 i 6, ale nie pochodna 3 hamowała w sposób zależny od stężenia (23-94 µM) krzepnięcie fibrynogenu indukowane przez jadowity B. jararaca (40 µg/mL) lub L. muta (10 µg/mL). Wydawało się, że pochodne hamują bardziej efektywnie krzepnięcie L. muta niż B. jararaca. Przy najwyższym stężeniu (94 µM) pochodne 1, 2, 3, 5 i 6 zapobiegały krzepnięciu L. muta (Fig.3(b)), podczas gdy pochodne 2 i 6 zapobiegały krzepnięciu B. jararaca raz (Fig. 3(b)). W stężeniach do 200 µM wszystkie pochodne 1,2,3-triazolu skutecznie zapobiegały krzepnięciu fibrynogenu wywołanemu przez oba jadu, ale w stężeniach poniżej 10 µM żaden z tych związków nie zapobiegał krzepnięciu. Jednakże, gdy pochodne (10 µM) połączono i inkubowano z jadem B. jararaca lub L. muta, czas krzepnięcia był dwukrotnie opóźniony. Zauważono, że jeśli pochodna 2 lub 6 została usunięta z mieszaniny, nie obserwowano działania hamującego krzepnięcie. Ponadto pochodne zapobiegały również krzepnięciu indukowanemu przez jadu podczas stosowania osocza. Ani DMSO (1% v/v, stężenie końcowe), ani roztwór soli fizjologicznej nie zakłócały procesów krzepnięcia.

(a)

(b)

(a)
(b)

Rysunek 3

wpływ pochodnych na krzepnięcie fibrynogenu. Dwadzieścia trzy pochodne µM (szare kolumny), 46 µM (białe kolumny) lub 94 µM (Czarne kolumny) inkubowano z 40 µg/mL B. jararaca (a) lub z 10 µg/mL L. muta (b) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie mieszaninę dodano do fibrynogenu (2 mg / mL) i zarejestrowano czas krzepnięcia. Jadalne inkubowano z solą fizjologiczną (C1); 1% v/V DMSO (C2); pochodną 1 (kolumna 1); pochodną 2 (kolumna 2); pochodną 3 (kolumna 3); pochodną 4 (kolumna 4); pochodną 5 (kolumna 5); i pochodną 6 (kolumna 6). # oznacza, że fibrynogen skrzepł dopiero po 600 sekundach obserwacji. Dane są wyrażone jako średnia ± SEM poszczególnych eksperymentów ().

śródskórne wstrzyknięcie jadu B. jararaca (12 mg/Kg) lub L. muta (20 mg/Kg) spowodowało u myszy halo krwotoczne o średnicy 20 mm. Halo takie reprezentuje dwa MHD jadów. Kiedy każdy jad zmieszano z pochodnymi (90 µM), a następnie wstrzyknięto myszom, zaobserwowano całkowitą ochronę przed krwotokiem (dane nie pokazano). W przeciwieństwie do poprzednich wyników wykazano, że surowica antylektyczna nie hamuje krwotoku wywołanego jadem L. muta . Wstrzyknięcie DMSO, pochodnych lub roztworu soli fizjologicznej nie spowodowało krwotoku. Wywoływanie obrzęków to kolejny ważny efekt, który następuje po ukąszeniu węża . Fig. 4 pokazuje, że obrzęk wywołany przez 5 mg/Kg B. jararaca(Fig. 4 (A)) lub 8 mg / Kg L. muta(Fig.4 (b)) została znacząco zredukowana przez pochodne (90 µM). Pochodne triazolu 1, 2 i 4 hamowały powyżej 80% obrzęku wywołanego przez B. jararaca, podczas gdy pochodne 3, 5 i 6 hamowały około 70% (Fig. 4 (A)). Jak widać, wszystkie pochodne hamowały mniejszą aktywność edematogenną wywołaną przez L. muta (Fig. 4 (b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Rysunek 4

wpływ pochodnych na aktywność wywołującą obrzęk. Pochodne (90 µM) inkubowano z 5 mg/Kg B. jararaca (a) lub z 8 mg/Kg L. muta (b) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przeprowadzono aktywność wywołującą obrzęk. Kolumny to pochodna 1 plus jad (1); pochodna 2 plus jad (2); pochodna 3 plus jad (3); pochodna 4 plus jad (4); pochodna 5 plus jad (5) i pochodna 6 plus jad (6). Dane są wyrażone jako średnia ± SEM poszczególnych eksperymentów ().

podsumowując, pochodne estrów etylowych kwasu 1-arylosulfonyloamino-5-metylo-1h-triazolo-4-karboksylowego mogą być użyteczne jako prototypy do projektowania nowych cząsteczek w celu poprawy obecnego leczenia stosowanego w ukąszeniach węża B. jararaca i L. muta. Siła hamowania tych pochodnych może się różnić lub może być zwiększona, gdy zostały one połączone razem, prawdopodobnie działając synergistycznie. Tak więc, niższe ich stężenie byłoby potrzebne do osiągnięcia całkowitej neutralizacji skutków biologicznych wywołanych przez jadowity B. jararaca i L. muta. Ponadto przeprowadzono już wcześniejszą analizę relacji struktura-aktywność pochodnych . Pochodne zostały poddane analizie „reguły Lipińskiego pięciu”, która wskazuje, że cząsteczka chemiczna może być aktywnym doustnie lekiem u ludzi i taka zasada stwierdza, że cząsteczka naruszająca dowolne dwie z poniższych zasad może być słabo wchłaniana: (1) Masa cząsteczkowa mniejsza niż 500 Da, (2) liczba dawców wiązań wodorowych (grupy OH lub NH) równa lub mniejsza niż 5, (3) Liczba akceptorów wiązań wodorowych mniejsza niż 10 i wreszcie (4) obliczona mniej niż 5 . Wyniki wykazały, że wszystkie pochodne spełniają tę zasadę (Masa cząsteczkowa = 296,31–341,30; 2,6–3,4; nHBA = 8-11 i nHBD = 1-3) wskazując na dobrą teoretyczną biodisponibialność .

podziękowania

praca ta była wspierana przez Międzynarodową Fundację na Rzecz Nauki (IFS Grant F / 4571-1) oraz przez następujące brazylijskie agencje finansujące: Krajowa Rada Rozwoju Nauki i technologii (z), Fundacja ” wsparcie badań w stanie Rio de Janeiro Carlos Chagas syn (FAPERJ), koordynacja kwalifikacji personelu najwyższego poziomu (CAPES), and Universidade Federal Fluminense/dziekanem badań i Szkolnictwa Wyższego i innowacji (FFU / PROPPi).