efectele Antivenom ale 1,2,3-triazolilor împotriva Bothrops jararaca și Lachesis muta șerpi

rezumat

veninurile de șarpe sunt amestecuri complexe de proteine atât ale enzimelor, cât și ale nonenzimelor, care sunt responsabile pentru producerea mai multor efecte biologice. Envenomarea umană prin mușcături de șarpe în special cele din familia viperidelor induce o imagine patofiziologică complexă caracterizată prin modificări spectaculoase ale hemostazei și frecvent se observă și hemoragie. Lucrarea de față raportează capacitatea a șase dintr-o serie de derivați de 1,2,3-triazol de a inhiba unele efecte farmacologice cauzate de veninurile Bothrops jararaca și Lachesis muta. Testele in vitro au arătat că acești compuși au fost afectați într-o manieră dependentă de concentrație, fibrinogenul sau coagularea plasmatică, hemoliza și proteoliza produse de ambele veninuri. Mai mult, acești compuși au inhibat și efectele biologice in vivo. Șoarecii tratați cu acești compuși au fost pe deplin protejați de leziunile hemoragice cauzate de astfel de veninuri. Dar, numai B. activitatea de inducere a edemului jararaca a fost neutralizată de triazoli. Deci, efectul inhibitor al derivaților triazolilor împotriva unor teste biologice in vitro și in vivo ale veninurilor de șarpe indică aspecte promițătoare care le pot indica ca modele moleculare pentru a îmbunătăți producția de antivenom eficient sau pentru a completa neutralizarea antivenomului, în special efectele patologice locale, care sunt parțial neutralizate de antivenomuri.

1. Introducere

veninurile de șarpe sunt amestecuri complexe de proteine, inclusiv enzime (metaloproteinaze, serin proteinaze, fosfolipaze A2 și L-aminoacizi oxidază) și proteine fără activitate enzimatică, cum ar fi dezintegrine, lectine de tip C, proteine secretoare bogate în cisteină (clare) toxine, peptide natriuretice și miotoxine. Viperele veninoase Bothrops jararaca și Lachesis muta sunt responsabile pentru accidentele care implică oameni în mai multe regiuni din America de Sud. În timp ce B. jararaca se găsește în sudul Braziliei, Paraguay și nordul Argentinei, L. muta este distribuit în pădurile ecuatoriale la est de Anzi, variind de la estul Ecuadorului, Columbia, Peru, nordul Boliviei și estul și nordul Venezuelei, până la Guyana, Guyana Franceză, Surinam, și nordul Braziliei. În raza lor de acțiune, ele sunt adesea abundente și sunt o cauză importantă a mușcăturilor de șarpe . Envenomarea acestor șerpi se caracterizează în principal prin sistemice (sângerare generalizată, coagulopatie, insuficiență renală și șoc) și efecte locale (hemoragie, edem și necroză) . După cum sa raportat în altă parte, mușcăturile de șarpe constituie o problemă de sănătate publică în America Latină și în alte țări tropicale și subtropicale, în care sunt considerate o problemă de sănătate neglijată, potrivit Organizației Mondiale a Sănătății (OMS) . În America de Sud, B. jararaca induce o incidență mai mare a mușcăturilor (95%) decât L. muta (circa 2%); cu toate acestea, mușcăturile de L. muta duc de obicei la simptome de envenoming mai severe, iar incidența letalității sale este de trei ori mai mare decât B. jararaca . În zilele noastre, administrarea parenterală a antivenomului derivat din animale este singurul tratament specific pentru envenoming prin mușcături de șarpe. În Brazilia, administrarea intravenoasă a ambelor Bothrops antivenom polivalent este utilizată pentru a trata cazurile envenoming cauzate de mușcăturile Bothrops sau serul polivalent bothropic-lachetic pentru mușcăturile de șarpe L. muta și Bothrops (B. atrox) în regiunile amazoniene. După cum sa menționat mai sus, atenuările moderate până la severe cauzate de șerpii Bothrops și Lachesis se caracterizează printr-o serie complexă de modificări locale și sistemice, cum ar fi hemoragia, mionecroza, coagulopatia, șocul cardiovascular, insuficiența renală și, în cele din urmă, moartea . După cum au raportat alți autori, în ciuda faptului că sunt sigure, dozele mari de antivenomuri utilizate uneori în Brazilia pentru a trata pacienții cu Bothrops/Lachesis dovedite sau suspectate pot contribui la reacții de tip anafilactic precoce și tardiv (boală serică). Astfel, producția de antivenomuri de o calitate adecvată prezintă o provocare considerabilă. Mai mult, prețurile antivenomurilor au crescut, iar unele țări și-au oprit fabricarea . Unele antivenomuri neutralizează eficient efectele toxice sistemice ale veninului; cu toate acestea, efectele locale nu sunt blocate și această situație poate duce la amputare sau dizabilitate .

din cauza unor astfel de probleme, au fost căutate tratamente alternative, iar unele dintre ele au implicat căutarea de noi molecule capabile să neutralizeze efectele sistemice și locale ale veninurilor. Extractele din plante și alte surse naturale (precum cele din organismele marine) au fost testate pentru capacitatea lor de a neutraliza o varietate de efecte biologice și toxice ale veninurilor de șarpe. Au fost identificate diferite molecule farmacologic active și multe efecte au fost deja enumerate pentru acestea , inclusiv capacitatea lor de antivenin . În zilele noastre, sunt investigate multe noi abordări bioprospective. Cu toate acestea, în legătură cu aceasta, trebuie remarcat faptul că încă efectele biologice ale moleculelor derivate din sinteza organică nu au fost bine explorate. Literatura de specialitate a descris compusul 1,2,3-triazol ca o clasă importantă de sistem heterociclic de azot cu cinci membri, care prezintă profiluri farmacologice diferite , cum ar fi activitatea antiplachetară , anticlotarea , antivirală , tripanocidă , antimicrobiană și/sau utilizarea lor în tratarea schizofreniei și leishmaniozei . Sunt disponibile două metode generale pentru construirea inelelor de 1,2,3-triazol: reacții de Cicloadiție Huisgen 1,3-dipolare , în special cicloadiția catalizată de cupru(I) și 1,5-electrociclizarea intramoleculară a compușilor de diazocarbonil substituiți-de-la-de-la-de-la-de-la-de-la . Studiile noastre anterioare au indicat că șase noi compuși sintetici 1,2,3-triazol (esteri etilici ai acidului 1-arilsulfonilamino-5-metil-1h-triazol-4-carboxilic) au inhibat hemoliza indusă de veninul L. muta . De fapt, astfel de derivați au prezentat o gamă largă de activități farmacologice .

scopul acestei lucrări a fost de a evalua capacitatea acestor șase derivați de 1,2,3-triazol pe bază de –1-(p-clorofenil)-1h–triazol-4-carbohidrazidă împotriva activităților in vivo și in vitro ale veninurilor Bothrops jararaca și Lachesis muta.

2. Material

2.1. Veninul și Materialul

Bothrops jararaca, Lachesis muta veninuri liofilizate și anti-Lachesis sau anti-bothropic antivenin au fost furnizate de la funda Ilfoto Ezequiel Dias, Belo Horizonte, MG, Brazilia și depozitate la -20 Ilfov C până la teste. Dimetilsufoxidul (DMSO), fibrinogenul bovin și azocaseina au fost obținute din Sigma Chemical Co. Toți ceilalți reactivi au fost de cea mai bună calitate disponibilă.

2.2. Derivați sintetici

cei șase derivați ai esterilor etilici ai acidului 1-arilsulfonilamino-5-metil-1h–triazol-4-carboxilic au fost sintetizați conform raportului nostru anterior, iar structurile lor chimice sunt prezentate în Figura 1. Acești compuși s-au dizolvat în dimetilsufoxid (DMSO) și s-au păstrat la 4 C, până la necesitate.

Figura 1

structuri chimice ale celor șase derivați de 1,2,3-triazoli N ‘ –1-(p-clorofenil)-1h–triazol-4-carbohidrazidă. Cele șase derivate au fost concepute ca numere, așa cum se arată în paranteză după fiecare derivat.

2.3. Animale

BALB/c șoareci (18-20 g) au fost obținute de la N-Ulktskleo de Animais de laborat Oktstrio (NAL) de la Universitatea Federală Fluminense. Animalele au fost adăpostite în condiții controlate de temperatură (C) și lumină. Experimentele au fost aprobate de Comitetul instituțional UFF pentru Etică în experimentarea pe animale (protocolul numărul 297), care au fost în conformitate cu liniile directoare ale Comitetului Brazilian pentru experimentarea pe animale (COBEA) și cu legile și politicile internaționale.

3. Metode

3.1. Inhibarea hemolizei indirecte

gradul de hemoliză cauzat de veninurile L. muta și B. jararaca a fost determinat prin testul hemolitic indirect folosind eritrocite umane și emulsie de gălbenuș de ou de găină ca substrat . Cantitatea de L. muta și B. veninul de jararaca (hectolitru / mL) care a produs hemoliză 100% a fost notat ca doză hemolitică indirectă minimă (MIHD). Experimentele inhibitoare au fost efectuate prin incubarea derivaților triazolici cu un MIHD timp de 30 de minute la temperatura camerei și apoi a fost evaluată activitatea hemolitică. Experimentele de Control au fost efectuate prin incubarea veninurilor cu DMSO sau soluție salină.

3.2. Activitatea Anticlotting

activitatea de coagulare a veninurilor L. muta și B. jararaca a fost determinată utilizând un Coagulometru Digital Amelung, model KC4A (Labcon, Germania). Concentrații diferite de L. veninul muta (10% / ml) și B. jararaca (40%/mL) au fost amestecate cu soluție de fibrinogen bovin (2 mg/mL) sau cu plasmă umană, iar cantitatea de venin care a coagulat fie fibrinogenul, fie plasma în 60 de secunde a fost notată ca doză minimă de coagulant (MCD). Pentru a evalua efectul lor inhibitor, derivații triazolului au fost incubați timp de 30 de minute la temperatura camerei cu un MCD de veninuri și apoi amestecul a fost adăugat la fibrinogen sau plasmă și timpul de coagulare înregistrat. Experimentele de Control au fost efectuate în paralel prin adăugarea de DMSO sau soluție salină incubată cu veninuri, în loc de triazoli.

3.3. Activitatea antiproteolitică

activitatea proteolitică a veninurilor L. muta și B. jararaca a fost determinată utilizând azocaseina ca substrat (0,2% g/v, în Tris-HCl de 20 mM, 8 mm CaCl2, pH 8,8), cu modificări minore . O concentrație eficientă (ce) a fost definită ca fiind cantitatea de venin (hectog/mL) capabilă să producă o variație la 420 nm de aproximativ 0,2. Derivații de triazol au fost incubați cu un EC de venin timp de 30 de minute la temperatura camerei și apoi s-a măsurat proteoliza. Experimentele de Control au fost efectuate prin incubarea veninurilor cu DMSO sau soluție salină.

3.4. Activitatea antihemoragică

leziunile hemoragice produse de veninurile L. muta și B. jararaca au fost cuantificate folosind o procedură descrisă de Kondo și colab. , cu modificări. Pe scurt, probele au fost injectate intradermic (i.d.) în pielea abdominală a șoarecilor. Două ore mai târziu, animalele au fost eutanasiate prin decapitare, pielea abdominală îndepărtată, întinsă și inspectată pentru modificări vizuale ale aspectului intern pentru a localiza petele hemoragice. Hemoragia a fost cuantificată ca doză hemoragică minimă (MHD), definită ca cantitatea de venin (mg/kg) capabilă să producă un halou hemoragic de 10 mm . Efectul inhibitor al derivaților de triazol a fost investigat prin incubarea compușilor cu două MHD de venin L. muta sau B. jararaca timp de 30 de minute la temperatura camerei și apoi amestecul a fost injectat la șoareci și s-a măsurat hemoragia. Activitatea hemoragică a fost exprimată ca diametrul mediu (în milimetru) al halo-ului hemoragic indus de veninuri în absența și prezența derivaților triazolici. Experimentele de control negativ au fost efectuate prin injectarea de DMSO sau soluție salină.

3.5. Activitatea antiedematogenă

activitatea de inducere a edemului veninelor L. muta și B. jararaca a fost determinată în conformitate cu Yamakawa și colab. , cu modificări. Grupuri de cinci șoareci au fost injectați subcutanat (s. c) în tamponul piciorului drept cu 50 Ilfov de venin, în timp ce tamponul alimentar stâng a primit 50 Ilfov de soluție salină. La o oră după injectare, edemul a fost evaluat și exprimat ca procent de creștere a greutății tamponului piciorului drept comparativ cu cel din stânga. Efectul inhibitor al derivaților de triazol a fost investigat prin incubarea compușilor cu venin de L. muta sau B. jararaca timp de 30 de minute la temperatura camerei și apoi amestecul a fost injectat la șoareci (tamponul piciorului drept) și s-a măsurat edemul.

3.6. Analiza statistică

rezultatele sunt exprimate ca mijloace sem la numărul de animale indicat sau experimente efectuate. Semnificația statistică a diferențelor dintre grupurile experimentale a fost evaluată folosind testul elevului. O valoare de 0,05 a fost considerată semnificativă.

4. Rezultate și discuții

dezvoltarea unor antivenomuri eficiente, sigure, mai ieftine și mai accesibile merită atenție, deoarece mușcăturile de șarpe pot provoca dizabilități severe și pot ucide și mii de oameni. Un număr tot mai mare de studii s-au concentrat pe căutarea inhibitorilor veninurilor de șarpe dintr-o varietate de surse, fie ele naturale sau sintetice . Suramina și benzoil fenil benzoatul sunt molecule sintetice capabile să inhibe miotoxicitatea, coagularea și activitățile fosfolipazei A2 și hialuronidazei veninurilor de șarpe din diferite familii. Analogii lactonici au fost sintetizați și inhibați miotoxicitatea și activitățile inducătoare de edem și enzimatice induse de o fosfolipază A2 izolată de B. jararacussu . Pe de altă parte, principiile bioactive marine au atras atenția și datorită acțiunilor lor farmacologice larg răspândite .

în această lucrare, a fost evaluată capacitatea a șase esteri etilici ai acidului 1-arilsulfonilamino-5-metil-1h-triazol-4-carboxilic de a neutraliza unele activități in vitro (hemoliză, coagulare și proteoliză) și in vivo (hemoragie și inducerea edemului) cauzate de B. jararaca și L. veninurile muta, deoarece rezultatele anterioare au indicat că acești șase derivați au inhibat hemoliza indusă de veninul L. muta, dar cu potențe diferite . Din acest motiv, s-a considerat că ar merita să se investigheze acțiunile unor astfel de derivați asupra altor activități biologice importante legate de mușcăturile de șarpe, cum ar fi proteoliza, coagularea, hemoliza, hemoragia și edemul. S-a demonstrat că acești compuși au inhibat hemoliza cauzată de veninul de B. jararaca (50%/ml) și L. muta (15%/mL) (Figura 2). Procentul inhibitor al derivaților a fost de peste 50% împotriva ambelor veninuri. Cu toate acestea, o ușoară diferență asupra profilului inhibitor a fost observată pentru derivatul 6, Unde s-a obținut o inhibare de 50% și 90% a hemolizei pentru veninul B. jararaca și, respectiv, L. muta. Nici derivații, nici DMSO nu au condus eritrocitele la hemoliză și nici DMSO nu a intervenit în gradul de hemoliză cauzat de veninuri.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 2

efectul derivaților asupra hemolizei și proteolizei. Derivații 1-6 (45 MMC) au fost incubați cu B. jararaca (coloane întunecate) sau cu L. muta (coloane punctate) timp de 30 de minute la temperatura camerei, apoi s-au efectuat activități hemolitice (a) și proteolitice (b). Datele sunt exprimate ca medie sem la suta din experimentele individuale ().

Envenomarea prin aceste mușcături de șarpe produce hemoragie severă datorită conținutului ridicat de metaloprotează dependentă de zinc sau serină protează care digeră componentele proteice ale matricei extracelulare sau consumă factori de coagulare a sângelui . B. jararaca și L. muta venom a hidrolizat azocaseina într-o manieră dependentă de concentrație, cu un EC de 20%/ml și, respectiv, 6%/mL (datele nu sunt prezentate). Derivații au inhibat proteoliza indusă de B. jararaca sau L. muta (figura 2 (b)). Derivații 1, 2, 3 și 6 au inhibat proteoliza indusă de ambele veninuri până la 80%, iar derivatul 5 a inhibat o astfel de activitate Sub 50%. O diferență semnificativă asupra profilului inhibitor al derivaților a fost observată pentru derivatul 4, în care a inhibat 97% și 25% proteoliza indusă de veninul B. jararaca sau, respectiv, L. muta (figura 2(b)).

așa cum se vede în Figura 3, derivații 1, 2, 4, 5 și 6, dar nu și derivatul 3 inhibat într-o manieră dependentă de concentrație (23-94 MMC), coagularea fibrinogenului indusă de veninurile lui B. jararaca (40 mmcg/mL) sau L. muta (10 mmcg/mL). Se pare că derivații au inhibat mai eficient coagularea inducătoare de L. muta decât B. jararaca. La cea mai mare concentrație (94 MMC), derivații 1, 2, 3, 5 și 6 au împiedicat coagularea L. muta (figura 3(b)), în timp ce derivații 2 și 6 au împiedicat B. jararaca o dată (Figura 3(b)). La concentrații de până la 200 MMC, toți derivații de 1,2,3-triazol au prevenit efectiv coagularea fibrinogenului cauzată de ambele veninuri, dar la concentrații sub 10 MMC, niciunul dintre acești compuși nu a împiedicat coagularea. Cu toate acestea, atunci când derivații (10 MMC) au fost puși împreună și incubați fie cu venin de B. jararaca, fie cu venin de L. muta, timpul de coagulare a fost întârziat de două ori. S-a observat că, dacă derivatul 2 sau 6 a fost eliminat din amestec, nu s-a observat efect inhibitor asupra coagulării. Mai mult, derivații au împiedicat, de asemenea, coagularea indusă de veninuri atunci când a fost utilizată plasma. Nici DMSO (1% v/v, concentrație finală), nici soluția salină nu au interferat cu procesele de coagulare.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 3

efectul derivaților asupra coagulării fibrinogenului. Douăzeci și trei de derivați (coloane gri), 46 (coloane albe) sau 94 (coloane negre) au fost incubați cu 40/ml B. jararaca (a) sau cu 10/ml L. muta (b) timp de 30 min la temperatura camerei. Apoi, amestecul a fost adăugat la fibrinogen (2 mg/mL) și timpul de coagulare a fost înregistrat. Veninurile au fost incubate cu soluție salină (C1); 1% V/V DMSO (C2); derivat 1 (coloana 1); derivat 2 (coloana 2); derivat 3 (coloana 3); derivat 4 (coloana 4); derivat 5 (coloana 5); și cu derivat 6 (coloana 6). # înseamnă că fibrinogenul nu s-a coagulat până la 600 de secunde de observație. Datele sunt exprimate ca medie sem la suta din experimentele individuale ().

injectarea intradermică a veninului B. jararaca (12 mg/Kg) sau L. muta (20 mg/Kg) a produs un halou de hemoragie de 20 mm la șoareci. Un astfel de halou reprezintă două MHD de veninuri. Când fiecare venin a fost amestecat cu derivați (90 MMC) și apoi injectat la șoareci, a fost observată o protecție completă împotriva hemoragiei (datele nu sunt prezentate). În schimb, rezultatele anterioare au arătat că serul antilachetic nu inhibă hemoragia indusă de veninul L. muta . Injectarea de DMSO, derivați sau soluție salină nu a produs hemoragie. Inducerea edemului este un alt efect important care urmează mușcăturii de șarpe . Figura 4 arată că edemul indus de 5 mg/Kg B. jararaca(Figura 4 (A)) sau 8 mg/Kg L. muta [figura 4 (b)] a fost semnificativ redusă de derivații (90 de metri cubi). Derivații triazolului 1, 2 și 4 au inhibat peste 80% edemul indus de B. jararaca, în timp ce derivații 3, 5 și 6 au inhibat în jur de 70% (Figura 4(a)). După cum s-a văzut, toți derivații au inhibat mai puțin activitatea edematogenă indusă de L. muta (figura 4(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 4

efectul derivaților asupra activității de inducere a edemelor. Derivații (90 MMC) au fost incubați cu 5 mg/Kg de B. jararaca (a) sau cu 8 mg / Kg L. muta (b) timp de 30 de minute la temperatura camerei, apoi s-a efectuat activitatea de inducere a edemului. Coloanele sunt derivate 1 plus venin (1); derivat 2 Plus venin (2); derivat 3 plus venin (3); derivat 4 Plus venin (4); derivat 5 plus venin (5) și derivat 6 Plus venin (6). Datele sunt exprimate ca medie sem la suta din experimentele individuale ().

în concluzie, derivații de esteri etilici ai acidului 1-arilsulfonilamino-5-metil-1h–triazol-4-carboxilic pot fi utili ca prototipuri pentru proiectarea de noi molecule pentru îmbunătățirea tratamentului actual utilizat pentru mușcăturile de șarpe B. jararaca și L. muta. Potența inhibitoare a acestor derivați poate varia sau poate fi îmbunătățită atunci când au fost puse împreună, acționând probabil sinergic. Astfel, o concentrație mai mică a acestora ar fi necesară pentru a ajunge la o neutralizare completă a efectelor biologice cauzate de veninurile B. jararaca și L. muta. Mai mult, analiza anterioară a relației structură-activitate a derivatelor a fost deja efectuată . Derivații au fost supuși analizei „regulii de cinci a lui Lipinski” care indică faptul că o moleculă chimică ar putea fi un medicament activ pe cale orală la om și o astfel de regulă afirmă că o moleculă care încalcă oricare două dintre următoarele reguli este probabil să fie slab absorbită: (1) Greutate moleculară mai mică de 500 Da, (2) numărul donatorilor de legături de hidrogen (grupări OH sau NH) egal sau mai mic de 5, (3) numărul acceptorilor de legături de hidrogen mai mic de 10 și, în final, (4) calculat mai puțin de 5 . Rezultatele au arătat că toți derivații au îndeplinit această regulă (greutate moleculară = 296.31–341.30; 2.6–3.4; nHBA = 8-11 și nHBD = 1-3) indicând o bună biodisponibilitate teoretică .

mulțumiri

această lucrare a fost susținută de Fundația Internațională pentru știință (IFS Grant F/4571-1) și de următoarele agenții de finanțare braziliene: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico( CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa face Estado do Rio de Janeiro Carlos Chagas Filho (Faperj), Coordinação de Aperfeiçoamento de Personalul de Nível Superior (capes), și Universidade Federal Fluminense/pró-recitoria de Pesquisa e Pós-graduação e Inovação (Uff/PROPPi).