structura cristalină a unei dihidrofolat reductaze legate de tetrahidrofolat relevă originea eliberării lente a produsului

izolarea prin cristalizarea complexului DHFR endogen (6s)-5,6,7,8-tetrahidrofolat legat de E. coli

structura complexul binar edhfr:FH4 a fost determinat prin înlocuirea moleculară utilizând complexul ternar închis edhfr:folat:NADP+ (Id PDB: 7dfr)50. Așa cum se arată în Fig. 2, densitatea clară a electronilor confirmă ligandul endogen Co-purificat ca FH4 bazat pe geometria tetraedrică a sp3 C6 în concordanță cu un stereoizomer 6s. Acest lucru este în contrast cu geometria plană trigonală a sp2 C6 într-un complex binar FH2 obținut din condiții similare de cristalizare.

Compararea structurilor ligand ale edhfr:FH4 (verde, figura de sus) și eDHFR: FH2 (portocaliu, figura de jos) complexe. Hărțile de densitate electronică omit Fo-Fc conturate în jurul liganzilor sunt prezentate la nivelul 3.0 la sută. Punctele de vedere din dreapta sunt rotite 90 în sens invers acelor de ceasornic în jurul axei verticale din perspectivele prezentate în stânga. FH4 și FH2 sunt afișate ca bastoane. Atomul de carbon C6 este colorat în magenta, iar diferitele sale stări de hibridizare în FH4 și FH2 sunt indicate prin săgeți indicatoare magenta. Toți ceilalți atomi sunt colorați după cum urmează: oxigen în roșu, azot în albastru, carbon în verde și portocaliu pentru FH4 și, respectiv, FH2. Numai atomii non-hidrogen sunt arătați pentru simplitatea vizualizării

într-un efort de a înțelege de ce obținem complexul FH4, în timp ce alții au eșuat, am identificat că originea celor două complexe ligand diferite (FH4 vs.FH2) este momentul recoltării cristalelor și, prin urmare, durata creșterii cristalelor. Un studiu de curs de timp prezentat în Fig. 3 care urmează modificărilor densităților electronice ale ligandului legat la diferite zile de creștere a cristalului a arătat că descompunerea FH4 la FH2 (reflectată în tranziția sp3 la sp2 în poziția C6) a avut loc la aproximativ 2-3 zile după configurarea cristalizării.

vizualizările Stereo ale cursului de timp al Fo-Fc omit modificările hărții densității electronice corespunzătoare conversiei FH4 în FH2. Hărțile de densitate electronică omit Fo-Fc conturate în jurul liganzilor sunt prezentate la nivelul 3.0 la sută. EDHFR:Cristalele complexe binare FH4 au fost cultivate în întuneric la temperatura camerei. În fiecare moment, un singur cristal dintr-o picătură independentă de cristal a fost recoltat prin înghețarea blițului pentru difracția cu raze X. Structurile ligand ale FH4 și FH2 ale structurilor complexe binare complet rafinate la 2 și, respectiv, 14 zile, sunt prezentate în fiecare figură ca referințe pentru a compara cu schimbarea densităților electronilor. Hărțile omite pentru cristalele recoltate la 3 și 6 zile au fost generate după rafinarea structurală inițială fără a introduce liganzi sau solvenți. Suprapunerea structurilor proteice a fost realizată folosind PyMOL69

aceasta este prima dată când știm că un complex autentic DHFR cu un singur domeniu legat de FH4 a fost izolat. Am validat protocolul de reproducere a cristalizării complexului eDHFR: FH4 și am confirmat cursul de timp al degradării FH4 până la FH2 prin cel puțin două replici independente la fiecare punct de recoltare a cristalelor (Fig suplimentar. 1). Densitățile electronice intermediare de-a lungul cursului de timp al dezintegrării ligandului afișează clar tranziția sp3 la sp2 în poziția C6 și rotația concomitentă a inelului benzoil al ligandului legat (Fig. 3). Acest lucru poate semăna cu starea de tranziție Conformație ligand în direcția catalitică înainte. Degradarea observată de la FH4 la FH2 în timpul creșterii cristalelor nu reflectă probabil cataliza inversă prin DHFR care implică conversia FH4 în FH2. De asemenea, probabil că nu este indusă de lumină, având în vedere că picăturile de cristalizare au fost incubate la temperatura camerei în întuneric în timpul creșterii cristalelor, iar cursul de timp al degradării FH4 până la FH2 este de ordinul zilelor. De asemenea, am testat co-cristalizarea cu agenții reducători ditiotreitol (DTT) sau Tris(2-carboxietil)fosfină (TCEP) la o concentrație de 2-3 mM, precum și introducerea DTT sau TCEP timp de până la 20 de minute de înmuiere a cristalelor înainte de recoltare la 2 zile, 3 zile, 14 zile până la 7,5 luni. Din nou, aceste proceduri nu au afectat reproductibilitatea modificărilor densității electronilor ligandului calitativ pe parcursul timpului de dezintegrare al complexului eDHFR:FH4 în forma cristalină identificată în acest studiu (suplimentar Fig. 1). Astfel, este probabil ca actualul protocol de cristalizare să cristalizeze preferențial complexul endogen FH4 Co-purificat în probele de proteine eDHFR, iar descompunerea sa în cristal este ireversibilă în condițiile testate, probabil datorită oxidării la un nivel finit de oxigen. Deși reacția catalitică rapidă înainte de a produce FH4 din FH2 este favorizată termodinamic în prezența cantității excesive de NADPH ca in vivo, decăderea lentă a complexului FH4 înapoi la un complex FH2 poate avea loc fără o aprovizionare continuă de NADPH așa cum am observat aici în starea de cristalizare in vitro. Astfel, misterul motivului pentru care complexul FH4 urmărit de mult timp a fost dificil de obținut este dezvăluit a fi instabilitatea sa intrinsecă. Este foarte probabil cheia succesului nostru de a obține structura complexă FH4 labilă din punct de vedere chimic este recoltarea în timp util a cristalelor de difractare a puțului în decurs de 2 zile de creștere în condițiile de cristalizare identificate aici. În plus, un studiu al câmpului DHFR indică faptul că multe cristalografie19,20,24,28,29,32,43,45,47,48,50,51,52 și NMR12,13,15,17,19,25,26 studiile DHFR au aplicat dializă pentru a elimina liganzii endogeni înainte de introducerea liganzilor exogeni de interes. Am identificat o condiție de cristalizare care izolează complexul DHFR endogen legat de FH4 fără dializa probei de proteine sau introducerea de substraturi sau produse suplimentare. Postulăm că starea actuală de cristalizare pentru complexul eDHFR:FH4 favorizează forma legată de FH4 față de alte forme, cum ar fi complexul ternar eDHFR:FH2:NADP(H).

caracterizarea structurală a edhfr:complexul FH4

complexul FH4 adoptă o conformație ocluzată în eDHFR (vezi Fig. 4 și 5). Acest lucru este în concordanță cu constatările anterioare care sugerează că toate complexele binare și ternare FH4 ale ciclului catalitic (transfer post hidrură și conversie sp2 la sp3 la C6) apar în conformații ocluzate. Acest lucru se datorează ciocnirii sterice a inelului pterin înclinat al FH4 cu inelul nicotinamidic al NADP(H), care ar apărea în conformația închisă a buclei Met20 (Fig. 5)12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,35,36,37,38. Așa cum este indicat în Fig. 4, FH4 are contacte van der Waals și interacțiuni polare favorabile cu reziduurile și apele active ale sitului. În particular, două punți de sare bidentate cu Asp27 și Arg57 ancorează cele două capete ale FH4, aminopirimidinei (N3 și exociclic-NH2) și, respectiv, ale carboxilatului de la oxiclic, în poziții aproape identice ca în complexele substrat/analog12,20,24,45.

structura activă a site-ului complexului eDHFR:FH4 prezentată în vizualizări stereo. a lanțuri laterale (cyan) în termen de 4 centimetri de FH4 (verde) și bucla Met20 (galben) sunt prezentate ca bastoane. Structurile secundare sunt afișate ca desene animate în gri, iar apele se află la 3,5 centimi de FH4 ca sfere. Interacțiunile polare cu FH4 sunt indicate cu linii punctate. Harta densității electronilor fo-Fc care omite FH4 este afișată la un nivel de 3,5 centimetri în roșu, iar harta omitere 2FO-Fc la un nivel de 1,0 centimetri este afișată în albastru pentru reziduuri și ape. Cele trei conformatoare ale legăturilor amidice Ile14-Gly15 sunt indicate printr-un cerc punctat și săgeți roșii. b o vedere extinsă a legăturii Ile14-Gly15

suprapunerea complexului FH4 cu complexe analogice FH2 și FH4. Complexele actuale FH4, FH2 și edhfr raportate și complexul raportat 5-formil-FH4 împreună cu conformațiile lor de buclă met20 ocluse, reziduurile Phe31 și liganzii corespunzători sunt colorate în verde, magenta și, respectiv, galben. Toate celelalte structuri din ID-urile PDB: 1DYJ (ddFH4)45, 5ccc (DDFH4:NADP+)12, 1rf7 (FH2)24, 4pdj (FH2:NADPH)20 și 4psy (folat:NADP+)20 sunt colorate în gri. Cercul punctat de culoare roșie indică interacțiunile propuse între grupurile phe31 și ligand benzoil care adoptă două orientări distincte în funcție de liganzii legați. FH4 și 5-formil-FH4 aparțin unui grup în contrast cu ddFH4, FH2 și folat, în timp ce lanțurile laterale Phe31 rămân în aproape aceeași poziție în toate structurile aliniate. Buclele Met20 sunt clasificate în trei stări conformaționale generale, închise, parțial închise și ocluzate. Numai conformațiile închise pot găzdui structural grupul nicotinamidă al cofactorului NADP(H) care intră în situl activ

există două molecule de apă care leagă bucla Met20 și FH4 printr-o rețea de legături de hidrogen care implică Gly15 (c = o)-wat1-FH4(N5) și Glu17(NH)-wat2-FH4(N10) (Fig. 4). Aceste interacțiuni sunt absente în complexele raportate anterior (6R) – 5,10-dideazatetrahidrofolat (ddFH4) 12,45 datorită înlocuirii N la C la pozițiile 5 și 10 din analog. Acest lucru ar putea determina diferența observată în conformația Met20 în analog comparativ cu complexul FH4 (Fig. 5). Singurele structuri disponibile în PDB care seamănă foarte mult cu conformația buclei Met20 din complexul FH4 sunt un complex 5-formil-FH4 (Fig. 5, ID PDB: 1JOM) 51 și două complexe inhibitoare alosterice edhfr-nanobody care vizează diferiți epitopi DHFR cu afinitate nanomolară (suplimentar Fig. 2, ID-uri PDB: 3K74 și 4eig)28,29. Complexul 5-formil-FH4 păstrează apa de legătură între Glu17(NH) și FH4 (N10) ca în complexul FH4, în ciuda diferitelor grupuri spațiale P61 și respectiv P212121. 5-formil-FH4, cunoscut și sub numele de acid folinic sau leucovorin, este un medicament „de salvare” aprobat de FDA pentru prevenirea efectelor nocive ale metotrexatului în timpul chimioterapiei53. Grupa carboxilică a FH4 prezintă o densitate mică a electronilor (Fig. 4), sugerând tulburare sau mai multă libertate de rotație a legăturii în jurul axei C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C decât în alte părți ale liganzilor.

în plus față de rețeaua de apă, am găsit originea structurală a interacțiunilor stabilizatoare în complexul FH4 și eliberarea lentă a produsului pe baza comparației structurale a complexelor binare curente FH4 și FH2 și a structurilor eDHFR raportate anterior. În primul rând, contactul van der Waals cu lanțul lateral Glu17 are ca rezultat o ecranare suplimentară a FH4 de solvent (Fig. 4) care este absent în substrat sau produs analog (6R)-5,10-dideazatetrahidrofolat complexe12,20,24,45. În al doilea rând, densitatea clară a electronilor a trei conformații alternative ale coloanei vertebrale a legăturii amidice ile14-Gly15 conservate sugerează o contribuție entropică la stabilitatea complexului FH4 din flexibilitatea locală la ancora de buclă Met20 (Fig. 4). În special, studiile anterioare de mutageneză au arătat că Ile14 este crucial pentru a controla flexibilitatea buclei Met20, în timp ce variantele I14V, I14A și I14G au arătat toate o rată de transfer mai lentă a hidrurii, o flexibilitate mai mare a buclei Met20, așa cum se observă într-o conformație deschisă în structurile cristaline, o dependență crescută de temperatură a efectului izotopului cinetic primar și o energie de activare a stării de tranziție mai mare calculată din simulările hibride QM/MM23, 40. În al treilea rând, rotația inelului benzoil duce la interacțiuni favorabile electrostatic edge-to-face–uri cu Phe31 conservat în complexul FH4, spre deosebire de interacțiunile repulsive proton-aproape-proton (edge-to-edge) în complexele FH2, folat și ddFH4, indiferent de legarea NADP(h) (Fig. 5, vedere extinsă, Fig. 6)54,55. Implicația funcțională a acestei modificări structurale este susținută și de observarea rotației concomitente a inelului benzoil și a tranziției sp3 la sp2 în poziția C6 a ligandului legat în timpul cursului de dezintegrare FH4 la FH2 în complex (Fig. 3). Rolul Phe31 în controlul eliberării produsului este coroborat în continuare de studiile anterioare de mutageneză56, care au demonstrat că variantele f31v și F31Y ale eDHFR au prezentat o creștere de două ori a ratei constante la starea de echilibru kcat și o creștere estimată de 20 până la 50 de ori a ratei de eliberare a produsului în plus față de efectul mutațiilor asupra încetinirii transferului de hidrură.

interactiuni electrostatice ale sistemelor de la sectiunea de la sectiunea de la. Consultați refs 54,55 pentru detalii

având în vedere proprietățile dinamice ale sistemului DHFR special E. coli, complexul edhfr:FH4 ocluzat stabil (un intermediar cu energie liberă redusă pe peisajul său dinamic) observat aici poate sta la baza în mod rezonabil cinetica lentă a eliberării produsului (rata koff a disocierii FH4, etapa de limitare a vitezei ciclului catalitic eDHFR). Conform studiilor anterioare de dispersie a relaxării RMN, fiecare etapă a ciclului catalitic al E. coli DHFR urmează o „selecție de conformație” mai degrabă decât un mecanism de „potrivire indusă” 15. În consecință, viteza microscopică a fiecărei etape de-a lungul coordonatei de reacție depinde de rata de eșantionare conformațională a enzimei15 (de exemplu, starea de tranziție competentă pentru transferul rapid de hidrură sau eliberarea produsului care limitează viteza). Aceasta implică faptul că, cu cât starea de bază este mai stabilă și cu cât este mai diferită de substatul excitat, cu atât este mai mare costul energiei gratuite necesare pentru a proba astfel de conformații. Pentru eDHFR, aceasta va implica în mod necesar reorganizarea site-ului activ și a buclei flexibile Met20. S-a propus în studiile de dispersie de relaxare RMN ale eDHFR15 că starea excitată subpopulată pentru etapa chimică de transfer de hidrură adoptă o conformație ocluzată (a cărei stare fundamentală Complexul Michaelis se află într-o conformație închisă). Cu toate acestea, starea excitată subpopulată pentru etapa de eliberare a produsului adoptă o conformație închisă (a cărei stare de bază complexul FH4 este într-o conformație ocluzată). De-a lungul coordonatei de reacție, complexul binar edhfr:FH4 observat în prezent se află între complexele intermediare eDHFR:FH4:NADP+ și eDHFR:FH4:NADPH (Fig. 1). Ambele adoptă conformații ocluse, unde partea nicotinamidă a cofactorului se îndepărtează de locul activ15. Pentru a proba „substatul excitat închis” în timpul etapei de eliberare a produsului care limitează rata 15, trebuie să aibă loc reorganizarea activă a site-ului din starea de bază ocluzată. Aceasta este reprezentată de intermediarul catalitic stabil eDHFR:FH4 capturat în acest studiu. Rata de disociere a produsului koff de FH4 a fost crescută la legarea cofactorului cu o creștere de două ori pentru eDHFR: FH4: NADP + comparativ cu eDHFR: FH4 și o creștere de opt ori pentru eDHFR: FH4: NADPH comparativ cu eDHFR:FH4 măsurat atât la pH 6, cât și la pH 9 prin experimente de concurență35. Aceasta indică eliberarea accelerată a produsului și creșterea ratelor de eșantionare conformaționale atunci când un cofactor este legat. Deși o structură autentică a stării fundamentale a complexului ternar eDHFR:FH4:NADPH nu a fost niciodată raportată până acum, presupunem că poate exista o asemănare apreciabilă cu complexul binar eDHFR:FH4, deoarece toate stările intermediare terestre legate de FH4 adoptă o conformare ocluzată15. Cu toate acestea, ne așteptăm ca legarea cofactorului să crească populația substatelor excitate, propusă anterior pe baza studiilor de dispersie a relaxării RMN pentru a fi într-o conformitate închisă15. În concordanță cu aceasta, am observat că într-un complex ternar al structurii eDHFR:FH2:NADP(H) (determinată și în studiul nostru în condiții de cristalizare separate), bucla Met20 a devenit dezordonată. Acest lucru sugerează un mecanism general de cofactor a facilitat schimbul de ligand prin creșterea ratei de eșantionare conformațională atunci când cofactorul este legat cu partea sa de nicotinamidă îndreptată departe de situl activ.

în complexul FH4, distanța dintre inelul de benzoil FH4 (C1 la sută) și Phe31 la sută (Cz) este de 4,93 la sută, care este semnificativ mai mică cu (~0,3–0,6 la sută) decât distanțele corespunzătoare în complexele actuale FH2 și FH2 raportate anterior (ID PDB: 1RF7, 4pdj)20,24, care sunt 5,22, 5,55 și, respectiv, 5,32 la sută. O tendință similară de scurtare a distanței de-a lungul coordonatei de reacție a eDHFR a fost subliniată în două studii de calcul independente. Un studiu QM / MM a calculat că distanța corespunzătoare este scurtată cu ~0,3 centimi de la Complexul Michaelis la starea de tranziție pe măsură ce apare reacția de transfer de hidrură și că există o diferență mică în această distanță (~0,01 centimi) între starea de tranziție și produsul de reacție27. Un alt studiu care a utilizat dinamica moleculară cuantică/clasică mixtă a sugerat o scurtare mai dramatică a distanței corespunzătoare cu ~1 Ecuator pe măsură ce reacția evoluează de la reactant la starea de tranziție18. Prin urmare, observațiile noastre cristalografice sunt în general de acord cu modelarea computațională anterioară sugerând că, într-o anumită măsură, complexul FH4 păstrează natura fizică a stării de tranziție. Acest lucru este, de asemenea, în concordanță cu observațiile anterioare privind peisajul energetic dinamic al eDHFR cartografiat de dispersia de relaxare RMN că fiecare intermediar din ciclul catalitic eșantionează stări excitate joase ale căror conformații seamănă cu structurile de stare de bază ale intermediarilor precedenți sau ulteriori15. Deoarece enzimele stabilizează starea de tranziție, eliberarea lentă a produsului familiei DHFR ar putea fi atribuită reportării naturii fizice a stării de tranziție la complexul produsului de reacție. Acest lucru este sugerat din complexul FH4 urmărit de mult timp determinat aici, pe lângă modificările conformaționale specifice speciilor necesare în timpul ciclului catalitic32.

Caracterizarea unui complex ocluzat de eDHFR cu afinitate de legare nanomolară inhibitor cu debut lent

cristalografia cu raze X arată că complexul eDHFR cu inhibitor strâns cu debut lent AMPQD46 afișează, de asemenea, conformația ocluzată. Bucla Met20 a adoptat o conformație în complexul AMPQD care seamănă cu cea a complexului ternar cu o fenformină biguanidă antidiabetică și NADP +(ID PDB: 5UIH) 52. Pe de altă parte,agentul chimioterapeutic aprobat de FDA metotrexat a fost demonstrat anterior prin cristalografie cu raze X24, 47, nmr48 și cinetică cu o singură moleculă49 pentru a se lega în conformația DHFR închisă (Fig. 7). Această discrepanță în conformațiile proteice a fost neașteptată, deoarece toți cei trei inhibitori au o caracteristică structurală comună: grupul biguanidic al fenforminei, grupul diaminopirimidină al AMPQD și grupul diaminopterină al metotrexatului, fiecare conectat la o grupare fenil cu un linker flexibil. Cu toate acestea, o examinare atentă a suprapunerii structurale a complexelor inhibitoare eDHFR corespunzătoare (Fig. 7) a arătat că grupul de legătură metilamino al metotrexatului (absent în fenformin și AMPQD) a ocupat o poziție care ar duce la o potențială ciocnire sterică cu bucla Met20 dacă ar adopta o conformație ocluzată ca în complexele fenformin și AMPQD. Am demonstrat anterior că AMPQD a prezentat o preferință relativ mai mare (o scădere de trei ori a IC-50 și Ki) pentru inhibarea eDHFR față de DHFR46 uman. O specie chiar mai mare-specificitate pentru E. coli peste DHFR uman (~de 30 de ori) este observat pentru compusul părinte al AMPQD, căruia îi lipsește grupul de coadă aminofenil și linkerul de metilen46. Structura cristalină actuală a complexului ocluzat al eDHFR cu AMPQD oferă o explicație mecanicistă plauzibilă pentru specificitatea speciei sale, atribuibilă diferențelor în echilibrele conformaționale ale dhfr uman vs.eDHFR. Primul este observat exclusiv în conformații închise, în timp ce acesta din urmă prezintă o flexibilitate conformațională mai mare eșantionare atât în conformații închise, cât și ocluzate, așa cum s-a discutat în continuare.

structura eDHFR: complexul inhibitor AMPQD. o vizualizare Stereo a interacțiunilor active ale site-ului cu AMPQD cu harta omiteți Fo–Fc la un nivel de 3,5 centimi. Lanțurile laterale proteice (cyan) în limita a 4 centimetri de AMPQD (verde) sunt prezentate sub formă de bastoane, inclusiv două reziduuri din bucla Met20 (galben). Interacțiunile polare sunt indicate cu linii punctate. B suprapunerea AMPQD (verde), fenformin (galben, PDB: 5UIH)52 și metotrexat complexe (gri prezentat ca bastoane subțiri de la PDB: 1ra3, 1dds)20,47. Buclele Met20 sunt prezentate ca desene animate și liganzi ca bastoane. Structurile chimice ale liganzilor sunt desenate deasupra. NADP (H) nu este afișat în niciuna dintre structuri pentru simplitatea vizualizării

Compararea conformațiilor DHFR pe baza grupării

o grupare a structurilor DHFR PDB folosind RMSD a atomilor de ca din coloana vertebrală a buclei Met20 ca metrică a distanței (Fig. 8 și suplimentare Fig. 3) indică faptul că DHFR uman adoptă exclusiv o conformație închisă (competentă catalitic pentru legarea NADPH), în timp ce eDHFR este mult mai flexibil atât cu conformațiile închise, cât și cu cele ocluzate. Conformațiile ocluzate sunt mai puțin observate (17%) în structurile eDHFR. Atât complexul de eliberare a produsului care limitează viteza cu FH4, cât și complexul inhibitor cu debut lent cu AMPQD adoptă o conformație ocluzată a eDHFR (Fig. 9) care este rar reprezentată în PPB (Fig suplimentar. 3). Interesant este că atât FH4,cât și AMPQD împărtășesc caracteristicile afinității nanomolare și eliberarea lentă din eDHFR35,36, 46 cu poziția atomilor cheie de azot pe heterocicluri puternic conservate și diferențele evidente în cozi. Acest lucru sugerează o nouă strategie pentru dezvoltarea inhibitorilor DHFR prin direcționarea conformațiilor edhfr ocluse. De asemenea, propunem o strategie de combatere a rezistenței la medicamente. Așa cum se arată în Fig suplimentar. 4, la compararea conformației AMPQD cu FH4 și trimetoprim cu FH4, există diferențe subtile în plicurile van der Waals. Variantele de evacuare trimetoprim eDHFR ale E. coli DHFR posedă mutații care blochează și funcția inhibitoare a AMPQD57. Studiind diferențele de interacțiuni, se pot căuta alți liganzi care minimizează aceste diferențe de interacțiune cu FH2 și FH4. Acest lucru ar putea asigura că mutațiile, care diminuează legarea inhibitorilor, vor diminua, de asemenea, afinitatea de legare a FH2 și FH4.

gruparea a 162 de structuri DHFR pe baza lor ca RMSD pereche a buclelor Met20. Structurile DHFR sunt reprezentate de cercuri umplute cu albastru (oameni), Verde (eDHFR) și roșu (în acest studiu). Lungimea muchiei (colorată în violet pentru conformațiile ocluzate și respectiv aurii pentru conformațiile închise) este proporțională cu RMSD maxim al conformatorilor de buclă Met20. Vă rugăm să consultați o diagramă de grupare mai detaliată în informațiile suplimentare

suprapunerea complexelor AMPQD (verde) și FH4 (galben). Buclele Met20 sunt prezentate ca desene animate și liganzi ca bastoane. Vederea din dreapta este rotită în sensul acelor de ceasornic cu 90% în jurul axei verticale din perspectiva prezentată în stânga

Caracterizarea unui complex ternar de eDHFR

în cele din urmă, într-un eDHFR: FH2:Complex ternar NADP (H) cu ligand endogen co-purificat și cofactori (Fig. 10), am constatat că bucla Met20 devine dezordonată. Aceasta susține rolul legării cofactorului în îmbunătățirea eșantionării conformaționale pentru schimbul rapid de ligand sau facilitarea eliberării produsului printr-un mecanism alosteric (ts. 1)12,13,14,15. Partea de nicotinamidă riboză se îndepărtează de situsul activ (Fig. 10) similar cu complexul ternar ocluzat FH412. Starea sa redox este necunoscută pe baza densității electronilor. Capacitatea de a izola diferite complexe eDHFR legate de ligand endogen, binar și ternar în diferite condiții de cristalizare sugerează că eDHFR conține un amestec de specii moleculare cu liganzi legați diferiți și un ansamblu de conformații. Eficacitatea abordării cristalografice aplicate aici profită de neomogenitatea moleculară prin omiterea etapei de dializă pentru a izola o structură cristalină complexă FH4 de lungă durată și labilă chimic. Acest lucru se opune procesului tipic care implică pretratarea probelor DHFR prin dializă, care elimină urme liganzi endogeni și crește omogenitatea probei. Omogenitatea îmbunătățită îmbunătățește, în general, rata generală de succes a experimentelor de co-cristalizare sau înmuiere a cristalelor, atunci când liganzii de interes sunt introduși exogen.

vederi Stereo ale complexului ternar DHFR: FH2: NADP(H). Bucla met20 dezordonată (reziduuri între Ile14 și Pro21) este indicată ca linii punctate negre. Harta omitere Fo-Fc la un nivel de 3,0 centimetrii este afișată sub formă de plasă roșie. Structurile secundare sunt prezentate ca desene animate și liganzi într-o reprezentare a bățului. Atomii sunt colorați după cum urmează: carbon (alb), azot (albastru), oxigen (roșu) și fosfor (portocaliu)