reglerande effekt av Melatonin på Cytokinstörningar i Pristaninducerade Lupusmöss

Abstrakt

systemisk lupus erythematosus (SLE) utvecklas i förhållande till många miljöfaktorer. Enligt vår mening är det viktigare att undersöka effekten av melatonin på den miljörelaterade SLE. I den aktuella studien användes 0,5 ml Pristan för att inducera SLE hos kvinnliga BALB/c-möss. Melatonin (0,01, 0,1, 1,0 mg/kg) administrerades oralt omedelbart efter pristane-injektion i 24 veckor. IgM anti ssDNA och histonantikroppar detekterades efter 0, 1, 2, 4, 8 veckors pristaninjektion. Nivåerna av IL-2, IL-6 och IL-13 detekterades efter 24 veckor. Njurskador observerades också. Resultaten visade att melatonin antagoniserade de ökande nivåerna av IgM anti ssDNA och histon autoantikroppar. Melatonin kan också minska IL-6-och IL-13-produktionen och öka IL-2-produktionen. Dessutom kan melatonin minska njurskadorna orsakade av pristane. Dessa resultat antydde att melatonin har en fördelaktig effekt på pristaninducerad lupus genom att reglera cytokinstörningarna.

1. Inledning

systemisk lupus erythematosus (SLE eller Lupus) är en autoimmun sjukdom som kan attackera kroppens normala vävnad och celler, vilket resulterar i inflammation och vävnadsskada . SLE förekommer i alla åldrar och i alla kön. Kvinnor är dock mer benägna att ha SLE än män . Dessutom har störningar i cytokinnätverket också rapporterats i SLE, inklusive IL-1, IL-2, IL-6, IL-13 och IFN -. Dessa cytokiner har nära relationer till utvecklingen av SLE, såsom autoantikroppsproduktion och immunkomplex nefrit. Men det finns några motsägelsefulla resultat om förändringarna av vissa cytokiner i olika rapporter.

under de senaste åren har mer och mer uppmärksamhet ägnats åt miljöfaktorer som kan vara inblandade i patogenesen av SLE . Autoimmuna sjukdomar blir allt vanligare i industriländer, och dessa sjukdomar kan påverkas av miljöfaktorer . Pristane är en sannolik kandidat som en miljöutlösare av SLE i mottaglig population. Djurförsök visade att pristane kunde inducera lupusliknande autoimmuna sjukdomssymptom i en stam av möss (BALB/c), såsom höga nivåer av autoantikroppar och immunkomplex glomerulonefrit . Vissa epidemiologiska undersökningar visade också att alla personer med Pristan i blodet hade distinkta autoimmuna sjukdomar eller symtom på autoimmun sjukdom . Dessutom verkar Pristan som finns i mineralolja, hajolja och många livsmedel vara en möjlig miljöexponering som kan utlösa SLE. Så det kan vara mer lämpligt att undersöka miljöfaktorer som är involverade i SLE genom att använda pristaninducerad SLE-liknande murinmodell.

Melatonin syntetiseras och utsöndras huvudsakligen av tallkottkörteln som kan göra specifika receptorer in och ut ur centrala nervsystemet. Melatonin kan inte bara direkt påverka inflammation och immunceller utan har också indirekta influenser på det genom thalamencephalon . Ännu viktigare är att melatonin betraktas som en viktig aktiv substans i det neuro-immun-endokrina systemet . Det kan reglera obalansen i cytokinnätverket i vissa autoimmuna sjukdomar såsom reumatoid artrit och adjuvant artrit . Vissa experiment undersökte dess effekter på MRL-lpr/lpr-Möss och visade att melatonin var fördelaktigt för spontan SLE hos honmöss . Eftersom miljön är en viktig faktor i SLE i det moderna samhället var vi mer intresserade av effekterna av melatonin på den miljörelaterade SLE.

för att undersöka melatoninets roll i SLE, särskilt i miljörelaterad lupus, användes pristaninducerade möss. Effekterna av melatonin på cytokinstörningarna och följande förändringar i pristaninducerad SLE-modell bestämdes också.

2. Material och metoder

2.1. Djur

sextio kvinnliga BALB / c-möss i åldern två månader (g) levererades av Experimental Animal Center vid Anhui Medical University. Alla experimentella protokoll som beskrivs i denna studie godkändes av Ethics Review Committee for Animal Experimentation of Institute of Clinical Pharmacology, Anhui Medical University.

2.2. Material

Melatonin köptes från Sigma. Pristan, värmedenaturerad kalv thymus DNA (ssDNA), Total kalv thymus Histon (Histon), concanavalin A (ConA) och lipopolysackarider (LPS) var också från Sigma. Biotin-konjugerade kanin-anti-mus IgM-antikroppar och pepparrotperoxidasmärkt avidin köptes från . Mus interleukin – 2 ELISA-kit och interleukin-6 ELISA-Kit köptes från ADL. Mus interleukin – 13 ELISA Kit köptes från BIOO.

2.3. Experimentella protokoll

sextio kvinnliga BALB / c-möss delades slumpmässigt in i sex grupper: normal kontrollgrupp, modellgrupp, prednisonbehandlingsgrupp som fungerade som positiv kontrollgrupp och melatonin (0,01, 0,1, 1,0 mg/kg) behandlingsgrupper inklusive melatonin grupp ett (MT1), melatonin grupp två (MT2) och melatonin grupp tre (MT3). Mössen i normal kontrollgrupp fick en intraperitoneal injektion av 0.5 ml normal saltlösning (NS) och de andra grupperna fick en intraperitoneal injektion av 0,5 ml Pristan. Mössen i normal kontrollgrupp och modellkontrollgrupp fick intragastrisk administrering av NS per dag efter den första behandlingen. Mössen i positiv kontrollgrupp fick intragastrisk administrering av 5 mg/kg prednison (Pre) per dag. Mössen i MT1-gruppen behandlades intragastriskt med 0,01 mg/kg melatonin, MT2 0,1 mg/kg melatonin och MT3 1,0 mg/kg melatonin. Sera samlades in från svansvenen före behandling (0) och 2, 4 och 8 veckor efter behandling för att mäta nivån av autoantikroppar. Tjugofyra veckor efter pristane-administrering dödades alla möss och mjältar avlägsnades för immunologiska detekteringar; under tiden undersöktes nefriska vävnader genom ljusmikroskopi.

2.4. Enzymbundna Immunosorbentanalyser (ELISAs) för anti-ssDNA-och Histonantikroppar

Anti-ssDNA-och histon-IgM-antikroppar detekterades med en ELISA-teknik som liknar den som beskrivs i . 96-brunns ELISA-plattor belagda med 10 mg/L ssDNA-eller histonantigener inkuberades över natten vid 4. Följande dag tvättades plattorna med PBS-Tween. Plattorna inkuberades med blockerande buffert (PBS-2% bovint serumalbumin) över natten vid 4 och tvättades med PBS-Tween. Efter inkubation över natten vid 4 med Murin serum utspätt till 1 : 250 tvättades plattorna igen och inkuberades sedan i 2 timmar vid 4 med biotin-konjugerade Kaninantimouse IgM-antikroppar utspädda till 1: 200. Därefter tvättades plattorna och inkuberades i 2 timmar vid 4 med pepparrotperoxidasmärkt avidin i 1 : 200 utspädning. Plattorna tvättades sedan igen och 100 Liter substrat —tetrametylbensidin (TMB) och väteperoxidlösning tillsattes till brunnarna i 30 minuter vid 37. Reaktionen avslutades genom tillsats av 50 L av 2 M H2SÅ4 per brunn. Intensiteten hos den gula färgen lästes vid 490 nm i en mikroplattläsare. Sera av andra åtta normala BALB / c-möss uppsamlades och detekterades samtidigt, och medeltätheten och SD beräknades för att fungera som kontroll. De genomsnittliga enzymindexen (ei) för proverna i olika grupper beräknades som:

2,5. Mjältcellsodling och induktion av cytokin

Mjältcellsodling och induktion av cytokiner var modifieringar av metoderna som beskrivs i . Kortfattat framställdes encelliga suspensioner från mjältar aseptiskt avlägsnade från möss och odlades i 24-brunnskulturplattor vid en slutlig koncentration av celler/ml. Cellerna odlades i RPMI – 1640 kompletterat med 10% fetalt kalvserum, 2 mM glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 50 m 2-merkaptoetanol och 10 ml penicillin, streptomycin och antimykotisk lösning/L (Sigma). Kulturer stimulerades med 3 mg/l ConA, 12 mg/L LPS, eller medium ensam och inkuberades vid 37 i fuktad luft med 5% CO2. Supernatanten skördades vid 48 h och bevarades vid 20 för cytokinanalyser.

2.6. Cytokinanalyser

koncentrationerna av interleukin – 2 (IL-2), interleukin-6 (IL-6) och interleukin-13 (IL-13) i supernatanten bestämdes med användning av lämpliga kommersiella ELISAs för den murina formen av dessa cytokiner. Intensiteten av varje tar prov avlästes på 450 nm i en microplate spectrophotometer.

2.7. Histopatologiska tekniker

njurarna som samlades medan de offrade möss fixades i 24 timmar i neutralt buffrat formalin före paraffininbäddning. Sektioner färgades med hematoxylin och Eosin och Jones silvermetenamin och undersöktes sedan under ett ljusmikroskop för svårighetsgraden av njurskadorna. Glomerulonefrit, renala tubulära lesioner och interstitiell inflammation observerades, och graden av svårighetsgrad av histologiska lesioner som är karakteristiska för lupusnefrit utvärderades som frånvarande (), mild (), måttlig () och svår ().

2.8. Statistisk analys

resultaten uttrycktes som SD. Statistisk analys utfördes med hjälp av studentens tvåvägs t-test med som minimal nivå av betydelse

3. Resultat

3.1. Effekter av Melatonin på nivåer av IgM Anti-ssDNA och histon antikroppar i Sera

nivåerna av IgM anti-ssDNA och histon antikroppar var signifikant olika mellan Pristan-injektion och melatonin behandlingsgrupper (, figurerna 1(A) och 1 (b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 1

sera hos möss i varje grupp samlades före behandling (0), 2, 4 och 8 veckor senare, och nivåer av IgM-anti-ssDNA-och Antihistonantikroppar detekterades av ELISA. EI beräknades enligt formeln. (a) nivån av IgM-anti-ssDNA-antikropp i varje grupp, (b) nivån av IgM-Antihistonantikropp i varje grupp. Data gavs i medelvärde för SD (n=6-8). P * <.05, P * * <.01 jämfört med sera vid 0 wk, 0398 p<.05, p<.01 kontra sera i modellkontrollmöss.

två veckor efter en enda intraperitoneal injektion av Pristan började nivån av anti-ssDNA IgM-antikroppar i sera öka uppenbarligen, nådde topp vid 4 wk, började sedan minska och slutligen återvände till normal vid 8 wk. I MT1-gruppen ökade nivån av anti-ssDNA IgM-antikroppar i sera också och nådde topp vid 4 wk, men minskade sedan tydligare jämfört med modellkontrollgruppen (). I MT2-gruppen ökade nivån av anti-ssDNA IgM-antikroppar i sera under de första fyra veckorna, men mycket lägre än modellgruppen () och förblev normal under andra perioder. I MT3-gruppen ökade inte nivån av anti-ssDNA IgM-antikroppar(Figur 1 (A)).

Antihistonantikroppar i sera ökade 1 vecka efter injektion, nådde topp vid 4 veckor, minskade sedan gradvis och återvände till normal vid 8 veckor. I MT1-gruppen var nivåerna av Antihistonantikroppar i sera signifikant lägre än för modellkontrollgruppen () och var tillbaka till normala vid 4 veckor. I MT2-och MT3-grupper ökade antikroppsnivåerna under de första fyra veckorna, men mycket lägre än modellgruppen () och förblev normala under de andra perioderna (Figur 1(b)).

3.2. Effekter av Melatonin på cytokiner produktion

för att få en bättre inblick i påverkan av melatonin på cytokiner i SLE, produktion av Th1-typ och Th2-typ cytokiner av splenocyter stimulerade med ConA eller LPS analyserades under loppet av murin lupus. Resultaten visade att produktionen av IL-2, IL-6 och IL-13 förändrades i pristaninducerade SLE-möss (Figur 2). IL-2-produktionen av splenocyter från möss i modellkontrollgruppen var lägre än den från normala möss (), medan IL-6 och IL-13-produktionen av splenocyter från möss i modellkontrollgruppen var högre än den från normala möss (). I MT2-och MT3-grupper var IL-2-nivåerna upp till normal nivå och högre än för modellmöss uppenbarligen (), medan IL-6-och IL-13-nivåerna var lägre än för modellmössen uppenbarligen (, ) (Figur 2).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figur 2

alla möss offrades i slutet av 24 veckor, och mjältlymfocyter såddes vid 1 msk 106 celler/brunn. IL-2-koncentrationer i mjältlymfocyter stimulerades i 48 timmar med 3 mg/L ConA. IL-6 och IL-13-koncentrationer i mjältlymfocyter stimulerades i 48 timmar med 12 mg/L LPS. IL-2, IL-6 och IL-13 koncentrationer i odlings supernatanter detekterades av ELISA. Data gavs i medelvärde för SD (n=4-5). P * * <.01, P * <.05 jämfört med Normal kontrollgrupp, avsugning p<.05, p<.01 kontra Modell kontrollgrupp.

3.3. Effekter av Melatonin på Njurhistopatologiska förändringar

de renala histopatologiska förändringarna hos mössen visas i Tabell 1 och figur 3.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figur 3

njurarna som samlades vid tidpunkten för offret färgades med H&E för histologisk undersökning. a) Normal kontrollgrupp (200). B)förlaga till kontrollgrupp (200). C)förlaga till kontrollgrupp (200 xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx). d) MT-gruppen (200).

som visas i Figur 3(a) sågs inte njuravvikelser hos normala möss. Volymen och cellantalet av glomeruli var normala. Glomerulär kapillärvägg var tunn. Ingen proteingjutning sågs i tubule. Lymfocytinfiltrering och proliferation av fibroblaster sågs inte i interstitiell renal.

som visas i figurerna 3(b) och 3(c) och Tabell 1, avslöjade de flesta pristaninjicerade möss njuravvikelser från milda till svåra mönster. Vissa glomeruli visade glomerulär atrofi med kapillärutvidgning och förtjockning av kapillärväggar. Vissa citerar avslöjade trombbildning. Mesangial breddning och ökande cellskikt observerades också. Glomerulär kapselvägg var tjock och utrymmet mellan kapselvägg och endotelceller försvann i allvarligt påverkad glomerulus. Vissa njurrör visade utvidgning och epitelcellerna proliferation. Proteingjutningar sågs i tubuli. En infiltration av inflammatoriska celler såsom monocyter, lymfocyter och plasmacyter med fokal aggregering sågs i renal interstitiell. Proliferationer av interstitiella fibroblaster observerades också.

det fanns vissa förbättringar av olika grader i melatoninbehandlade möss(Figur 3 (d) och Tabell 1). Glomerulär atrofi och förtjockning av kapillärväggar ändrades i mild eller måttlig grad. Mesangial breddning förbättrades också. Utrymmet mellan kapselvägg och endotelceller var mindre än hos normala möss men det var en förbättring jämfört med den icke-behandlade modellgruppen. Lätt lymfocytinfiltrering observerades också. Vissa njurrör visade mild utvidgning och några proteingjutningar. Ändå var alla förändringar mindre allvarliga än hos modellmöss.

4. Diskussion

i denna studie observerades immunstörningar hos pristanprimerade Möss och effekterna av melatonin. Eftersom anti-DNA och histonantikroppar var känsliga i SLE undersökte vi förändringarna av IgM-anti-ssDNA-och Antihistonantikroppar och fann höga nivåer av autoantikroppar i de pristaninjicerade mössen. Njurskador hittades också i mössen. Dessa resultat överensstämde med tidigare rapporter. Vi fann också att melatonin antagoniserade de ökande nivåerna av IgM anti-ssDNA och histon autoantikroppar, och melatonin kunde minska njurskadorna orsakade av pristane. Pristane är en peritoneal irriterande. Det är välkänt att IgM-klassen produceras av B1 (CD5+) B-cellundergruppen , och B1-undergruppen är mycket berikad i bukhålan och expanderas i BALB/c-möss , vilket ökar möjligheten att IgM-anti-ssDNA-och Antihistonantikroppar inducerade av IP pristane härrör från undergruppen. Tidigare studier rapporterade att melatonin hade effekter på det första antikroppsimmunsvaret (IgM, IgG) . Vissa studier visade att melatonin hade tvåvägsmodulering på lymfocyter . Så vi trodde att melatonin kunde förbättra SLE-symtomen genom att modulera överproduktionen av B-celler.

cytokiner nätverk spelar en viktig roll i utvecklingen av SLE. I vissa in vitro-experiment kan melatonin hämma immuneffekterna av vissa cytokiner och T-lymfocyter . Så vi observerade effekterna av melatonin på störningen av cytokiner nätverk. IL – 6 är tänkt som en inflammatorisk cytokin som utsöndras av en mängd olika vävnadsceller, inklusive makrofager och Th2-celler. IL – 6-nivån har positiv korrelation till aktivitetsindexet för SLE. Våra resultat visade att nivån av IL – 6 ökades efter pristaninjektion, medan melatonin kunde minska IL-6-produktionen. Den ökande nivån av IL – 6 kan orsaka att B-celler utsöndrar fler antikroppar och främjar utvecklingen av nefrit . Så nedreglering av IL – 6-produktion av melatonin är till hjälp för att hämma antikroppsproduktionen och njurskador.

IL-2 utsöndras av Th1-celler och IL-13 utsöndras av Th2-celler. Det finns några motsägelsefulla resultat i dokumenten om förändringarna av IL-2 och IL-13. Så i denna pristaninducerade SLE-modell undersökte vi nivåerna av de två cytokinerna. Våra resultat avslöjade att nivån av IL-2 i de pristaninjicerade mössen var lägre än hos de normala mössen, medan nivån av IL-13 i de pristaninjicerade mössen var högre än hos de normala mössen. Vi fann också att melatonin kunde minska IL-13-produktionen men ökade IL-2-produktionen. Många rapporter visade att nivån av IL-2 minskade i SLE, särskilt i det aktiva stadiet, och att IL-2 kunde nedreglera B-lymfocytaktiveringen . Vissa undersökningar visade att melatonin kunde reglera nivån av IL-2 / IL-2-receptorer , vilket kan vara mekanismen för den hämmande verkan av melatonin på IL-2-produktion. IL-13, en av de viktigaste cytokinerna i lupus, tros vara en b-cellaktiverande faktor som resulterade i överdriven produktion av många autoantikroppar . IL – 13 har relation till njurskadorna i SLE . Så nedreglering av IL-13-produktion av melatonin är också till hjälp för att hämma antikroppsproduktionen och njurskador.

den minskande nivån av Th1-typ cytokin och de ökande nivåerna av Th2-typ cytokin indikerade också att det fanns ett skifte från Th1 mot Th2 i orörd inducerad lupus. Vissa rapporter visade att exogen melatonin kunde aktivera T-cellerna och avsevärt främja Th1-typ cytokinerna, som deltar i att reglera immunstörningarna . Våra resultat visade att melatonin kunde uppreglera cytokinerna av Th1-typ och nedreglera cytokinerna av Th2-typ. Och det indikerade att melatonin kunde modulera störningen av cytokinnätverket i SLE-mössen genom att reglera obalansen i Th1/Th2.

prednison, som är ett vanligt läkemedel för SLE , tjänade som det positiva läkemedlet i denna studie. Vi fann att prednison hade en reglerande effekt på pristaninducerad SLE. Jämfört med prednison hade melatonin en liknande eller lite tidigare effekt på SLE-symtomen. Som vi har känt är biverkningarna av prednison vanligare och allvarligare än melatonin. Således trodde vi att melatonin kan vara ett potentiellt läkemedel för SLE.

Sammanfattningsvis visar pristaninducerad lupus störningar i immunsystemet, såsom hög nivå av autoantikroppar och obalans i cytokinnätverket, vilket inducerar den efterföljande nefriten. Förändringarna liknar den mänskliga lupusen, och pristane är vanligt i miljön; således är denna modell lämplig för att studera effekterna av melatonin på miljörelaterad SLE. Å andra sidan visade vi också att administreringen av melatonin hämmade förändringarna i pristaninducerad lupus. Och det föreslog melatonin hade en positiv effekt på miljörelaterad lupus. Mekanismerna kan involvera dess modulering av störningar i immunsystemet, särskilt i cytokiner nätverk. Ytterligare studier bör dock vara nödvändiga för en bättre förståelse av regleringsprocessen och nyckelfaktorn för dess verkan på autoimmuna sjukdomar.