krystalové struktury tetrahydrofolate-vázané dihydrofolátreduktázu odhaluje původ pomalé uvolnění produktu

Izolace krystalizací z endogenní (6s)-5,6,7,8-tetrahydrofolate-bound E. coli DHFR komplex

struktura eDHFR:FH4 binární komplex byl určen molekulární nahrazení pomocí eDHFR:kyselina listová:NADP+ uzavřené ternární komplex (PDB ID: 7DFR)50. Jak je znázorněno na obr. 2, jasné elektronové hustoty potvrzuje co-čistí endogenní ligand jako FH4 na základě čtyřboká geometrie sp3 C6 v souladu s 6s stereoizomer. To stojí na rozdíl od trigonální rovinné geometrie sp2 C6 v binárním komplexu FH2 získaném z podobných krystalizačních podmínek.

Srovnání ligand struktury eDHFR:FH4 (zelená, horní obrázek) a eDHFR:FH2 (oranžová, spodní obrázek) komplexy. Mapy elektronové hustoty fo-Fc opomíjené kolem ligandů jsou zobrazeny na úrovni 3,0 σ. Pohledy vpravo se otáčejí o 90° proti směru hodinových ručiček kolem svislé osy z perspektiv zobrazených vlevo. FH4 a FH2 jsou zobrazeny jako tyčinky. Na C6 atomu uhlíku je barevné v purpurové, a jeho různé hybridizace státy v FH4 a FH2, jsou označeny fialovou směřující šipky. Všechny ostatní atomy jsou zbarveny následovně: kyslík v červené barvě,dusík v modré barvě, uhlík v zelené barvě a oranžová pro FH4 a FH2. Pouze non-atomy vodíku jsou uvedeny pro jednoduchost prohlížení

Ve snaze pochopit, proč jsme se získat FH4 složité, vzhledem k tomu, že ostatní selhali, identifikovali jsme, že původ dva různé ligand komplexů (FH4 vs FH2) je načasování crystal sklizeň, a tedy dobu trvání růstu krystalů. Studie časového kurzu je znázorněno na obr. 3, která navazuje na změny elektronové hustoty vázaného ligandu v různých dnech růstu krystalů odhalila, že FH4 na FH2 rozkladu (jak je uvedeno v sp3 na sp2 přechod na C6 pozici), došlo přibližně 2-3 dny po krystalizaci nastavit.

Stereo výhled na časový průběh Fo–Fc vynechat elektronové hustoty mapa změny odpovídající konverze FH4 na FH2. Mapy elektronové hustoty fo-Fc opomíjené kolem ligandů jsou zobrazeny na úrovni 3,0 σ. Edhfr:FH4 binární komplexní krystaly byly pěstovány ve tmě při pokojové teplotě. V každém časovém bodě byl jeden krystal z nezávislé krystalové kapky sklizen bleskovým zmrazením pro rentgenovou difrakci. Ligandové struktury FH4 a FH2 plně rafinovaných binárních komplexních struktur za 2 a 14 dní jsou na každém obrázku znázorněny jako odkazy pro srovnání se změnou hustoty elektronů. Vynechané mapy pro krystaly sklizené ve 3 a 6 dnech byly generovány po počátečním strukturálním zjemnění bez zavedení ligandů nebo rozpouštědel. Superpozice proteinových struktur byla provedena pomocí PyMOL69

Toto je poprvé, kdy se naše znalosti, že autentický FH4-vázané single-domain DHFR komplex byl izolován. Máme ověřené protokol reprodukovat krystalizace eDHFR:FH4 složité, a potvrdila, časový průběh FH4 na FH2 rozkladu nejméně dvou nezávislých opakováních pro každý čas z crystal sklizeň (Doplňkový Obr. 1). Střední elektronové hustoty podél časový průběh ligand je kaz jasně zobrazit sp3 na sp2 přechod na C6 pozici a současné otáčení benzoyl kruh vázán ligand (Obr. 3). To se může podobat konformaci ligandů přechodového stavu v dopředném katalytickém směru. Pozorovaný rozpad FH4 na FH2 během růstu krystalů pravděpodobně neodráží reverzní katalýzu DHFR zahrnující konverzi FH4 na FH2. To je také pravděpodobně není vyvolané světlo, vzhledem k tomu, že krystalizační kapky byly inkubovány při pokojové teplotě v temnu při růstu krystalů, a časový průběh FH4 na FH2 rozpadu je v řádu dnů. Rovněž jsme testovali ko-krystalizace s redukční činidla dithiothreitolu (DTT) nebo Tris(2-carboxyethyl) – fosfin (TCEP) na 2-3 mM koncentraci, stejně jako zavedení dvb-t nebo TCEP pro až 20 min crystal namáčení před sklizní na 2 dny, 3 dny, 14 dní do 7,5 měsíců. Tyto postupy opět neovlivnily Reprodukovatelnost změn hustoty elektronů ligandu kvalitativně v průběhu doby rozpadu komplexu eDHFR: FH4 v krystalické formě identifikované v této studii (Doplňkový obr. 1). Tak, to je pravděpodobné, že současná krystalizace protokolu přednostně krystalizuje endogenní FH4 komplex co-čištěná v eDHFR protein vzorky, a jeho rozkladu v krystalu je nevratný za podmínek, které jsme testovali, pravděpodobně v důsledku oxidace na konečnou úroveň kyslíku. Ačkoli rychlý vpřed katalytické reakce produkující FH4 z FH2 je termodynamicky přednost v přítomnosti nadměrného množství NADPH jako in vivo, pomalý rozpad FH4 komplexu zpět do FH2 komplex může nastat bez pokračující přísun NADPH jako jsme pozorovali tu v rámci in vitro krystalizace stavu. Tím pádem, tajemství, proč bylo obtížné získat dlouho sledovaný komplex FH4, je odhaleno jako jeho vnitřní nestabilita. Je velmi pravděpodobné, že klíčem k našemu úspěchu získání chemicky labilní FH4 složitá struktura je včasné sklizni dobře difrakcí krystaly do 2 dnů růst pod krystalizace stavu zjištěna. Kromě toho, průzkum DHFR pole ukazuje, že mnoho crystallographic19,20,24,28,29,32,43,45,47,48,50,51,52 a NMR12,13,15,17,19,25,26 studie DHFR použita dialýza k odstranění endogenních ligandů před zavedením exogenní ligandy zájmu. Identifikovali jsme krystalizační stav, který izoluje endogenní komplex DHFR vázaný na FH4 bez dialýzy vzorku proteinu nebo zavedení dalších substrátů nebo produktů. Předpokládáme, že současná krystalizace podmínkou pro eDHFR:FH4 komplex podporuje FH4-vázané formě po jiných formách, jako je eDHFR:FH2:NADP(H) ternární komplex.

strukturální charakterizace komplexu eDHFR: FH4

komplex FH4 přijímá uzavřenou konformaci v eDHFR (viz obr. 4 a 5). To je v souladu s předchozími nálezy, které naznačují, že všechny pozemní stav FH4 binární a ternární komplexy z katalytického cyklu (post-hydridové přenos a sp2 na sp3 konverze na C6) se vyskytují v uzavřené konformace. To je vzhledem k stérické souboj nakloněné pterinu prsten FH4 s nikotinamid prsten NADP(H), což by mohlo dojít v zavřené konformace Met20 smyčky (Obr. 5)12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,35,36,37,38. Jak je uvedeno na obr. 4, FH4 má van der Waalsovy kontakty a příznivé polární interakce s aktivními zbytky místa a vodami. Zejména dva dvojvazný sůl mosty s Asp27 a Arg57 ukotvení obou konců FH4, aminopyrimidine (N3 a exocyclic-NH2), a α-karboxylát, respektive, v blízkosti totožné pozice jako v substrátu/analogové complexes12,20,24,45.

aktivní struktura místa komplexu eDHFR:FH4 zobrazená ve stereofonních pohledech. boční řetězce (azurová) do 4 Å FH4 (zelená) a smyčka Met20 (žlutá) jsou zobrazeny jako tyčinky. Sekundární struktury jsou zobrazeny jako karikatury v šedé barvě a vody do 3,5 Å FH4 jako koule. Polární interakce s FH4 jsou označeny přerušovanými čarami. Mapa elektronové hustoty fo-Fc vynechávající FH4 je zobrazena na úrovni 3,5 σ červeně a mapa vynechání 2Fo-Fc na úrovni 1,0 σ je zobrazena modře pro zbytky a vody. Tři konformery vazeb ile14-Gly15 amidu jsou označeny přerušovanou kružnicí a červenými šipkami. b rozšířený pohled na spojení Ile14-Gly15

superpozice komplexu FH4 s analogovými komplexy FH2 a FH4. Aktuální FH4, FH2, a hlásil, eDHFR komplexy a hlásil, 5-formyl-FH4 komplex spolu s jejich uzavřené Met20 smyčky konformací, Phe31 zbytky a odpovídající ligandy jsou barevné v zelené, purpurové a žluté, resp. Všechny ostatní struktury z PDB Id: 1DYJ (ddFH4)45, 5CCC (ddFH4:NADP+)12, 1RF7 (FH2)24, 4PDJ (FH2:NADPH)20, a 4PSY (kyselina listová:NADP+)20 jsou barvy šedé. Červená čárkovaná kružnice značí navrhovaného π–π interakce mezi Phe31 a ligand benzoyl skupiny, které přijaly dva odlišné směry v závislosti na vázané ligandy. FH4 a 5-formyl-FH4 patří do jednoho clusteru, v kontrastu k ddFH4, FH2, a kyseliny listové, zatímco Phe31 straně řetězy zůstat v téměř stejné pozici ve všech zarovnané struktury. Smyčky Met20 jsou rozděleny do tří obecných konformačních stavů, uzavřených, částečně uzavřených a uzavřených. Pouze uzavřené konformace lze konstrukčně přizpůsobit nikotinamid skupiny NADP(H) kofaktor vstupu do aktivní stránky

Tam jsou dvě molekuly vody překlenutí Met20 smyčky a FH4 prostřednictvím vodíkové vazby síť, která zahrnuje Gly15 (C = O)-wat1-FH4(N5) a Glu17(NH)-wat2-FH4(N10) (Obr. 4). Tyto interakce jsou chybí v dříve oznámeno (6R)-5,10-dideazatetrahydrofolate (ddFH4) complexes12,45 vzhledem k N k C výměna na 5 a 10 pozice v analogové. To může způsobit pozorovaný rozdíl v konformaci Met20 v analogu ve srovnání s komplexem FH4 (obr. 5). Jediné dostupné struktury v PDB, které se velmi podobají konformaci smyčky Met20 v komplexu FH4, jsou komplex 5-formyl-FH4 (obr. 5, PDB ID: 1JOM) 51 a dva alosterické inhibiční komplexy eDHFR-nanobody, které cílí na různé epitopy DHFR s nanomolární afinitou (Doplňkový obr. 2, PDB IDs: 3K74 a 4EIG) 28,29. 5-formyl-FH4 komplex zachovává přemostění vody mezi Glu17(NH) a FH4(N10) jako v FH4 složité, i přes jejich různé místa skupiny P61 a P212121, resp. 5-Formyl-FH4, také známý jako kyselina folinová nebo leukovorin, je „záchranný“ lék schválený FDA pro prevenci škodlivých účinků methotrexátu během chemoterapie53. Γ-karboxylová skupina FH4 vykazuje malou elektronovou hustotu (obr. 4), což naznačuje poruchu nebo větší volnost otáčení vazby kolem osy Cß-Cy nebo CY-Cδ C než v jiných částech ligandů.

kromě vodovodní sítě, zjistili jsme, strukturální původ stabilizující interakce v FH4 složité a pomalé uvolnění produktu na základě strukturální srovnání současné FH4 a FH2 binární komplexy a bylo oznámeno dříve eDHFR struktur. Za prvé, van der Waalsův kontakt s postranním řetězcem Glu17 vede k dodatečnému stínění FH4 z rozpouštědla (obr. 4), který chybí v substrátu nebo analogu produktu (6R)-5,10-dideazatetrahydrofolátových komplexů12,20,24,45. Za druhé, jasné elektronové hustoty tři alternativní páteř konformace zachovány Ile14-Gly15 amidové vazby naznačuje entropický příspěvek ke stabilitě FH4 komplex z místní flexibilitu na Met20 smyčky kotvu (Obr. 4). Zejména, předchozí mutageneze studie ukázaly, Ile14 je zásadní pro kontrolu pružnosti Met20 smyčky, vzhledem k tomu, že I14V, I14A, a I14G varianty všechny vykazovaly pomalejší hydridové rychlost přenosu, vyšší flexibilitu Met20 smyčky, jak bylo pozorováno v otevřené konformaci v krystalové struktury, zvýšená teplotní závislost primární kinetické izotopové účinek a vyšší přechodový stav aktivační energie vypočtená z hybridní QM/MM simulations23,40. Za třetí, otáčení benzoyl kroužek vede k elektrostaticky příznivé edge-to-face π–π interakce s zachovaných Phe31 v FH4 komplex v kontrastu k proton-u-proton (edge-to-edge) odpudivá interakce v FH2, kyseliny listové, a ddFH4 komplexů bez ohledu na to, NADP(H) vazba (Obr. 5, rozšířený pohled, obr. 6)54,55. Funkční důsledky tato strukturální změna je podporován také pozorování současné rotace benzoyl prsten a sp3 na sp2 přechod na C6 pozici vázaného ligandu v době průběhu FH4 na FH2 rozpad komplexu (Obr. 3). Roli Phe31 při kontrole verze produktu je dále potvrzeno předchozí mutageneze studies56, které prokázaly, že F31V a F31Y variant eDHFR zobrazí se dvou-násobné zvýšení v ustáleném stavu rychlostní konstanta kcat a odhaduje se, že 20 – 50-násobné zvýšení rychlosti uvolňování výrobků kromě mutace vliv na zpomalení hydridové přenos.

elektrostatické interakce π-π systémů. Viz rozhodčí 54,55 podrobnosti

s Ohledem na dynamické vlastnosti, zejména E. coli DHFR systém, stabilní uzavřené eDHFR:FH4 komplexu (nízké volné energie meziproduktu na jeho dynamické krajiny) pozorovat zde lze přiměřeně základem pomalé uvolnění produktu kinetika (koff rychlost FH4 disociace, rychlost-limitujícím krokem eDHFR katalytického cyklu). Podle předchozích studií NMR relaxační disperze, každý krok katalytického cyklu E. coli DHFR následuje spíše“ výběr konformace „než“ indukovaný fit “ mechanismus15. V důsledku toho, mikroskopické rychlost každého kroku podél koordinovat reakce závisí na konformační vzorkování z enzyme15 (např. přechod státu, který je příslušný pro rychlý přenos hydridu nebo omezující rychlost verze produktu). To znamená, že čím stabilnější je pozemní stav, a čím více se liší od excitované rozvodny, tím větší jsou náklady na volnou energii potřebné k odběru takových konformací. Pro eDHFR to bude nutně zahrnovat reorganizaci aktivního místa a flexibilní smyčky Met20. To bylo navrženo v NMR relaxace disperze studie eDHFR15, že subpopulated excitovaného stavu pro přenos hydridu chemické krok přijímá uzavřené konformaci (jehož základním stavu Michaelis komplex je v uzavřené konformaci). Subpopulovaný excitovaný stav pro krok uvolňování produktu však přijímá uzavřenou konformaci (jejíž komplex FH4 v základním stavu je v uzavřené konformaci). Podél reakce koordinovat, v současné době pozorován eDHFR:FH4 binární komplex je umístěn mezi eDHFR:FH4:NADP+ a eDHFR:FH4:NADPH střední komplexy (Obr. 1). Jak přijmout uzavřené konformace, kde nikotinamid část kofaktor body od aktivní site15. Na vzorku, „uzavřel nadšený substate“ během omezující rychlost uvolnění produktu step15, aktivní stránky reorganizace z uzavřené pozemní stav musí nastat. To je reprezentováno stabilním katalytickým meziproduktem eDHFR: FH4 zachyceným v této studii. Produkt rychlost disociace koff z FH4 byla zvýšena na kofaktor vazba s dvou-násobné zvýšení pro eDHFR:FH4:NADP+ ve srovnání s eDHFR:FH4, a osminásobné zvýšení eDHFR:FH4:NADPH ve srovnání s eDHFR:FH4 měřeno při pH 6 a pH 9 soutěžními experimenty35. To znamená zrychlené uvolňování produktu a zvýšené konformační vzorkovací frekvence, když je kofaktor vázán. I když autentický eDHFR:FH4:NADPH ternární komplex zemi státní struktury nikdy hlášeny dříve, předpokládáme, že tam mohou být značné podobnosti s eDHFR:FH4 binární komplex, jako všechny FH4-bound země střední státy přijmout uzavřené conformation15. Očekáváme však, že kofaktor závazné zvýší populaci excitovaného substates, navrhla již dříve na základě NMR relaxace rozptylové studie, aby se v uzavřené conformation15. V souladu s tím, pozorovali jsme, že v ternární komplex eDHFR:FH2:NADP(H) struktura (také stanoveno, v naší studii v rámci samostatné podmínky krystalizace), Met20 smyčky staly neuspořádanými. To naznačuje obecný mechanismus kofaktor usnadnit ligand exchange posílením konformační vzorkování, kdy je kofaktor vázán s jeho nikotinamid skupinu směřující od aktivního místa.

V FH4 komplex, vzdálenost mezi FH4 benzoyl kroužek (C1ʹ) a Phe31 (Cz) 4.93 Å, což je výrazně kratší (~0.3–0.6 Å) než odpovídající vzdálenosti v současné FH2 a dříve oznámil, FH2 komplexy (PDB ID: 1RF7, 4PDJ)20,24, které jsou 5.22, 5.55, a 5.32 Å, resp. Podobný trend zkracování vzdálenosti podél reakční souřadnice eDHFR byl zdůrazněn ve dvou nezávislých výpočetních studiích. A QM/MM studii spočítali, že odpovídající vzdálenost je zkrácena o ~0.3 Å z Michaelisova komplexu k přechodu státu jako hydrid převod reakce nastane, a že tam je malý rozdíl v této vzdálenosti (~0.01 Å) mezi přechodový stav a reakce product27. Další studie využívající smíšenou kvantovou / klasickou molekulární dynamiku navrhla dramatičtější zkrácení odpovídající vzdálenosti o ~1 Å, jak se reakce vyvíjí z reaktantu do přechodového stavu18. Proto naše krystalografické pozorování jsou v obecné shodě s předchozí výpočtové modelování naznačuje, že, do jisté míry, FH4 komplex zachovává fyzikální charakter přechodového stavu. To je rovněž v souladu s předchozí pozorování na dynamické energie krajiny eDHFR mapovány pomocí NMR relaxace disperze, že každý meziprodukt v katalytického cyklu vzorky low-ležící nadšený státy, jejichž konformace se podobají zemi-státní struktury z předcházející nebo následující intermediates15. Od enzymů, stabilizace přechodového stavu, pomalé uvolňování výrobků z DHFR rodina může být připadající na přenos z fyzické povahy přechodový stav na produkt reakce komplexu. To je navrhl, z dlouho-sleduje FH4 složité určit zde, kromě druhově specifické konformační změny potřebné v průběhu katalytického cycle32.

Charakteristika uzavřené komplex eDHFR s nanomol vazebnou afinitu s pomalým nástupem inhibitor

X-ray krystalografie ukazují, že komplex eDHFR s pomalým nástupem těsné inhibitor AMPQD46 také zobrazuje uzavřené konformaci. Na Met20 smyčky přijala konformaci v AMPQD komplex, který připomíná, že ternární komplex s anti-diabetických biguanid fenformin a NADP+ (PDB ID: 5) 52. Na druhou stranu, FDA-schválené chemoterapeutické agent methotrexátem byla již dříve prokázána X-ray crystallography24,47, NMR48, a single-molecule kinetics49 vázat v uzavřené DHFR konformaci (Obr. 7). Tento rozdíl v proteinové konformace bylo nečekané, protože všechny tři inhibitory mají společný strukturální rys: biguanid skupina fenformin, diaminopyrimidine skupina AMPQD, a diaminopterin skupiny methotrexátu, každý připojený k fenylové skupiny s flexibilním linkerem. Důkladné vyšetření ze strukturní superpozice odpovídajících komplexů inhibitorů eDHFR (obr. 7) ukázal, že methylamino propojení skupiny methotrexát (chybí v fenformin a AMPQD) obsazené pozice, které by vedly k potenciální stérické střet s Met20 smyčky, pokud je přijata uzavřené konformaci jako v fenformin a AMPQD komplexy. Dříve jsme prokázali, že AMPQD vykazuje relativně vyšší preference (Trojnásobný pokles IC-50 a Ki) pro inhibici eDHFR oproti lidskému DHFR46. Ještě vyšší druhová specificita pro e. coli nad lidské DHFR (~30-krát) je pozorován pro mateřské sloučeniny AMPQD, který postrádá aminofenyl ocas skupiny a methylenovou linker46. Současné krystalové struktury uzavřené komplex eDHFR s AMPQD poskytuje věrohodné mechanistické vysvětlení pro jeho druhů-specifičnost, připadající na rozdíly v konformační rovnováhy lidského DHFR vs. eDHFR. První z nich je pozorován výhradně v uzavřených konformacích, zatímco druhý vykazuje vyšší konformační flexibilitu vzorkování v uzavřených i uzavřených konformacích, jak je popsáno dále.

Struktura eDHFR:AMPQD inhibiční komplex. stereofonní pohled na interakce aktivního místa s AMPQD s mapou vynechání Fo-Fc na úrovni 3.5 σ. Proteinové postranní řetězce (azurová) do 4 Å AMPQD (zelená) jsou zobrazeny jako tyčinky, včetně dvou zbytků ze smyčky Met20 (žlutá). Polární interakce jsou označeny přerušovanými čarami. b Superpozice AMPQD (zelená), fenformin (žlutá, PDB: 5UIH)52, a methotrexát komplexy (šedá zobrazené jako tenké tyčinky z PDB: 1RA3, 1DDS)20,47. Met20 smyčky jsou zobrazeny jako karikatury a ligandy jako tyčinky. Chemické struktury ligandů jsou nakresleny nahoře. NADP(H) není zobrazena v některé ze struktur, pro jednoduchost prohlížení

Srovnání DHFR konformace na základě clustering

shlukování DHFR PDB struktury pomocí RMSD z Met20 smyčky páteř Ca atomy, jako je vzdálenost metrické (Obr. 8 a doplňkový obr. 3) ukazuje, že lidský DHFR výhradně přijímá zavřené konformace (katalyticky příslušný pro NADPH závazné), vzhledem k tomu, že eDHFR je mnohem více flexibilní, s jak uzavřené a uzavřené konformace. Uzavřené konformace jsou méně často pozorovány (17%) ve strukturách eDHFR. Jak komplex uvolňování produktu omezující rychlost s FH4, tak inhibiční komplex s pomalým nástupem s AMPQD přijímají uzavřenou konformaci eDHFR (obr. 9), který je zřídka zastoupen v PDB (Doplňkový obr. 3). Zajímavé je, že obě FH4 a AMPQD sdílejte vlastnosti nanomol afinitu a pomalé uvolňování z eDHFR35,36,46 s pozicí key atomy dusíku na heterocykly silně konzervováno, a rozdíly patrné v ocasy. To naznačuje novou strategii pro vývoj inhibitorů DHFR cílením na uzavřené konformace eDHFR. Navrhujeme také strategii boje proti drogové rezistenci. Jak je znázorněno na doplňkovém obr. 4, Při porovnání konformace AMPQD s FH4 a trimethoprimu s FH4 existují jemné rozdíly ve Van der Waalsových obálkách. Trimethoprim edhfr únikové varianty E. coli DHFR mají mutace, které také blokují inhibiční funkci AMPQD57. Studiem rozdílů v interakcích lze hledat další ligandy, které minimalizují tyto interakční rozdíly s FH2 a FH4. To by mohlo zajistit, že mutace, které snižují vazbu inhibitorů, také sníží vazebnou afinitu FH2 a FH4.

shlukování 162 struktur DHFR na základě jejich párových Ca RMSD smyček Met20. Struktury DHFR jsou reprezentovány kruhy vyplněnými modrou (lidé), zelenou (eDHFR) a červenou (v této studii). Délka okraje (zbarvená fialově pro uzavřené konformace a zlato pro uzavřené konformace) je úměrná maximálnímu RMSD smyčkových konformerů Met20. Podrobnější schéma shlukování naleznete v doplňujících informacích

superpozice komplexů AMPQD (zelená) a FH4 (žlutá). Smyčky Met20 jsou zobrazeny jako karikatury a ligandy jako tyčinky. Pohled na právo je otočený o 90° ve směru hodinových ručiček okolo svislé osy z pohledu znázorněno na levé straně

Charakteristika ternární komplex eDHFR

a Konečně, v eDHFR:FH2:NADP (H) ternární komplex s ko-purifikovaným endogenním ligandem a kofaktory (obr. 10), zjistili jsme, že smyčka Met20 je neuspořádaná. To podporuje úlohu kofaktoru závazné v posilování konformační vzorkování pro rychlé ligand exchange nebo usnadnění uvolnění produktu prostřednictvím alosterický mechanismus (TS‡2, Obr. 1)12,13,14,15. Část nikotinamidové ribózy se odklání od aktivního místa (obr. 10) podobně jako uzavřený ternární komplex FH412. Jeho redoxní stav není znám na základě elektronové hustoty. Schopnost izolovat různé endogenní ligand vázaný, binární a ternární eDHFR komplexy v různé podmínky krystalizace naznačuje, že eDHFR obsahuje směs molekulárních druhů s různými vázány ligandy a kompletu konformací. Účinnost krystalografické přístup aplikován zde využívá molekulární nehomogenita vynecháním dialýzu krok k izolaci dlouho sleduje a chemicky labilní FH4 komplex krystalové struktury. To je v rozporu s typickým procesem zahrnujícím předběžnou úpravu vzorků DHFR dialýzou, který odstraňuje stopové endogenní ligandy a zvyšuje homogenitu vzorku. Vylepšená homogenita obecně zlepšuje celkovou úspěšnost ko-krystalizace nebo crystal namáčení experimenty, kdy ligandy zájmu jsou exogenně představil.

stereofonní pohledy na ternární komplex DHFR:FH2:NADP(H). Neuspořádaná smyčka Met20 (zbytky mezi Ile14 a Pro21) je označena jako černé přerušované čáry. Mapa vynechání Fo-Fc na úrovni 3,0 σ je zobrazena jako červená síťovina. Sekundární struktury jsou zobrazeny jako karikatury a ligandy v reprezentaci hole. Atomy jsou zbarveny následovně: uhlík (bílý), dusík (modrý), kyslík (červený) a fosfor (oranžový)