Nadčasový TCID50: Jedno řešení pro mnoho virů,
Tento měsíc jsme pokrýt stará klasika, Infekční Dávka Tkáňové Kultury 50 test, nebo TCID50. Test TCID50 se používá ke kvantifikaci virových titrů stanovením koncentrace, při které 50% infikovaných buněk vykazuje cytopatický účinek (CPE). Tak dlouho, jak virus zájmů způsobuje buněčnou smrt, tento test má tu výhodu, že jsou levné a snadno implementovat také, když virus-specifické protilátky nejsou k dispozici. Ve skutečnosti je zapotřebí velmi málo informací o samotném viru, což z něj činí klíčový nástroj pro studium nových a vznikajících patogenů.
TCID50 test: co to je a jak ho používat
v testu TCID50 se sériová ředění viru přidávají na monovrstvy buněk a ponechávají se, dokud není vidět CPE. V tomto okamžiku může být účinek sériového ředění na buňky hodnocen buď diskontinuálním nebo kontinuálním způsobem. V diskontinuálním způsobem, jeden ředění, při kterém 50% buněk displej CPE se používá přibližně kvantifikovat množství viru přítomné v původní populace. To je poměrně jednoduché a nevyžaduje další analýzu. Nicméně, to také přijít s mírou nepřesnosti, protože neumožňuje přesně rozlišit ve stejném ředění.
přesnější informace lze dosáhnout kontinuálním způsobem pomocí kolorimetrického odečtu, např. metabolický substrát se specifickou absorpcí, kde množství získaného signálu je úměrné počtu živých buněk. Hodnoty absorbance jednotlivých roztoků lze pak děj v nepřetržitém non-lineární regrese, křivka dávka-reakce, z nichž bude možné extrapolovat přesnější hodnoty TC50. Na diskontinuální metoda je dostačující, pokud přesný titr není nutné, nebo zjistit, jaké koncentrace viru je zapotřebí získat určité procento nákazy v následných testech (výhodou TCID50 je, že to může být provedeno na buněčné linii zájem, tak dlouho, jak virus způsobuje CPE). Nicméně i v těchto případech může být lepší použít ředění záhyby mezi 1: 2 a 1: 5 pro zlepšení přesnosti. Pokud je místo toho nutná přesnější kvantifikace, například při porovnávání účinku různých léčebných postupů nebo mutací na titry viru, může být preferována kolorimetrická metoda.
z ředění do titrů
hodnoty TCID50 udávají, kolik virů je zapotřebí k tomu, aby měly CPE v 50% buněk. Ale jak jít z toho na skutečné množství viru na ml? Vzorec je poměrně jednoduchý a spočívá v vynásobení hodnoty TCID50 0,7. Tento pochází z Poissonova rozdělení aplikovat na virové infekce, která uvádí, že plně permisivní buněčné linie, pravděpodobnost dosažení 50% infekce je dosaženo tím, multiplicity infekce přibližně 0,7. To není vždy pravda,, ale je to dobrá aproximace pro většinu aplikací.
problémy s počítáním virů
tak přesné, jak je možné, počítání virů není nikdy snadné. Za prvé, sériová ředění jsou-svou vlastní povahou-zdrojem chyb. Za druhé -a to je důležité zejména pro vysoké titry viru – dokonce i nejmenší objem, který zůstává připojena na samém konci pipety může nést dost virových částic, aby podstatný rozdíl v kvantifikace. Za třetí, biologická variace systému je vysoká. Plate stejné množství buněk, přidejte stejné množství viru, zastavte infekci současně a procento infekce může být blízké, ale nikdy úplně stejné.
konečně při hodnocení léčby, která (jak byste doufali!) snižuje titry viru, množství viru může klesnout pod práh detekce testu.
umění počítání virů
dobrou zprávou je, že jakmile znáte své problémy, nejste daleko od řešení! Přesnost sériového ředění může být snížena automatizací, ale i když to není k dispozici, některé malé tipy mohou změnit. Patří sem výměna špiček pipety a nikdy nevkládejte špičku pipety hlouběji než milimetr do dalšího ředění, aby nedošlo k náhodnému přenášení některých dalších protokolů viru, který se právě zasekl na vnějším plastu. Repliky jsou také důležité, a tím spíše pro miniaturizované testy. 96 dobře desky umožňují souběžné zpracování více vzorků způsobem, který více low-propustnost metody (jako plaque assay) nechtěl dovolit, ale oni přicházejí s další variability, jako malé objemy jsou ještě více citliví na problémy diskutované výše. Zatímco technické repliky jdou nějakým způsobem k řešení tohoto problému, ve VRS se snažíme provádět experimenty, které budou vyžadovat kolorimetrický TCID50 v biologickém trojím vyhotovení. To zvyšuje robustnost přístupu a umožňuje vyloučit falešné body v datovém souboru bez ztráty významu. Přesné hodnoty TC50 budou vyžadovat nelineární regresní dávku-odpověď kolorimetrických dat, které programy jako GraphPad Prism mohou snadno generovat. Schopnost jakéhokoli softwaru vykreslit tento druh křivky však bude přísně záviset na kvalitě dat a na blízkých číselných hodnotách replikátů. Vizuální kontrola křivek a generovaných hodnot TC50 se důrazně doporučuje k nápravě situací, kdy byla extrapolace zkreslena falešnými datovými body. Především, naše zkušenosti naznačují, že za standardní virus skladem titrací, experimenty, které budou vyžadovat TCID50 odečet může být nutné další kroky optimalizace, jak určit nejlepší biologické podmínky, že bude zajištěna proti proudu sbírka reprodukovatelné množství viru (např. počet infekcí, časové body) a nejlepší rozsah koncentrací pro testování na testu TCID50 (např. počáteční koncentrace a ředění).
buněčná smrt nebo pěkné obrázky?
počítání mrtvých buněk není snadné, protože velmi často opouštějí desku při prvním praní-předpokládají, že jsou stále na prvním místě! To nepomůže s přesností. Ačkoli dražší a pracnější, kdykoli je k dispozici dobrá protilátka, imunofluorescenční barvení je přístup, který bychom obecně zvolili. Test může být zastaven před smrtí buněk a citlivost je obecně vyšší, což umožňuje větší kontrolu a vyšší přesnost. Kromě toho lze tuto metodu použít pro viry, které nezpůsobují CPE, nebo to trvá dlouho (a umožňuje to čelit, některé pěkné obrázky viru v akci jsou mnohem povznášející!). Poškození buněk je však ochrannou známkou většiny infekcí a několika vznikajících virů, o nichž víme jen velmi málo. Nyní je k dispozici několik kolorimetrických/fluorescenčních reportérů, které mohou citlivě měřit a rozlišovat mezi různými typy cytotoxicity. Vypadá to, že tato stará klasika je připravena na nové výzvy!