Timeless TCID50: Eine Lösung für viele Viren
Diesen Monat behandeln wir einen alten Klassiker, den Tissue Culture Infectious Dose 50 Assay oder TCID50. Der TCID50-Assay wird zur Quantifizierung viraler Titer verwendet, indem die Konzentration bestimmt wird, bei der 50% der infizierten Zellen eine zytopathische Wirkung (CPE) zeigen. Solange das interessierende Virus den Zelltod verursacht, hat dieser Assay den Vorteil, dass er auch dann billig und einfach zu implementieren ist, wenn virusspezifische Antikörper nicht verfügbar sind. Tatsächlich sind nur sehr wenige Informationen über das Virus selbst erforderlich, was es zu einem Schlüsselinstrument für die Untersuchung neuer und aufkommender Krankheitserreger macht.
TCID50-Assay: Was es ist und wie es verwendet wird
In einem TCID50-Assay werden serielle Verdünnungen eines Virus auf Monoschichten von Zellen gegeben und belassen, bis CPE sichtbar ist. An dieser Stelle kann die Wirkung der seriellen Verdünnung auf die Zellen entweder diskontinuierlich oder kontinuierlich bewertet werden. In diskontinuierlicher Weise wird die Einzelverdünnung, bei der 50% der Zellen CPE aufweisen, verwendet, um die im Originalbestand vorhandene Virusmenge näherungsweise zu quantifizieren. Dies ist ziemlich einfach und erfordert keine weitere Analyse. Es ist jedoch auch mit einer gewissen Ungenauigkeit verbunden, da es nicht möglich ist, innerhalb derselben Verdünnung genau zu unterscheiden.
Durch Verwendung einer farbmetrischen Anzeige, z.B. ein metabolisches Substrat mit spezifischer Absorption, wobei die Menge des erworbenen Signals proportional zur Anzahl der lebenden Zellen ist. Die Extinktionswerte der verschiedenen Verdünnungen können dann in einer kontinuierlichen nichtlinearen Regressions-Dosis-Wirkungs-Kurve dargestellt werden, aus der genauere TC50-Werte extrapoliert werden können. Die diskontinuierliche Methode ist ausreichend, wenn kein genauer Titer erforderlich ist oder um zu bestimmen, welche Viruskonzentration erforderlich ist, um einen bestimmten Prozentsatz der Infektion in nachgeschalteten Assays zu erhalten (ein Vorteil des TCID50 besteht darin, dass es an der interessierenden Zelllinie durchgeführt werden kann, solange das Virus CPE verursacht). Selbst in diesen Fällen kann es jedoch besser sein, Verdünnungen zwischen 1: 2 und 1:5 zu verwenden, um die Genauigkeit zu verbessern. Wenn stattdessen eine genauere Quantifizierung erforderlich ist, beispielsweise beim Vergleich der Wirkung verschiedener Behandlungen oder Mutationen auf Virustiter, kann ein kolorimetrisches Verfahren bevorzugt werden.
Von Verdünnungen zu Titern
TCID50-Werte geben einen Hinweis darauf, wie viel Protein benötigt wird, um CPE in 50% der Zellen zu haben. Aber wie geht man davon zur tatsächlichen Virusmenge pro ml über? Die Formel ist ziemlich einfach und besteht darin, den TCID50-Wert mit 0, 7 zu multiplizieren. Dies ergibt sich aus der auf Virusinfektionen angewendeten Poisson-Verteilung, die besagt, dass in einer vollständig permissiven Zelllinie die Wahrscheinlichkeit, eine Infektion von 50% zu erreichen, durch eine Multiplizität der Infektion von ungefähr 0,7 erreicht wird. Dies ist nicht immer der Fall, aber es ist eine gute Annäherung für die meisten Anwendungen.
Die Probleme beim Zählen von Viren
So genau man auch sein kann, das Zählen von Viren ist nie einfach. Erstens sind serielle Verdünnungen – ihrer Natur nach – eine Fehlerquelle. Zweitens – und dies ist besonders relevant für hohe Virustiter – kann selbst das kleinste Volumen, das am Ende einer Pipettenspitze verbleibt, genügend Viruspartikel tragen, um einen wesentlichen Unterschied in der Quantifizierung zu bewirken. Drittens ist die biologische Variation des Systems hoch. Platte die gleiche menge von zellen, fügen sie die gleiche menge von virus, stoppen die infektion zur gleichen zeit, und der prozentsatz der infektion kann in der nähe, aber nie genau die gleiche.
Schließlich bei der Beurteilung einer Behandlung, die (wie Sie hoffen würden!) die Virustiter verringert, kann die Virusmenge unter die Nachweisschwelle des Assays fallen.
Die Kunst, Viren zu zählen
Die gute Nachricht ist, dass Sie, sobald Sie Ihre Probleme kennen, nicht weit von einer Lösung entfernt sind! Die Genauigkeit bei der seriellen Verdünnung kann durch Automatisierung verringert werden, aber selbst wenn dies nicht verfügbar ist, können einige kleine Tipps den Unterschied ausmachen. Dazu gehört, die Pipettenspitzen zu wechseln und niemals eine Pipettenspitze tiefer als einen Millimeter in die nächste Verdünnung einzuführen, um zu vermeiden, dass versehentlich zusätzliche Virusprotokolle mitgeführt werden, die sich gerade auf dem äußeren Kunststoff festgesetzt haben. Replikate sind ebenfalls wichtig, und dies umso mehr für miniaturisierte Assays. 96-Well-Platten ermöglichen die gleichzeitige Handhabung mehrerer Proben auf eine Weise, die mit Methoden mit geringem Durchsatz (wie Plaque-Assay) nicht möglich wäre, sie weisen jedoch eine zusätzliche Variabilität auf, da kleine Volumina für die oben diskutierten Probleme noch empfindlicher sind. Während technische Replikate einen Weg finden, dies zu beheben, versuchen wir bei VRS, Experimente durchzuführen, die ein kolorimetrisches TCID50 in biologischem Dreifach erfordern. Dies erhöht die Robustheit des Ansatzes und ermöglicht es, Störpunkte im Datensatz auszuschließen, ohne an Bedeutung zu verlieren. Genaue TC50-Werte erfordern eine nichtlineare Regressions-Dosis-Wirkungs-Beziehung der kolorimetrischen Daten, die Programme wie GraphPad Prism leicht erzeugen können. Die Fähigkeit einer Software, diese Art von Kurve zu zeichnen, hängt jedoch streng von der Qualität der Daten und von den engen numerischen Werten der Replikate ab. Eine visuelle Inspektion der Kurven und der erzeugten TC50-Werte wird dringend empfohlen, um Situationen zu korrigieren, in denen die Extrapolation durch falsche Datenpunkte verzerrt wurde. Vor allem legen unsere Erfahrungen nahe, dass Experimente, die eine TCID50-Anzeige erfordern, über Standard-Virustitrationen hinaus zusätzliche Optimierungsschritte erfordern können, um die besten biologischen Bedingungen zu bestimmen, die eine vorgelagerte Sammlung reproduzierbarer Virusmengen (z. Zelllinie der Wahl, Plattenformat, Vielzahl der Infektionen, Zeitpunkte) und den besten Konzentrationsbereich für den Test mit dem TCID50-Assay (z. B. Startkonzentration und Verdünnungsfalte).
Zelltod oder schöne Bilder?
Tote Zellen zu zählen ist nicht einfach, da sie die Platte beim ersten Waschen sehr oft verlassen – vorausgesetzt, sie sind überhaupt noch da! Dies hilft nicht bei der Genauigkeit. Obwohl teurer und mühsamer, ist die Immunfluoreszenzfärbung immer dann der Ansatz, den wir im Allgemeinen wählen würden, wenn ein guter Antikörper verfügbar ist. Der Test kann vor dem Zelltod gestoppt werden und die Empfindlichkeit ist im Allgemeinen höher, was eine bessere Kontrolle und höhere Genauigkeit ermöglicht. Darüber hinaus kann diese Methode für Viren verwendet werden, die kein CPE verursachen oder die lange brauchen (und seien wir ehrlich, einige schöne Bilder eines Virus in Aktion sind weitaus erhebender!). Zellschäden sind jedoch das Markenzeichen der meisten Infektionen und mehrerer aufkommender Viren, von denen wir nur sehr wenig wissen. Mehrere kolorimetrische / fluoreszierende Reporter sind jetzt verfügbar, um verschiedene Arten von Zytotoxizität empfindlich zu messen und zu unterscheiden. Es sieht so aus, als ob dieser alte Klassiker neuen Herausforderungen gewachsen ist!