atemporal TCID50: o soluție la mai multe virusuri
în această lună vom acoperi un vechi clasic, cultura de țesut infecțioase doza 50 test, sau TCID50. Testul TCID50 este utilizat pentru a cuantifica titrurile virale prin determinarea concentrației la care 50% din celulele infectate prezintă efect citopatic (CPE). Atâta timp cât virusul de interes provoacă moartea celulelor, acest test are avantajul de a fi ieftin și ușor de implementat și atunci când anticorpii specifici virusului nu sunt disponibili. De fapt, sunt necesare foarte puține informații despre virusul în sine, ceea ce îl face un instrument cheie pentru studierea agenților patogeni noi și emergenți.
testul TCID50: ce este și cum se utilizează
într-un test TCID50, diluțiile seriale ale unui virus sunt adăugate pe monostraturile celulelor și lăsate până când CPE poate fi văzut. În acest moment, efectul diluției seriale asupra celulelor poate fi marcat fie într-o manieră discontinuă, fie continuă. Într-o manieră discontinuă, diluția unică la care 50% din celule prezintă CPE este utilizată pentru a cuantifica aproximativ cantitatea de virus prezentă în stocul inițial. Acest lucru este destul de simplu și nu necesită analize suplimentare. Cu toate acestea, vine și cu un grad de inexactitate, deoarece nu permite să se distingă cu exactitate în cadrul aceleiași diluții.
informații mai precise pot fi obținute în mod continuu prin utilizarea unei citiri colorimetrice, de ex. un substrat metabolice cu absorbanta specifice, în cazul în care cantitatea de semnal dobândite este proporțională cu numărul de celule vii. Valorile absorbanței diferitelor diluții pot fi apoi reprezentate grafic într-o curbă continuă de regresie neliniară doză-răspuns, din care va fi posibilă extrapolarea unor valori TC50 mai precise. Metoda discontinuă este suficientă dacă nu este necesar un titru precis sau pentru a determina ce concentrație de virus este necesară pentru a obține un anumit procent de infecție în testele din aval (un avantaj al TCID50 este că poate fi efectuat pe linia celulară de interes, atâta timp cât virusul provoacă CPE). Cu toate acestea, chiar și în aceste cazuri, poate fi mai bine să utilizați diluții falduri între 1:2 și 1:5 pentru a îmbunătăți precizia. Atunci când este necesară o cuantificare mai precisă, de exemplu atunci când se compară efectul diferitelor tratamente sau mutații asupra titrurilor virusului, poate fi preferată o metodă colorimetrică.
de la diluții la titruri
valorile TCID50 oferă o indicație a numărului de viruși necesari pentru a avea CPE în 50% din celule. Dar cum să trecem de la aceasta la cantitatea reală de virus pe ml? Formula este destul de simplă și constă în înmulțirea valorii TCID50 cu 0,7. Aceasta provine din distribuția Poisson aplicată infecției virale care afirmă că, într-o linie celulară complet permisivă, probabilitatea de a ajunge la 50% infecție este obținută printr-o multiplicitate de infecție de aproximativ 0,7. Acest lucru nu este întotdeauna adevărat, dar este o aproximare bună pentru cele mai multe aplicații.
problemele de numărare viruși
la fel de exacte ca unul poate fi, de numărare viruși nu este niciodată ușor. În primul rând, diluțiile seriale sunt-prin natura lor – o sursă de eroare. În al doilea rând-și acest lucru este deosebit de relevant pentru titrurile mari de virus – chiar și cel mai mic volum care rămâne atașat la capătul vârfului unei pipete poate transporta suficiente particule virale pentru a face o diferență substanțială în Cuantificare. În al treilea rând, variația biologică a sistemului este ridicată. Placa aceeași cantitate de celule, adăugați aceeași cantitate de virus, opriți infecția în același timp, iar procentul de infecție poate fi aproape, dar niciodată exact la fel.
în cele din urmă, atunci când evaluați un tratament care (așa cum ați spera!) scade titrurile virusului, cantitatea de virus poate scădea sub pragul de detectare a testului.
arta de a număra viruși
vestea bună este că, odată ce îți cunoști problemele, nu ești departe de o soluție! Precizia diluării în serie poate fi redusă prin automatizare, dar chiar și atunci când acest lucru nu este disponibil, unele sfaturi mici pot face diferența. Acestea includ schimbarea vârfurilor pipetei și nu introduceți niciodată un vârf de pipetă mai adânc decât un milimetru în următoarea diluție, pentru a evita transportarea accidentală a unor bușteni suplimentari de virus care tocmai s-au blocat pe plasticul exterior. Replicatele sunt, de asemenea, importante și cu atât mai mult pentru testele miniaturizate. Plăcile de sondă 96 permit manipularea simultană a mai multor probe într-un mod pe care metodele mai reduse (cum ar fi testul plăcii) nu l-ar permite, dar vin cu o variabilitate suplimentară, deoarece volumele mici sunt și mai sensibile la problemele discutate mai sus. În timp ce replicile tehnice merg într-un fel pentru a aborda acest lucru, la VRS încercăm să rulăm experimente care vor necesita un TCID50 colorimetric în trei exemplare biologice. Acest lucru crește robustețea abordării și permite excluderea punctelor false din setul de date fără a pierde semnificația. Valorile TC50 exacte vor necesita o regresie neliniară doză-răspuns a datelor colorimetrice, pe care programe precum GraphPad Prism le pot genera cu ușurință. Cu toate acestea, capacitatea oricărui software de a trasa acest tip de curbă va depinde strict de calitatea datelor și de valorile numerice apropiate ale replicilor. O inspecție vizuală a curbelor și a valorilor TC50 generate este foarte recomandată pentru a corecta situațiile în care extrapolarea a fost distorsionată de puncte de date false. Mai presus de toate, experiența noastră sugerează că, dincolo de titrările standard ale stocului de viruși, experimentele care vor necesita citirea TCID50 pot necesita pași suplimentari de optimizare, atât pentru a determina cele mai bune condiții biologice care vor asigura colectarea în amonte a cantităților reproductibile de virus (de ex. linia de celule aleasă, formatul plăcii, multiplicitatea infecției, punctele de timp) și cea mai bună gamă de concentrații de testat pe testul TCID50 (de exemplu, concentrația inițială și pliul de diluare).
moartea celulelor sau imagini frumoase?
numărarea celulelor moarte nu este ușoară, deoarece foarte des abandonează placa la prima spălare – se presupune că sunt încă acolo în primul rând! Acest lucru nu ajută cu precizie. Deși este mai scump și mai laborios, ori de câte ori este disponibil un anticorp bun, colorarea imunofluorescenței este abordarea pe care am alege-o în general. Testul poate fi oprit înainte de moartea celulelor și sensibilitatea este în general mai mare, ceea ce permite un control mai mare și o precizie mai mare. În plus, această metodă poate fi utilizată pentru viruși care nu provoacă CPE sau care necesită mult timp pentru a face acest lucru (și vă permite să vă confruntați, unele imagini frumoase ale unui virus în acțiune sunt mult mai înălțătoare!). Cu toate acestea, deteriorarea celulelor este marca comercială a majorității infecțiilor și a mai multor viruși emergenți despre care știm foarte puțin. Mai mulți reporteri colorimetrici/fluorescenți sunt acum disponibili pentru a măsura sensibil și a distinge între diferite tipuri de citotoxicitate. Se pare că acest vechi clasic este pentru noi provocări!