5.3 miRNA-Zprostředkované Nařízení Cílů
v Rámci RISC, miRNA komunikovat s cílovými geny prostřednictvím párování bází. Interakce mezi miRNA a její cílovou mRNA je omezena na 5 ‚ konec miRNA. Komplementarita sekvence mezi nukleotidy 2-8, známá také jako „oblast semen“, je nezbytná pro rozpoznávání cílové sekvence, i když byly prokázány výjimky z tohoto pravidla . Nejčastěji jsou vazebná místa miRNA přítomna v 3′ – nepřeložené oblasti (UTR) cílových mRNA, obvykle ve více kopiích . Bylo však také prokázáno, že miRNA cílí na 5′ – UTR a kódující oblasti mRNA . Studie Tay et al. prokázaly, že síť miRNA mohou vázat na více místech v rámci kódování a 3‘-UTR z jedné cílové mRNA, čímž se složitost miRNA-zprostředkované cíle nařízení . Stupeň komplementarity mezi semenem oblasti miRNA a vazebné místo v cílové mRNA určuje mechanismus, kterým miRNA reguluje cíl . Pokud miRNA obnažuje dostatečnou sekvenční komplementarity (téměř dokonalé) cílové mRNA, pak nařízení provádí proces se nazývá RNA interference, kdy RISC je zaměřena na štěpit cílovou mRNA . Pokud není dostatečná komplementarita, což je obecně případ savců, regulace je dosažena potlačením translace a / nebo destabilizací mRNA .
základní složky RISC jsou rodina proteinů Argonaute (Ago), které hrají klíčovou roli v jeho funkci . Všechny čtyři savců Před bílkoviny (Ago1–Ago4) může přímé translační represe cílové mRNA, avšak pouze Ago2 má „kráječ“ činnosti, a je zodpovědný za štěpení cílové mRNA . Přesný mechanismus(y) translační represe cílových genů zprostředkované mirnou je stále nejistý . Několik studií poskytlo důkaz, že translační represe nastává před zahájením překladu . Jiné studie však naznačují, že k represi dochází po zahájení překladu . Původně se předpokládalo, že represe cílových genů zprostředkovaná miRNA se projevila převážně na úrovni proteinů, bez nebo minimálního účinku na hladiny mRNA. Nicméně nyní je prokázáno, že miRNA-zprostředkované represe cílových genů je často spojována s destabilizace mRNA, i když není známo, jestli je to vedlejší účinek translační represe. miRNA-zprostředkované degradaci mRNA cíle zahrnuje deadenylation (odstranění Poly ocas), následuje decapping a exonucleolytic trávení . Kromě toho, zpracování těla (P-bodies), cytoplazmatické struktury zapojené do skladování a degradace mRNA, jsou také myšlenka hrát roli v miRNA regulace . miRNA jsou myšlenka průvodce cílové mRNA a související RISC bílkovin na tyto paměťové struktury, které jsou obohaceny pro mRNA, degradace a translační represe faktory . Mechanismy diktující, zda Cílová mRNA sleduje cestu degradace nebo translační represe, nejsou v současné době známy. Přidání složitosti miRNA-zprostředkované nařízení jsou nedávné objevy, které za různých stresových podmínek miRNA-indukované potlačení cíle může být obrácen, a že miRNA může aktivovat překlad cílových mRNA .
miRNA-zprostředkované nařízení se zdá být velmi dynamický proces, jeho složitost je zvýšena tím, že ideální complimentarity do cíle není nutné pro regulaci. To naznačuje, že jedna miRNA má potenciál regulovat více cílových genů. Kromě toho může síť miRNA fungovat současně a regulovat jednu mRNA. To v konečném důsledku ztěžuje in silico identifikaci cílových genů a objasnění funkce miRNA.
oblast semen, umístěná v pozicích 2-7 od 5 ‚ konce miRNA, je využívána RISC jako nukleační signál pro rozpoznávání cílové mRNA . Na mRNA jsou odpovídající místa označována jako „místa osiva“. Existuje řada řetězců spojených s rozpoznáváním a vazbou cílových semen . Přísné místo semen má perfektní vazbu Watson-Crick a lze jej rozdělit do čtyř typů „semen“: 8mer, 7mer-m8, 7mer-A1 a 6mer . Každý z těchto typů se liší v závislosti na kombinaci nukleotidu polohy 1 a párování v poloze 8. 8mer má jak adenin v poloze 1 cílového místa mRNA, tak párování bází v poloze 8. Je známo, že adenin na cílovém místě odpovídající poloze 1 miRNA zvyšuje účinnost rozpoznávání cíle . 7mer-A1 má pouze adenin v poloze 1, zatímco 7mer-m8 má pouze párování bází v poloze 8. Naproti tomu 6mer nemá adenin v poloze 1 ani párování bází v poloze 8 .
kromě přísné semen uznání, mírně přísné uznání je také možné, jako RISC může tolerovat malé neshody nebo wobble párování v regionu semen. Termodynamická stabilita párování wobble (například G:U) je srovnatelná se stabilitou párování Watson–Crick .
je známo, že párování Watson-Crick v 3 ‚ části molekuly miRNA zvyšuje účinnost rozpoznávání místa u cílů miRNA, které mají párování semen . Preferovaný nukleotidový počet shod ve 3 ‚ části se liší mezi místem, které má přísné párování semen, a místem, které má středně přísné párování semen . Přísná semena vyžadují 3-4 zápasy v pozicích 13-16, zatímco středně přísná semena vyžadují 4-5 zápasů v pozicích 13-19. Weby s tímto dodatečným párováním 3 se nazývají 3-doplňková a 3 “ kompenzační místa .
bylo značně prokázáno, že drtivá většina miRNA cíl uznání sekvence se nacházejí v 3′-UTR cílové genu, i když miRNA-naložený RISC může teoreticky vázat jakýkoliv segment mRNA. Cílové geny mají obecně delší 3 ‚UTR, zatímco některé všudypřítomné geny, jako jsou geny udržující dům, mají tendenci mít krátké 3‘ UTR, potenciálně se vyhnout regulaci miRNA . Cílové stránky nejsou rovnoměrně rozděleny s 3 ‚ UTR. Jsou umístěny v blízkosti obou konců na dlouhé 3 ‚ UTR (obvykle ≥2000 nt). Pro kratší 3 ‚ UTR mají cílová místa tendenci být ~15-20 nt od stop kodonu .
i když se obecně má za to, že funkční místa miRNA jsou přednostně umístěna v 3 ‚UTR, místa semen v kódovací sekvenci a 5‘ UTR regiony mohou také podporovat down-regulaci mRNA . Základ pro preferenční vazbu miRNA v UTR 3 ‚ může mít řadu vysvětlení. Například RISC muset soutěžit s ostatními proteinové komplexy, jako jsou ribozomy, vazba na kódující sekvence a překlady zahájení komplexy v 5‘ UTR. Jako takový 3 ‚ UTR může být jednoduše dostupnější pro dlouhodobou vazbu než ostatní dvě stránky .