5.3 Regolazione mediata da miRNA dei target
All’interno del RISC, i miRNA interagiscono con i geni target tramite l’accoppiamento di base. L’interazione tra un miRNA e il suo mRNA target è limitata all’estremità 5′ del miRNA. La complementarità di sequenza fra i nucleotidi 2-8, anche conosciuti come” la regione del seme”, è vitale per il riconoscimento di sequenza dell’obiettivo , sebbene le eccezioni a questa regola siano state dimostrate . Più comunemente, i siti di legame miRNA sono presenti nella regione 3 ‘ – non tradotta (UTR) degli MRNA target, di solito in più copie . Tuttavia, miRNA inoltre è stato dimostrato per indirizzare il 5 ‘ – UTR e le regioni di codifica di mRNA . Uno studio di Tay et al. dimostrato che una rete di miRNA può legarsi a più siti all’interno della codifica e 3’-UTR di un singolo bersaglio mRNA, aggiungendo alla complessità della regolazione del bersaglio mediata da miRNA . Il grado di complementarità fra la regione del seme del miRNA ed il sito legante nell’mRNA dell’obiettivo determina il meccanismo da cui il miRNA regola l’obiettivo . Se il miRNA mette a nudo la complementarità sufficiente di sequenza (quasi perfetta) all’mRNA dell’obiettivo, allora la regolazione è effettuata da un processo chiamato interferenza del RNA, per cui il RISC è diretto per fendere l’mRNA dell’obiettivo . Se non vi è sufficiente complementarità, che è generalmente il caso nei mammiferi, la regolamentazione si ottiene attraverso la repressione della traduzione e / o la destabilizzazione dell’mRNA .
I componenti principali del RISC sono la famiglia di proteine Argonaute (Ago), che svolgono un ruolo chiave nella sua funzione . Tutte e quattro le proteine Fa dei mammiferi (Ago1–Ago4) possono dirigere la repressione traslazionale di un mRNA target, tuttavia, solo Ago2 possiede attività “affettatrice” ed è responsabile della scissione dell’mRNA target . Il meccanismo esatto della repressione traslazionale mediata da miRNA dei geni bersaglio è ancora incerto . Diversi studi hanno fornito la prova che la repressione traslazionale avviene prima dell’inizio della traduzione . Tuttavia, altri studi suggeriscono che la repressione si verifica dopo l’inizio della traduzione . Inizialmente si pensava che la repressione mediata dai miRNA dei geni bersaglio si riflettesse prevalentemente a livello proteico, con nessun effetto o minimo sui livelli di mRNA. Tuttavia, ora è stato dimostrato che la repressione mediata da miRNA dei geni bersaglio è spesso associata alla destabilizzazione dell’mRNA, sebbene non sia noto se questo sia un effetto secondario della repressione traslazionale. La degradazione mediata da miRNA dei bersagli mRNA comporta la deadenilazione (rimozione della coda Poli A), seguita da decapping e digestione esonucleolitica . Inoltre, i corpi di elaborazione (corpi P), strutture citoplasmatiche coinvolte nello stoccaggio e nella degradazione dell’mRNA, sono anche pensati per svolgere un ruolo nella regolazione dei miRNA . Si pensa che i miRNA guidino l’mRNA target e le proteine RISC associate a queste strutture di stoccaggio, che sono arricchite per i fattori di degradazione dell’mRNA e di repressione traslazionale . I meccanismi che determinano se un mRNA target segue il percorso di degradazione o di repressione traslazionale sono attualmente sconosciuti. Aggiungendo alla complessità della regolazione mediata da miRNA sono le recenti scoperte che in diverse condizioni di stress la repressione indotta da miRNA degli obiettivi può essere invertita e che miRNA può attivare la traduzione dell’mRNA target .
La regolazione mediata da miRNA sembra essere un processo estremamente dinamico, la sua complessità è aumentata dal fatto che non è richiesta una perfetta complementarità con l’obiettivo per la regolazione. Ciò indica che un singolo miRNA ha il potenziale per regolare più geni bersaglio. Inoltre, una rete di miRNA può funzionare simultaneamente per regolare un singolo mRNA. Ciò infine rende in silico l’identificazione dei geni dell’obiettivo e la delucidazione della funzione del miRNA molto più difficile.
La regione del seme, situata alle posizioni 2-7 dall’estremità 5′ del miRNA, è impiegata dal RISC come segnale di nucleazione per il riconoscimento dell’mRNA dell’obiettivo . Sull’mRNA i siti corrispondenti sono indicati come”siti di sementi”. Ci sono un certo numero di stringencies associate al riconoscimento e al binding del sito seed di destinazione . Un sito rigoroso del seme ha il legame perfetto di Watson-Crick e può essere diviso in quattro tipi “del seme”: 8mer, 7mer-m8, 7mer-A1 e 6mer . Ciascuno di questi tipi differisce a seconda della combinazione del nucleotide della posizione 1 e dell’accoppiamento alla posizione 8. 8mer ha sia un’adenina alla posizione 1 del sito bersaglio mRNA e base-pairing alla posizione 8. Un’adenina sul sito bersaglio corrispondente alla posizione 1 di un miRNA è nota per aumentare l’efficienza del riconoscimento del bersaglio . 7mer-A1 ha un adenina in posizione 1 solo, mentre 7mer-m8 ha base-pairing in posizione 8 solo. Al contrario, 6mer non ha né un adenina in posizione 1 né base-pairing in posizione 8 .
Oltre al riconoscimento rigoroso del seme, il riconoscimento moderatamente rigoroso è inoltre possibile, poichè il RISC può tollerare i piccoli disallineamenti o l’accoppiamento di oscillazione all’interno della regione del seme. La stabilità termodinamica di un accoppiamento oscillante (come G: U)è paragonabile a quella di un accoppiamento Watson–Crick .
L’accoppiamento Watson–Crick nella parte 3′ della molecola del miRNA è noto per migliorare l’efficacia del riconoscimento del sito negli obiettivi del miRNA che hanno accoppiamento del seme . Il numero preferibile del nucleotide delle partite nella parte 3 ‘ differisce fra il sito che ha accoppiamento rigoroso-seme e quello che ha accoppiamento moderato-rigoroso-seme . I semi rigorosi richiedono 3-4 partite nelle posizioni 13-16, mentre i semi moderati-rigorosi richiedono 4-5 partite nelle posizioni 13-19. Siti con questo ulteriore 3 ‘accoppiamento sono chiamati 3-supplementare e 3’ siti di compensazione .
È stato ampiamente dimostrato che la stragrande maggioranza delle sequenze di riconoscimento miRNA target si trova nel 3′-UTR del gene target, anche se RISC caricato con miRNA può in teoria legare qualsiasi segmento di mRNA. I geni bersaglio hanno generalmente 3 ‘UTR più lunghi, mentre alcuni geni onnipresenti, come i geni di mantenimento della casa, tendono ad avere 3’ UTR corti, potenzialmente per evitare di essere regolati dal miRNA . I siti di destinazione non sono distribuiti uniformemente con 3 ‘ UTR. Si trovano vicino a entrambe le estremità su lungo 3 ‘ UTR (generalmente ≥2000 nt). Per 3 ‘ UTR più brevi, i siti di destinazione tendono ad essere ~ 15-20 nt lontano dal codone di arresto .
Mentre è generalmente considerato che i siti funzionali del miRNA sono situati preferenzialmente in 3′ UTR, i siti del seme nella sequenza di codifica e nelle regioni di 5′ UTR possono anche promuovere il down-regolamento del mRNA . La base per il legame preferenziale del miRNA nel 3 ‘ UTR può avere una serie di spiegazioni. Ad esempio, il RISC potrebbe dover competere con altri complessi proteici, come i ribosomi, legandosi alla sequenza codificante e ai complessi di iniziazione della traduzione nel 5’ UTR. Come tale il 3 ‘ UTR potrebbe semplicemente essere più accessibile per il legame a lungo termine rispetto agli altri due siti .