5.3 regulação mediada pelo miRNA dos alvos
no RISC, miRNA interage com os genes alvo através de emparelhamento de base. A interacção entre um miRNA e o ARNm alvo está limitada ao fim de 5′ do miRNA. A complementaridade de sequências entre nucleótidos 2-8, também conhecida como “região de sementes”, é vital para o reconhecimento de sequências-alvo, embora exceções a esta regra tenham sido demonstradas . Mais comumente, os sites de ligação miRNA estão presentes na Região 3′ – não traduzida (UTR) do alvo mRNAs, geralmente em várias cópias . No entanto, também foi demonstrado que miRNA tem como alvo as regiões 5′ – UTR e de codificação do mRNA . A study by Tay et al. demonstrou que uma rede de miRNA pode ligar-se a vários sítios dentro da codificação e 3′-UTR de um único alvo de mRNA, aumentando a complexidade da regulação mediada por miRNA . O grau de complementaridade entre a região semente do miRNA e o local de ligação no mRNA alvo determina o mecanismo pelo qual o miRNA regula o alvo . Se o miRNA possui uma complementaridade de sequência suficiente (quase perfeita) com o ARNm alvo, então a regulação é realizada por um processo chamado interferência de RNA, através do qual o RISC é direcionado para cortar o ARNm alvo . Se não houver complementaridade suficiente, o que é geralmente o caso dos mamíferos, a regulação é conseguida pela repressão da tradução e/ou desestabilização do ARNm .
os principais componentes do RISC são a família de proteínas Argonaute (Ago), que desempenham um papel fundamental na sua função . Todas as quatro proteínas há mamífero (Ago1-Ago4) podem dirigir a repressão translacional de um mRNA alvo, no entanto, apenas Ago2 possui atividade “cortadora”, e é responsável pela clivagem alvo mRNA . O(s) mecanismo (s) exato (s) da repressão translacional mediada pelo miRNA dos genes-alvo ainda é incerto . Vários estudos forneceram provas de que a repressão translacional ocorre antes do início da tradução . No entanto, outros estudos sugerem que a repressão ocorre após o início da tradução . Inicialmente, pensava-se que a repressão mediada pelo miRNA dos genes-alvo se reflectia predominantemente no nível proteico, sem efeitos mínimos nos níveis de mRNA. No entanto, ficou agora demonstrado que a repressão mediada pelo miRNA dos genes alvo está frequentemente associada à desestabilização do ARNm, embora não se saiba se este é um efeito secundário da repressão translacional. a degradação mediada por miRNA dos alvos do mRNA envolve a deadenilação (remoção da cauda do poli A), seguida por decapping e digestão exonucleolítica . Além disso, pensa-se que os corpos de processamento (corpos P), As estruturas citoplásmicas envolvidas no armazenamento e degradação do ARNm, também desempenham um papel na regulação do miRNA . pensa-se que o miRNA orienta o mRNA e as proteínas RISC associadas a estas estruturas de armazenamento, que são enriquecidas por fatores de degradação do mRNA e de repressão translacional . Os mecanismos que determinam se um ARNm alvo segue a via de degradação ou de repressão translacional são actualmente desconhecidos. Somando-se à complexidade da regulação mediada por miRNA estão as recentes descobertas de que sob diferentes condições de estresse a repressão induzida por miRNA dos alvos pode ser revertida e que miRNA pode ativar a tradução do mRNA alvo .A regulação mediada pelo miRNA parece ser um processo extremamente dinâmico, a sua complexidade é aumentada pelo facto de a complimentaridade perfeita para o alvo não ser necessária para a regulação. Isto indica que um único miRNA tem o potencial de regular múltiplos genes alvo. Além disso, uma rede de miRNA pode funcionar simultaneamente para regular um único mRNA. Isto, em última análise, torna muito mais difícil a identificação Silica dos genes-alvo e a elucidação da função miRNA.
a região de sementes, localizada nas posições 2-7 a partir da extremidade 5′ do miRNA, é empregada pela RISC como um sinal de nucleação para reconhecer o ARNm alvo . No ARNm, os sítios correspondentes são referidos como”sítios de sementes”. Há uma série de stringências associadas com o reconhecimento e ligação do site de sementes alvo . Um site de sementes rigoroso tem uma ligação perfeita Watson-Crick e pode ser dividido em quatro tipos de “sementes”: 8mer, 7mer-m8, 7mer-A1, e 6mer . Cada um destes tipos difere dependendo da combinação do nucleótido da posição 1 e emparelhamento na posição 8. 8mer tem uma adenina na posição 1 do local alvo do mRNA e emparelhamento de base na posição 8. Sabe-se que uma adenina no local-alvo correspondente à posição 1 de um miRNA aumenta a eficiência do reconhecimento do alvo . 7mer-A1 tem uma adenina apenas na posição 1, enquanto 7mer-m8 tem emparelhamento base apenas na posição 8. Em contraste, 6mer não tem adenina na posição 1 nem emparelhamento de base na posição 8 .
além de um rigoroso reconhecimento de sementes, um reconhecimento moderadamente rigoroso também é possível, uma vez que o RISC pode tolerar pequenas discrepâncias ou emparelhamento oscilante dentro da região de sementes. A estabilidade termodinâmica de um emparelhamento wobble (como G:U) é comparável à de um emparelhamento Watson–Crick .Sabe–se que Watson-Crick emparelhamento na parte 3′ da molécula miRNA aumenta a eficácia de reconhecimento local nos alvos miRNA que têm emparelhamento de sementes . O número de nucleótidos preferíveis na parte 3 difere entre o local que tem emparelhamento de sementes rigoroso e o que tem emparelhamento de sementes moderado-rigoroso . As sementes rigorosas requerem 3-4 matches nas posições 13-16, enquanto as sementes moderadas exigem 4-5 matches nas posições 13-19. Os sítios com este emparelhamento adicional de 3′ são denominados sítios compensatórios 3-suplementares e 3′.
tem sido amplamente demonstrado que a grande maioria das sequências de reconhecimento alvo miRNA são encontradas no 3′-UTR do gene alvo, mesmo que o RISC carregado com miRNA possa, em teoria, ligar qualquer segmento do mRNA. Os genes-alvo geralmente têm mais de 3′ UTR, enquanto certos genes ubíquos, como os genes de manutenção da casa, tendem a ter menos de 3′ UTR, potencialmente para evitar ser regulado pelo miRNA . Os locais de destino não estão uniformemente distribuídos com 3 ‘ UTR. Eles estão localizados perto de ambas as extremidades em longo 3 ‘ UTR (geralmente ≥2000 nt). Para menos de 3′ UTR, os locais alvo tendem a ser ~15-20 nt longe do codon stop .Embora se considere geralmente que os sítios funcionais miRNA estão preferencialmente localizados em 3′ UTR, os sítios de sementes na sequência de codificação e as regiões de 5’ UTR também podem promover a sub-regulação do mRNA . A base para o miRNA preferencial vinculativo no 3 ‘ UTR pode ter uma série de explicações. Por exemplo, o RISC pode precisar competir com outros complexos proteicos, como ribossomas, ligando-se à sequência de codificação e complexos de iniciação de tradução no 5’ UTR. Como tal, o 3 ‘ UTR pode simplesmente ser mais acessível para a ligação a longo prazo do que os outros dois sites .