krystalstrukturen af en tetrahydrofolatbundet dihydrofolatreduktase afslører oprindelsen af langsom produktfrigivelse

isolering ved krystallisering af det endogene (6s)-5,6,7,8-tetrahydrofolatbundne E. coli DHFR-kompleks

strukturen af eDHFR:FH4 binært kompleks blev bestemt ved molekylær udskiftning ved anvendelse af edhfr:folat:NADP+ lukket ternært kompleks (PDB id: 7dfr)50. Som vist i Fig. 2 bekræfter den klare elektrondensitet den co-rensede endogene ligand som FH4 baseret på den tetraedriske geometri af sp3 C6 i overensstemmelse med en 6s stereoisomer. Dette står i modsætning til den trigonale plane geometri af sp2 C6 i et FH2 binært kompleks opnået fra lignende krystallisationsbetingelser.

sammenligning af ligandstrukturerne i eDHFR: FH4 (grøn, topfigur) og eDHFR:FH2 (orange, bundfigur) komplekser. Fo-Fc udelade elektrondensitetskort kontureret omkring liganderne vises på 3,0 liter niveau. Synspunkterne til højre drejes 90 liter mod uret om den lodrette akse fra perspektiverne vist til venstre. FH4 og FH2 vises som pinde. C6 carbonatomet er farvet i magenta, og dets forskellige hybridiseringstilstande i FH4 og FH2 er angivet med magenta pegende pile. Alle andre atomer er farvet som følger: ilt i rødt, nitrogen i blåt, kulstof i grønt og orange for henholdsvis FH4 og FH2. Kun ikke-hydrogenatomer er vist for nem visning

i et forsøg på at forstå, hvorfor vi opnår FH4-komplekset, mens andre har fejlet, identificerede vi, at oprindelsen af de to forskellige ligandkomplekser (FH4 vs FH2) er tidspunktet for krystalhøstning og dermed varigheden af krystalvækst. En tid kursus undersøgelse vist i Fig. 3, der følger ændringerne af elektrontætheder af den bundne ligand på forskellige dage med krystalvækst afslørede, at FH4 til FH2-henfaldet (reflekteret i SP3 til sp2-overgangen ved C6-position) forekom cirka 2-3 dage efter opsætning af krystallisation.

Stereovisninger af tidsforløbet for Fo-Fc udelader elektrondensitetskortændringer svarende til konverteringen af FH4 til FH2. Fo-Fc udelade elektrondensitetskort kontureret omkring liganderne vises på 3,0 liter niveau. EDHFR:FH4 binære komplekse krystaller blev dyrket i mørke ved stuetemperatur. På hvert tidspunkt blev en enkelt krystal fra et uafhængigt krystaldråbe høstet ved flashfrysning til røntgendiffraktion. Ligandstrukturerne af FH4 og FH2 af fuldt raffinerede binære komplekse strukturer på henholdsvis 2 og 14 dage er vist i hver figur som referencer for at sammenligne med ændringen af elektrontætheder. Udelad-kortene for krystallerne høstet efter 3 og 6 dage blev genereret efter indledende strukturel forfining uden at indføre ligander eller opløsningsmidler. Superposition af proteinstrukturerne blev udført under anvendelse af PyMOL69

dette er første gang, vi ved, at et autentisk FH4-bundet DHFR-kompleks med et domæne er blevet isoleret. Vi har valideret protokollen til gengivelse af krystallisationen af eDHFR:FH4-komplekset og bekræftet tidsforløbet for FH4 til FH2-henfald med mindst to uafhængige replikater på hvert tidspunkt for krystalhøstning (supplerende Fig. 1). De mellemliggende elektrontætheder langs tidsforløbet for ligandens henfald viser tydeligt SP3 til sp2-overgangen ved C6-positionen og samtidig rotation af bensoylringen i den bundne ligand (Fig. 3). Dette kan ligne overgangsstatens ligandkonformation i den forreste katalytiske retning. Det observerede FH4 til FH2 henfald under krystalvækst afspejler sandsynligvis ikke omvendt katalyse af DHFR, der involverer omdannelsen af FH4 til FH2. Det induceres sandsynligvis ikke af lys, i betragtning af at krystallisationsdråberne blev inkuberet ved stuetemperatur i mørke under krystalvækst, og tidsforløbet for FH4 til FH2 henfald er i størrelsesordenen dage. Vi har også testet Co-krystallisering med reduktionsmidlerne dithiothreitol(DTT) eller Tris (2-karboksyethyl)phosphin (TCEP) ved 2-3 mM koncentration samt introduktion af DTT eller TCEP i op til 20 min krystalblødning inden høst efter 2 dage, 3 dage, 14 dage op til 7,5 måneder. Igen påvirkede disse procedurer ikke reproducerbarheden af ligandelektrontæthedsændringer kvalitativt langs henfaldstidsforløbet for eDHFR: FH4-komplekset i den krystallinske form identificeret i denne undersøgelse (supplerende Fig. 1). Således er det sandsynligt, at den nuværende krystallisationsprotokol fortrinsvis krystalliserer det endogene FH4-kompleks, der er co-oprenset i eDHFR-proteinprøverne, og dets henfald i krystallen er irreversibel under de betingelser, vi testede, sandsynligvis på grund af iltning ved et endeligt iltniveau. Selvom den hurtige fremad katalytiske reaktion ved fremstilling af FH4 fra FH2 er termodynamisk begunstiget i nærvær af overskydende mængde NADPH som in vivo, det langsomme henfald af FH4-komplekset tilbage til et FH2-kompleks kan forekomme uden en fortsat tilførsel af NADPH, som vi observerede her under in vitro-krystallisationsbetingelsen. Således afsløres mysteriet om, hvorfor det længe forfulgte FH4-kompleks var vanskeligt at opnå, at være dets iboende ustabilitet. Det er meget sandsynligt, at nøglen til vores succes med at opnå den kemisk labile FH4-komplekse struktur er rettidig høst af godt diffrakterende krystaller inden for 2 dages vækst under krystallisationsbetingelsen identificeret her. Derudover indikerer en undersøgelse af DHFR-feltet, at mange krystallografiske19,20,24,28,29,32,43,45,47,48,50,51,52 og nmr12,13,15,17,19,25,26 undersøgelser af DHFR anvendte dialyse for at fjerne endogene ligander, før de introducerede de eksogene ligander af interesse. Vi identificerede en krystallisationstilstand, der isolerer det endogene FH4-bundne DHFR-kompleks uden dialyse af proteinprøven eller introduktion af yderligere substrater eller produkter. Vi postulerer, at den nuværende krystallisationsbetingelse for eDHFR:FH4-kompleks favoriserer den FH4-bundne form frem for andre former såsom eDHFR:FH2:NADP(H) ternære kompleks.

strukturel karakterisering af eDHFR:FH4-komplekset

FH4-komplekset vedtager en okkluderet konformation i eDHFR (se Fig. 4 og 5). Dette er i overensstemmelse med de tidligere fund, der antyder, at alle FH4-binære og ternære komplekser i den katalytiske cyklus (posthydridoverførsel og sp2 til sp3-konvertering ved C6) forekommer i okkluderede konformationer. Dette skyldes det steriske sammenstød mellem den vippede pterinring af FH4 med nicotinamidringen af NADP(H), som ville forekomme i den lukkede konformation af Met20-sløjfen (Fig. 5)12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,35,36,37,38. Som angivet i Fig. 4, FH4 har Van Der-kontakter og gunstige polære interaktioner med aktive rester og vand på stedet. Især to bidentatsaltbroer med Asp27 og Arg57 forankrer de to ender af FH4, aminopyrimidin (N3 og eksocyklisk-NH2) og hhv.i næsten identiske positioner som i substrat/analoge komplekser12, 20, 24, 45.

den aktive site struktur af eDHFR: FH4 kompleks vist i stereo visninger. en sidekæder (cyan) inden for 4 liter FH4 (grøn) og Met20-sløjfen (gul) vises som pinde. Sekundære strukturer vises som tegnefilm i gråt og farvande inden for 3,5 liter FH4 som kugler. Polære interaktioner med FH4 er angivet med stiplede linjer. Fo-Fc elektrondensitetskortet, der udelader FH4, vises på et 3,5 liter-niveau i rødt, og 2FO-Fc udelad-kortet på et 1,0 liter-niveau vises i blåt for rester og vand. De tre konformere af ile14-Gly15 amidforbindelser er angivet med en stiplet cirkel og røde pile. b et udvidet billede af ile14-Gly15-forbindelsen

Superposition af FH4-komplekset med FH2 og FH4 analoge komplekser. De nuværende FH4 -, FH2-og rapporterede eDHFR-komplekser og det rapporterede 5-formyl-FH4-kompleks sammen med deres okkluderede Met20-loop-konformationer, Phe31-rester og de tilsvarende ligander er farvet i henholdsvis grøn, magenta og gul. Alle andre strukturer fra PDB-id’ er:1dyj (ddFH4)45, 5ccc (ddFH4:NADP+)12, 1rf7 (FH2)24, 4pdj (FH2:NADPH)20 og 4psy (folat: NADP+)20 er farvet grå. Den røde stiplede cirkel angiver foreslåede Kristian-Kristian interaktioner mellem Phe31 og ligand bensoyl grupper, der vedtager to forskellige orienteringer afhængigt af de bundne ligander. FH4 og 5-formyl-FH4 tilhører en klynge i modsætning til ddFH4, FH2 og folat, mens Phe31 sidekæderne forbliver i næsten samme position i alle justerede strukturer. Met20-sløjferne er kategoriseret i tre generelle konformationstilstande, lukkede, delvist lukkede og okkluderede. Kun de lukkede konformationer kan strukturelt rumme nicotinamidgruppen af NADP (H) – kofaktoren, der kommer ind på det aktive sted

der er to vandmolekyler, der bygger bro mellem Met20-sløjfen og FH4 via et hydrogenbindingsnetværk, der involverer Gly15 (C = O)-vand1-FH4(N5) og Glu17(NH)-vand2-FH4(N10) (Fig. 4). Disse interaktioner er fraværende i de tidligere rapporterede (6R)-5,10-didesatetrahydrofolat (ddFH4) komplekser12,45 på grund af n til C-udskiftningen ved 5-og 10-positionerne i analogen. Dette kan forårsage den observerede forskel i Met20-konformationen i analogen sammenlignet med FH4-komplekset (Fig. 5). De eneste tilgængelige strukturer i FBF, der ligner Met20-sløjfekonformationen i FH4-komplekset, er et 5-formyl-FH4-kompleks (Fig. 5, PDB ID: 1JOM)51 og to eDHFR-nanobody allosteriske hæmmende komplekser, der er målrettet mod forskellige DHFR-epitoper med nanomolær affinitet (supplerende Fig. 2, FBF-id ‘ er: 3K74 og 4EIG)28,29. 5-formyl-FH4-komplekset bevarer brovandet mellem Glu17(NH) og FH4(N10) som i FH4-komplekset på trods af deres forskellige rumgrupper henholdsvis P61 og P212121. 5-Formyl-FH4, også kendt som folinsyre eller leucovorin, er et FDA-godkendt “rednings” lægemiddel til forebyggelse af skadelige virkninger af methotreksat under kemoterapi53. FH4-gruppen viser lille elektrondensitet (Fig. 4), hvilket antyder forstyrrelse eller mere frihed til bindingsrotation omkring C-kur-Cy eller Cy-C-kur-C-aksen end i andre dele af liganderne.

ud over vandnetværket fandt vi den strukturelle Oprindelse af de stabiliserende interaktioner i FH4-komplekset og langsom produktfrigivelse baseret på strukturel sammenligning af nuværende FH4-og FH2-binære komplekser og tidligere rapporterede eDHFR-strukturer. For det første resulterer van Der Vaals-kontakten med Glu17-sidekæden i yderligere afskærmning af FH4 fra opløsningsmiddel (Fig. 4) der er fraværende i substrat eller produktanalog (6R)-5,10-didesatetrahydrofolatkomplekser12,20,24,45. For det andet antyder den klare elektrondensitet af tre alternative rygradskonformationer af den konserverede ile14-Gly15 amidforbindelse et entropisk Bidrag til stabiliteten af FH4-komplekset fra den lokale fleksibilitet ved Met20-sløjfeankeret (Fig. 4). Især tidligere mutagenesestudier viste, at Ile14 er afgørende for at kontrollere fleksibiliteten af Met20-sløjfen, hvorimod i14v, i14a og i14g-varianter alle viste en langsommere hydridoverførselshastighed, højere fleksibilitet af Met20-sløjfen som observeret i en åben konformation i krystalstrukturer, øget temperaturafhængighed af primær kinetisk isotopeffekt og en højere overgangstilstandsaktiveringsenergi beregnet ud fra hybrid kvm/MM-simulationer23, 40. For det tredje fører rotation af bensoylringen til elektrostatisk gunstige kant-til-ansigt–Kristian-interaktioner med den konserverede Phe31 i FH4-komplekset i modsætning til proton-nær-proton (kant-til-kant) frastødende interaktioner i FH2 -, folat-og ddFH4-komplekser uanset NADP(H) – binding (Fig. 5, udvidet visning, Fig. 6)54,55. Den funktionelle implikation af denne strukturelle ændring understøttes også af observationen af den samtidige rotation af bensoylringen og SP3 til sp2-overgangen ved C6-positionen af den bundne ligand i løbet af tidsforløbet af FH4 til FH2 henfald i komplekset (Fig. 3). Phe31′ s rolle i kontrollen af produktfrigivelse bekræftes yderligere af tidligere mutagenesestudier56, som viste, at f31v-og F31Y-varianter af eDHFR udviste en dobbelt stigning i steady – state-hastighedskonstanten kcat og en estimeret 20-50 gange stigning i produktfrigivelseshastigheden ud over mutationernes virkning på at bremse hydridoverførslen.

elektrostatiske interaktioner af Kurt-kar-systemer. Se refs 54,55 for detaljer

i betragtning af de dynamiske egenskaber ved Det Særlige E. coli DHFR-system kan det stabile okkluderede eDHFR:FH4-kompleks (et mellemprodukt med lav fri energi på dets dynamiske landskab), der observeres her, med rimelighed ligge til grund for den langsomme produktfrigivelseskinetik (koff-hastighed for FH4-dissociation, det hastighedsbegrænsende trin i eDHFR-katalytisk cyklus). Ifølge tidligere NMR-afslapningsdispersionsundersøgelser følger hvert trin i den katalytiske cyklus af E. coli DHFR et “konformationsvalg” snarere end “induceret pasform” mekanisme15. Den mikroskopiske hastighed for hvert trin langs reaktionskoordinaten afhænger derfor af den konformationelle prøveudtagningshastighed for 15 (f.eks. den overgangstilstand, der er kompetent til hurtig hydridoverførsel eller hastighedsbegrænsende produktfrigivelse). Dette indebærer, at jo mere stabil jordtilstanden er, og jo mere forskellig den er fra det ophidsede understat, jo større er de frie energikostnader, der kræves for at prøve sådanne konformationer. For eDHFR vil dette nødvendigvis indebære omorganisering af det aktive sted og den fleksible Met20-loop. Det blev foreslået i NMR-afslapningsdispersionsundersøgelser af eDHFR15, at den subpopulerede ophidsede tilstand for det kemiske hydridoverførselstrin vedtager en okkluderet konformation (hvis grundtilstand Michaelis-kompleks er i en lukket konformation). Imidlertid vedtager den subpopulerede ophidsede tilstand for produktfrigivelsestrinnet en lukket konformation (hvis jordtilstand FH4-kompleks er i en okkluderet konformation). Langs reaktionskoordinaten ligger det aktuelt observerede edhfr:FH4 binære kompleks mellem eDHFR:FH4:NADP+ og eDHFR:FH4:NADPH mellemliggende komplekser (Fig. 1). Begge vedtager okkluderede konformationer, hvor nikotinamiddelen af cofaktoren peger væk fra det aktive sted15. For at prøve det” lukkede ophidsede substat ” under det hastighedsbegrænsende produktudgivelsestrin15, aktiv reorganisering af stedet fra den okkluderede jordtilstand skal forekomme. Dette er repræsenteret af det stabile katalytiske mellemprodukt eDHFR:FH4 fanget i denne undersøgelse. Produktdissociationshastigheden koff af FH4 blev øget ved cofaktorbinding med en dobbelt stigning for eDHFR: FH4: NADP + sammenlignet med eDHFR:FH4 og en otte gange stigning for eDHFR: FH4: NADPH sammenlignet med eDHFR:FH4 målt ved både pH 6 og pH 9 ved konkurrenceeksperimenter35. Dette indikerer accelereret produktfrigivelse og øget konformationsprøveudtagningshastighed, når en cofaktor er bundet. Selvom en autentisk eDHFR: FH4:NADPH ternær kompleks jordstatsstruktur blev aldrig rapporteret før, antager vi, at der kan være mærkbar lighed med edhfr: FH4 binært kompleks, da alle de FH4-bundne jord mellemliggende tilstande vedtager en okkluderet konformation15. Vi forventer dog, at cofaktorbinding vil øge befolkningen i de ophidsede understater, der tidligere blev foreslået baseret på NMR-afslapningsdispersionsstudier for at være i en lukket konformation15. I overensstemmelse med dette observerede vi, at Met20-sløjfen i et ternært kompleks af eDHFR:FH2:NADP(H) – strukturen (også bestemt i vores undersøgelse under separate krystallisationsbetingelser) blev forstyrret. Dette antyder en generel mekanisme for cofaktor lettet ligandudveksling ved at forbedre den konformationelle prøveudtagningshastighed, når cofaktoren er bundet med sin nikotinamiddel, der peger væk fra det aktive sted.

i FH4–komplekset er afstanden mellem FH4-ringen (C1-liter) og Phe31 (C) 4,93 liter, hvilket er betydeligt kortere med (~0,3-0,6 liter) end de tilsvarende afstande i nuværende FH2 og tidligere rapporterede FH2-komplekser (PDB ID: 1RF7, 4pdj)20,24, som er henholdsvis 5,22, 5,55 og 5,32 liter. En lignende tendens til afstandsforkortelse langs edhfr ‘ s reaktionskoordinat blev understreget i to uafhængige beregningsundersøgelser. En KVM / MM-undersøgelse beregnet, at den tilsvarende afstand forkortes med ~0,3 liter fra Michaelis-komplekset til overgangstilstanden, når hydridoverførselsreaktionen forekommer, og at der er ringe forskel i denne afstand (~0,01 liter) mellem overgangstilstanden og reaktionsproduktet27. En anden undersøgelse ved hjælp af blandet kvante / klassisk molekylær dynamik antydede en mere dramatisk forkortelse af den tilsvarende afstand med ~1 liter, når reaktionen udvikler sig fra reaktanten til overgangsstaten18. Derfor, vores krystallografiske observationer er generelt enige med tidligere beregningsmodellering, der antyder, at, til en vis grad, FH4-komplekset bevarer den fysiske karakter af overgangstilstanden. Dette er også i overensstemmelse med tidligere observationer af edhfr ‘ s dynamiske energilandskab kortlagt af NMR-afslapningsdispersion, at hvert mellemprodukt i den katalytiske cyklus prøver lavtliggende ophidsede tilstande, hvis konformationer ligner jordstatsstrukturer i det foregående eller følgende mellemled15. Da der er tale om en stabilisering af overgangstilstanden, kan langsom produktfrigivelse af DHFR-familien skyldes fremførslen af overgangsstatens fysiske karakter til reaktionsproduktkomplekset. Dette foreslås ud fra det længe forfulgte FH4-kompleks, der er bestemt her, ud over artsspecifikke konformationsændringer, der kræves under den katalytiske cyklus32.

karakterisering af et okkluderet kompleks af eDHFR med en nanomolær bindingsaffinitetsinhibitor med langsom start

røntgenkrystallografi viser, at komplekset af eDHFR med en langsom start tæt hæmmer AMPKD46 viser også den okkluderede konformation. Met20-sløjfen vedtog en konformation i AMPD-komplekset, der ligner det ternære kompleks med et antidiabetisk biguanid phenformin og NADP+ (PDB ID: 5UIH) 52. På den anden side blev det FDA-godkendte kemoterapeutiske middel tidligere demonstreret ved Røntgenkrystallografi24,47, NMR48 og enkeltmolekylekinetik49 til at binde i den lukkede DHFR-konformation (Fig. 7). Denne uoverensstemmelse i proteinkonformationer var uventet, da alle tre hæmmere har et fælles strukturelt træk: biguanidgruppen af phenformin, diaminopyrimidingruppen af AMPHD og diaminopteringruppen af methotreksat, der hver er forbundet med en phenylgruppe med en fleksibel linker. Imidlertid en tæt undersøgelse fra den strukturelle superposition af de tilsvarende eDHFR-hæmmerkomplekser (Fig. 7) viste, at methylamino-bindingsgruppen af methotreksatet (fraværende i phenformin og AMPHD) indtog en position, der ville resultere i et potentielt sterisk sammenstød med Met20-sløjfen, hvis den vedtog en okkluderet konformation som i phenformin-og AMPHD-komplekserne. Vi demonstrerede tidligere, at AMPHD viste en relativt højere præference (et tredobbelt fald i IC-50 og Ki) for at hæmme eDHFR over human DHFR46. En endnu højere artsspecificitet for E. coli over human DHFR (~30 gange) observeres for moderforbindelsen af AMPHD, som mangler aminophenylhale-gruppen og methylenlink-46. Den nuværende krystalstruktur af det okkluderede kompleks af eDHFR med AMPHD giver en plausibel mekanistisk forklaring på dens artsspecificitet, der kan henføres til forskelle i konformationsligevægte af human DHFR vs. eDHFR. Førstnævnte observeres udelukkende i lukkede konformationer, mens sidstnævnte viser højere konformationsfleksibilitetsprøvetagning i både lukkede og okkluderede konformationer, som diskuteret næste.

struktur af eDHFR: amphd-hæmmende kompleks. et stereobillede af de aktive stedinteraktioner med FO–Fc udelad-kortet på et niveau på 3,5 liter. Proteinsidekæder (cyan) inden for 4 liter AMPKD (grøn) er vist som pinde, inklusive to rester fra Met20-sløjfen (gul). Polære interaktioner er angivet med stiplede linjer. B Superposition af phenformin (gul, FBF: 5UIH)52 og metotreksatkomplekser (grå vist som tynde pinde fra FBF: 1ra3, 1dds)20,47. Met20 sløjfer vises som tegnefilm og ligander som pinde. Ligandernes kemiske strukturer tegnes ovenpå. NADP (H) vises ikke i nogen af strukturerne for nem visning

sammenligning af DHFR-konformationer baseret på klyngedannelse

en klyngedannelse af DHFR PDB-strukturer ved hjælp af Rmsd af Met20 loop backbone Ca-atomer som afstandsmetrik (Fig. 8 og supplerende Fig. 3) angiver, at human DHFR udelukkende vedtager en lukket konformation (katalytisk kompetent til NADPH-binding), mens eDHFR er meget mere fleksibel med både lukkede og okkluderede konformationer. De okkluderede konformationer ses sjældnere (17%) i eDHFR-strukturer. Både det hastighedsbegrænsende produktfrigivelseskompleks med FH4 og det langsomt begyndende hæmmende kompleks med AMPHD vedtager en okkluderet konformation af eDHFR (Fig. 9) Det er sjældent repræsenteret i FBF (supplerende Fig. 3). Interessant, både FH4 og AMPD deler egenskaberne ved nanomolær affinitet og langsom frigivelse fra eDHFR35,36,46 med placeringen af de vigtigste nitrogenatomer på heterocyklerne stærkt bevaret, og forskelle tydelige i halerne. Dette antyder en ny strategi til udvikling af DHFR-hæmmere ved at målrette okkluderede eDHFR-konformationer. Vi foreslår også en strategi til bekæmpelse af narkotikaresistens. Som vist i supplerende Fig. 4, når man sammenligner konformationen af AMPH4 og trimethoprim til FH4, er der subtile forskelle i konvolutterne til van Der Vaals. Trimethoprim eDHFR-flugtvarianterne af E. coli DHFR har mutationer, der også blokerer den inhiberende funktion af AMPHD57. Ved at studere forskellene i interaktioner kan man søge efter andre ligander, der minimerer disse interaktionsforskelle med FH2 og FH4. Dette kan sikre, at mutationer, som mindsker inhibitorbinding, også vil mindske bindingsaffiniteten af FH2 og FH4.

klyngedannelse af 162 DHFR-strukturer baseret på deres parvise Ca RMSD af Met20-sløjferne. DHFR-strukturer er repræsenteret af cirkler fyldt med blå (mennesker), grøn (eDHFR) og rød (i denne undersøgelse). Kantlængden (farvet i lilla for henholdsvis det okkluderede og guld for de lukkede konformationer) er proportional med den maksimale Rmsd for Met20-sløjfekonformerne. Se et mere detaljeret klyngediagram i de supplerende oplysninger

Superposition af AMPD (grøn) og FH4 komplekser (gul). Met20-sløjferne vises som tegnefilm og ligander som pinde. Udsigten til højre drejes 90 liter med uret om den lodrette akse fra perspektivet vist til venstre

karakterisering af et ternært kompleks af eDHFR

endelig i en eDHFR: FH2:NADP (H) ternært kompleks med både co-oprenset endogen ligand og cofaktorer (Fig. 10), fandt vi, at Met20-sløjfen bliver uordnet. Dette understøtter cofaktorbindelsens rolle i forbedring af konformationsprøveudtagning til hurtig ligandudveksling eller lette produktfrigivelse via en allosterisk mekanisme (TS-kr 2, Fig. 1)12,13,14,15. Nicotinamid ribose-delen svinger væk fra det aktive sted (Fig. 10) svarende til det okkluderede FH4 ternære kompleks12. Dens redoks tilstand er ukendt baseret på elektrondensiteten. Evnen til at isolere forskellige endogene ligandbundne, binære og ternære eDHFR-komplekser under forskellige krystallisationsbetingelser antyder, at eDHFR indeholder en blanding af molekylære arter med forskellige bundne ligander og et ensemble af konformationer. Effektiviteten af den krystallografiske tilgang, der anvendes her, drager fordel af den molekylære inhomogenitet ved at udelade dialysetrinnet for at isolere en længe forfulgt og kemisk labil FH4 kompleks krystalstruktur. Dette er imod den typiske proces, der involverer forbehandling af DHFR-prøver ved dialyse, som fjerner spor endogene ligander og øger prøvehomogenitet. Forbedret homogenitet forbedrer generelt den samlede succesrate for co-krystallisation eller krystalblødgøringseksperimenter, når liganderne af interesse introduceres eksogent.

Stereo udsigt over DHFR: FH2: NADP(H) ternære kompleks. Den uordnede Met20-sløjfe (rester mellem Ile14 og Pro21) er angivet som sorte stiplede linjer. Fo-Fc udelad-kortet på et niveau på 3,0 liter vises som rødt mesh. Sekundære strukturer er vist som tegnefilm og ligander i en pind repræsentation. Atomer er farvet som følger: kulstof (hvid), nitrogen (blå), ilt (rød) og fosfor (orange)