regulerende virkning af Melatonin på Cytokinforstyrrelser i Pristan-inducerede Lupusmus

abstrakt

systemisk lupus erythematosus (SLE) udvikler sig i forhold til mange miljømæssige faktorer. Efter vores mening er det mere vigtigt at undersøge effekten af melatonin på den miljørelaterede SLE. I denne undersøgelse blev 0,5 ml pristane anvendt til at inducere SLE hos kvindelige BALB/c-mus. Melatonin (0,01, 0,1, 1,0 mg/kg) blev indgivet oralt umiddelbart efter pristane-injektion i 24 uger. IgM anti ssDNA og histon antistoffer blev påvist efter 0, 1, 2, 4, 8 uger pristane injektion. Niveauerne af IL-2, IL-6 og IL-13 blev påvist efter 24 uger. Nyrelæsioner blev også observeret. Resultaterne viste, at melatonin antagoniserede de stigende niveauer af IgM anti ssDNA og histon autoantistoffer. Melatonin kan også reducere IL-6-og IL-13-produktionen og øge IL-2-produktionen. Desuden kan melatonin mindske nyrelæsionerne forårsaget af pristane. Disse resultater antydede, at melatonin har en gavnlig effekt på Pristan-induceret lupus gennem regulering af cytokinforstyrrelser.

1. Introduktion

systemisk lupus erythematosus (SLE eller Lupus) er en autoimmun sygdom, der kan angribe kroppens normale væv og celler, hvilket resulterer i betændelse og vævsskade . SLE forekommer i enhver alder og i ethvert køn. Kvinder er dog mere tilbøjelige til at have SLE end mænd . Desuden er der også rapporteret forstyrrelser i cytokinnetværket i SLE , herunder IL-1, IL-2, IL-6, IL-13 og IFN-. Disse cytokiner har tætte relationer til udviklingen af SLE, såsom produktion af autoantistoffer og immunkompleks nefritis. Men der er nogle modstridende resultater om ændringerne af nogle cytokiner i forskellige rapporter.

i de senere år er der blevet mere og mere opmærksom på miljøfaktorer, der kan være impliceret i patogenesen af SLE . Autoimmune sygdomme bliver stadig mere almindelige i industrialiserede lande, og disse sygdomme kan påvirkes af miljøfaktorer . Pristane er en sandsynlig kandidat som en miljømæssig udløser af SLE i modtagelig population. Dyreforsøg viste, at pristane kunne inducere lupuslignende autoimmune sygdomssymptomer i en stamme af mus (BALB/c), såsom høje niveauer af autoantistoffer og immunkompleks glomerulonephritis . Nogle epidemiologiske undersøgelser viste også, at alle personer med Pristan i deres blod havde forskellige autoimmune sygdomme eller symptomer på autoimmun sygdom . Derudover synes pristane, der findes i mineralolie, hajolie og mange fødevarer, at være en mulig miljøeksponering, der kan udløse SLE. Så det kan være mere hensigtsmæssigt at undersøge miljøfaktorer involveret i SLE ved hjælp af pristane-induceret SLE-lignende murine model.

Melatonin syntetiseres og udskilles hovedsageligt af pinealkirtlen, der kan fremstille specifikke receptorer ind og ud af centralnervesystemet. Melatonin kan ikke kun direkte påvirke betændelse og immunceller, men har også indirekte indflydelse på det gennem thalamencephalon . Endnu vigtigere betragtes melatonin som et vigtigt aktivt stof i det neuro-immun-endokrine system . Det er i stand til at regulere ubalancen af cytokinnetværk i nogle autoimmune sygdomme, såsom reumatoid arthritis og adjuverende arthritis . Nogle eksperimenter undersøgte dens virkninger på MRL-lpr/lpr-mus og viste, at melatonin var gavnligt for spontan SLE hos hunmus . Da miljø er en vigtig faktor i SLE i det moderne samfund, var vi mere interesserede i virkningerne af melatonin på den miljørelaterede SLE.

for at undersøge melatonins rolle i SLE, især i den miljørelaterede lupus, blev pristane-inducerede mus anvendt. Virkningerne af melatonin på cytokinforstyrrelserne og følgende ændringer i Pristan-induceret SLE-model blev også bestemt.

2. Materialer og metoder

2.1. Dyr

Tres kvindelige BALB/C-mus i alderen to måneder ( g) blev leveret af det eksperimentelle Dyrecenter ved Anhui Medical University. Alle eksperimentelle protokoller beskrevet i denne undersøgelse blev godkendt af Etisk Gennemgangsudvalg for dyreforsøg ved Institut for Klinisk Farmakologi, Anhui Medical University.

2.2. Materialer

Melatonin blev købt hos Sigma. Pristane, varmedenatureret kalv thymus DNA (ssDNA), total kalv thymus histon (histon), concanavalin A (ConA) og lipopolysaccharider (LPS) var også fra Sigma. Biotin-konjugeret kanin-anti-mus IgM antistoffer og peberrod peroksidase-mærket avidin blev købt fra . Mus interleukin-2 ELISA kits og interleukin – 6 ELISA kits blev købt fra ADL. Mus interleukin-13 ELISA kits blev købt fra BIOO.

2.3. Eksperimentelle protokoller

Tres kvindelige BALB/C-mus blev tilfældigt opdelt i seks grupper: normal kontrolgruppe, modelgruppe, prednison-behandlingsgruppe, der fungerede som positiv kontrolgruppe, og melatonin (0,01, 0,1, 1,0 mg/kg) behandlingsgrupper inklusive melatoningruppe en (MT1), melatoningruppe to (MT2) og melatoningruppe tre (MT3). Musene i normal kontrolgruppe fik en intraperitoneal injektion på 0.5 ml normal saltvand (NS), og de andre grupper fik en intraperitoneal injektion af 0,5 ml Pristan. Musene i normal kontrolgruppe og model kontrolgruppe modtog intragastrisk administration af NS pr. Musene i positiv kontrolgruppe fik intragastrisk administration af 5 mg/kg prednison (Pre) pr. Musene i MT1-gruppen blev intragastrisk behandlet med 0,01 mg/kg melatonin, MT2 0,1 mg/kg melatonin og MT3 1,0 mg/kg melatonin. Sera blev opsamlet fra halevenen før behandling (0) og 2, 4 og 8 uger efter behandling for at måle niveauet af autoantistoffer. Fireogtyve uger efter pristane-administration blev alle mus dræbt, og Milter blev fjernet til immunologiske detektioner; i mellemtiden blev nefriske væv undersøgt ved lysmikroskopi.

2.4. Anti-Ssdna-og Histonantistoffer

Anti-Ssdna-og histon-IgM-antistoffer blev påvist ved en ELISA-teknik svarende til den, der er beskrevet i . 96-brønd ELISA-plader belagt med 10 mg/L ssDNA-eller histonantigener blev inkuberet natten over ved 4. Den følgende dag blev pladerne vasket med PBS-mellem. Pladerne blev inkuberet med blokerende buffer (PBS-2% bovint serumalbumin) natten over ved 4 og vasket med PBS-mellem. Efter inkuberet natten over ved 4 med Murin serum fortyndet til 1 : 250 blev pladerne vasket igen og derefter inkuberet i 2 timer ved 4 med biotin-konjugeret-kanin antimouse IgM antistoffer fortyndet til 1: 200. Derefter blev pladerne vasket og inkuberet i 2 timer ved 4 med peberrodsperoksidase-mærket avidin i 1: 200 fortynding. Pladerne blev derefter vasket igen, og 100 L substrat —tetramethylbensidin (TMB) og brintoverilteopløsning blev tilsat til brøndene i 30 minutter ved 37. Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af 50 L på 2 M H2SO4 pr.brønd. Intensiteten af den gule farve blev læst ved 490 nm i en mikropladelæser. Sera fra andre otte normale BALB / c-mus blev opsamlet og detekteret på samme tid, og middeltætheden og SD blev beregnet til at tjene som kontrol. De gennemsnitlige indeks (EI) for prøverne i forskellige grupper blev beregnet som:

2,5. Miltcellekultur og induktion af cytokin

Miltcellekultur og induktion af cytokiner var modifikationer af metoderne som beskrevet i . Kort sagt blev enkeltcellesuspensioner fremstillet ud fra Milter, der aseptisk blev fjernet fra mus og dyrket i 24-brøndskulturplader ved en endelig koncentration af celler/ml. Cellerne blev dyrket i RPMI – 1640 suppleret med 10% føtal kalveserum, 2 mM glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 50 M 2-mercaptoethanol og 10 ml penicillin, streptomycin og antimykotisk opløsning/L (Sigma). Kulturer blev stimuleret med 3 mg/L ConA, 12 mg/L LPS eller medium alene og inkuberet ved 37 i befugtet luft med 5% CO2. Supernatanten blev høstet ved 48 timer og konserveret ved 20 til cytokinanalyser.

2.6. Cytokinanalyser

koncentrationerne af interleukin-2 (IL-2), interleukin-6 (IL-6) og interleukin-13 (IL-13) i supernatanten blev bestemt ved anvendelse af passende kommercielle ELISAs til den murine form af disse cytokiner. Intensiteten af hver prøve blev aflæst ved 450 nm i et mikropladespektrofotometer.

2.7. Histopatologiske teknikker

nyrerne, der blev opsamlet under ofring af mus, blev fikseret i 24 timer i neutral bufret formalin inden paraffinindlejring. De blev derefter undersøgt under et lysmikroskop for alvorligheden af nyrelæsionen. Glomerulonephritis, renale tubulære læsioner og interstitiel inflammation blev observeret, og graden af sværhedsgrad af histologiske læsioner, der er karakteristiske for lupus nefritis, blev vurderet som fraværende (), mild (), moderat () og svær ().

2.8. Statistisk analyse

resultaterne blev udtrykt som SD. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af elevens tovejs t-test med som det minimale niveau af betydning

3. Resultater

3.1. Virkninger af Melatonin på niveauer af IgM Anti-ssDNA og histon antistoffer i Sera

niveauerne af IgM anti-ssdna og histon antistoffer var signifikant forskellige mellem pristane-injektion og melatonin behandlingsgrupper (, Figur 1(A) og 1(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 1

sera af mus i hver gruppe blev indsamlet før behandling (0), 2, 4 og 8 uger senere, og niveauer af IgM anti-ssDNA og Antihiston antistoffer blev påvist af ELISA. EI blev beregnet efter formlen. (a) niveauet af IgM-anti-ssDNA-antistof i hver gruppe, (b) niveauet af IgM-Antihistonantistof i hver gruppe. Data blev givet i middelkrr SD (n=6-8). P * <.05, P * * <.01 versus sera ved 0 uge, Hr. P<.05, til Del P<.01 versus sera i model kontrol mus.

to uger efter en enkelt intraperitoneal injektion af pristane begyndte niveauet af anti-Ssdna IgM-antistoffer i sera at stige åbenlyst, nåede toppen ved 4 uger, begyndte derefter at falde og vendte til sidst tilbage til det normale ved 8 uger. I MT1-gruppen steg niveauet af anti-Ssdna IgM-antistoffer i sera også og nåede toppen ved 4 uger, men faldt derefter mere tydeligt sammenlignet med modelkontrolgruppen (). I MT2-gruppen steg niveauet af anti-Ssdna IgM-antistoffer i sera i løbet af de første fire uger, men meget lavere end for modelgruppe () og forblev normalt i andre perioder. I MT3-gruppen steg niveauet af anti – Ssdna IgM-antistoffer ikke(Figur 1 (a)).

Antihistonantistoffer i sera steg 1 uge efter injektion, nåede toppen ved 4 uger, faldt derefter gradvist og vendte tilbage til normal ved 8 uger. I MT1-gruppen var niveauerne af Antihistonantistoffer i sera signifikant lavere end for modelkontrolgruppen () og var tilbage til normal ved 4 uger. I MT2-og MT3-grupper steg niveauerne af antistoffer i løbet af de første fire uger, men meget lavere end modelgruppe () og forblev normale i de andre perioder (Figur 1(b)).

3.2. Virkninger af Melatonin på cytokinproduktion

for at få en bedre indsigt i melatonins indflydelse på cytokiner i SLE blev produktion af Th1-type og Th2-type cytokiner af splenocytter stimuleret med ConA eller LPS analyseret i løbet af murine lupus. Resultaterne viste, at produktionen af IL-2, IL-6 og IL-13 ændrede sig i Pristan-inducerede SLE-mus (figur 2). IL – 2 produktion af splenocytter fra mus i modelkontrolgruppe var lavere end fra normale mus (), mens IL-6 og IL-13 produktion af splenocytter fra mus i modelkontrolgruppe var højere end fra normale mus (). I MT2-og MT3-grupper var IL – 2-niveauerne op til det normale niveau og højere end for modelmus åbenlyst (), mens IL-6-og IL-13-niveauerne var lavere end for modelmusene åbenlyst (, ) (figur 2).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

figur 2

alle mus blev ofret i slutningen af 24 uger, og miltlymfocytter blev podet ved 1 til 106 celler/brønd. IL – 2 koncentrationer i miltlymfocytter blev stimuleret i 48 timer med 3 mg/L ConA. IL-6 og IL-13 koncentrationer i miltlymfocytter blev stimuleret i 48 timer med 12 mg/L LPS. IL-2, IL-6 og IL-13 koncentrationer i kultur supernatanter blev påvist af ELISA. Data blev givet i middelkrr SD (n=4-5). P * * <.01, P * <.05 versus Normal kontrolgruppe, p<.05, til Del P<.01 versus model kontrolgruppe.

3.3. Melatonins virkning på Nyrehistopatologiske ændringer

musens nyrehistopatologiske ændringer er vist i tabel 1 og figur 3.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

figur 3

nyrerne indsamlet på ofringstidspunktet blev farvet med H&E til histologisk undersøgelse. (- en) Normal kontrolgruppe (han den 200). (B)model kontrolgruppe (he 200). (c) model kontrolgruppe (he 400). (d) MT gruppe (han den 200).

som vist i figur 3(A) blev der ikke set renale abnormiteter hos normale mus. Mængden og celletallet af glomeruli var normalt. Glomerulær kapillærvæg var tynd. Der blev ikke set nogen proteinstøbning i tubule. Lymfocytinfiltration og proliferation af fibroblaster blev ikke set i renal interstitiel.

som vist i figur 3(b) og 3(c) og tabel 1 viste de fleste pristane-injicerede mus nyreabnormiteter, der spænder fra milde til svære mønstre. Nogle glomeruli viste glomerulær atrofi med kapillærudvidelse og fortykkelse af kapillærvægge. Nogle cites afslørede trombusdannelse. Mesangial udvidelse og cellelag stigende blev også observeret. Glomerulær kapselvæg var tyk, og rummet mellem kapselvæg og endotelceller forsvandt i alvorligt påvirket glomerulus. Nogle nyretubuli udviste dilatation og epitelcellernes proliferation. Proteinstøbninger blev set i tubule. En infiltration af inflammatoriske celler såsom monocytter, lymfocytter og plasmacytter med fokal aggregering blev set i renal interstitiel. Proliferationer af interstitielle fibroblaster blev også observeret.

der var nogle forbedringer i forskellige grader i melatoninbehandlede mus(figur 3 (d) og tabel 1). Glomerulær atrofi og fortykkelse af kapillærvægge blev ændret i mild eller moderat grad. Mesangial udvidelse blev også forbedret. Rummet mellem kapselvæg og endotelceller var mindre end for normale mus, men der var en forbedring sammenlignet med den ikke-behandlede modelgruppe. Let lymfocytinfiltration blev også observeret. Nogle nyretubuli viste mild dilatation og et par proteinstøbninger. Ikke desto mindre var alle ændringerne mindre alvorlige end hos modelmus.

4. Diskussion

i denne undersøgelse blev immunforstyrrelserne af Pristan-primede mus og virkningerne af melatonin observeret. Da anti-DNA-og histonantistoffer var følsomme i SLE , undersøgte vi ændringerne af IgM-anti-ssDNA-og Antihistonantistoffer og fandt høje niveauer af autoantistoffer i de pristane-injicerede mus. Nyrelæsioner blev også fundet i musene. Disse resultater var i overensstemmelse med de tidligere rapporter. Vi fandt også, at melatonin antagoniserede de stigende niveauer af IgM anti-ssdna og histon autoantistoffer, og melatonin kunne mindske nyrelæsionerne forårsaget af pristane. Pristane er en peritoneal irritation. Det er velkendt, at IgM-klassen produceres af B1 (CD5+) B-celle-delmængden , og B1-delmængden er stærkt beriget i bughulen og udvides i BALB/c-mus , hvilket øger muligheden for, at IgM-anti-ssDNA-og Antihistonantistoffer induceret af i.p. pristane er afledt af delmængden . Tidligere undersøgelser rapporterede, at melatonin havde virkninger på det første antistofimmunrespons (IgM, IgG) . Nogle undersøgelser viste, at melatonin havde tovejsmodulation på lymfocytter . Så vi troede, at melatonin kunne forbedre SLE-symptomerne ved at modulere overproduktionen af B-celler.

cytokiner netværk spiller en vigtig rolle i udviklingen af SLE. I nogle in vitro-eksperimenter kunne melatonin hæmme immunvirkningerne af nogle cytokiner og T-lymfocytter . Så vi observerede virkningerne af melatonin på forstyrrelsen af cytokiner netværk. IL-6 menes som et inflammatorisk cytokin, der udskilles af en række vævsceller, herunder makrofager og Th2-celler. IL-6 niveau har positiv korrelation til aktivitetsindekset for SLE. Vores resultater viste, at niveauet af IL-6 blev øget efter pristaninjektion, mens melatonin kunne nedsætte IL-6-produktionen. Det stigende niveau af IL – 6 kan få B-celler til at hemmeligholde flere antistoffer og fremme udviklingen af nefritis . Så nedreguleringen af IL-6-produktionen af melatonin er nyttig til at hæmme antistoffernes produktion og nyrelæsioner.

IL-2 udskilles af Th1-celler, og IL-13 udskilles af Th2-celler. Der er nogle modstridende resultater i dokumenterne om ændringerne af IL-2 og IL-13. Så i denne pristane-inducerede SLE-model undersøgte vi niveauerne af de to cytokiner. Vores resultater viste, at niveauet af IL-2 i de pristane-injicerede mus var lavere end i de normale mus, mens niveauet af IL-13 i de pristane-injicerede mus var højere end i de normale mus. Vi fandt også, at melatonin kunne reducere IL-13-produktionen, men øgede IL-2-produktionen. Mange rapporter viste, at niveauet af IL-2 faldt i SLE, især i det aktive stadium, og at IL-2 kunne nedregulere B-lymfocytaktiveringen . Nogle undersøgelser viste , at melatonin kunne regulere niveauet af IL-2/IL-2-receptorer, hvilket kan være mekanismen for den inhiberende virkning af melatonin på IL-2-produktion. IL-13, en af de vigtigste cytokiner i lupus, blev antaget at være en B-celle aktiverende faktor, som resulterede i overdreven produktion af mange autoantistoffer . IL – 13 har relation til nyrelæsionerne af SLE . Så nedreguleringen af IL-13-produktionen af melatonin er også nyttig til at hæmme antistoffernes produktion og nyrelæsioner.

det faldende niveau af Th1-type cytokin og de stigende niveauer af Th2-type cytokin indikerede også, at der var et skift fra Th1 mod Th2 i uberørt-induceret lupus. Nogle rapporter viste, at eksogent melatonin kunne aktivere T-cellerne og signifikant fremme Th1-typen cytokiner, som deltager i reguleringen af immunforstyrrelserne . Vores resultater viste, at melatonin kunne opregulere Th1-typen cytokiner og nedregulere Th2-typen cytokiner. Og det indikerede, at melatonin kunne modulere forstyrrelsen af cytokinnetværk i SLE-musene ved at regulere ubalancen af Th1/Th2.

prednison, som er et almindeligt lægemiddel til SLE , blev serveret som det positive lægemiddel i denne undersøgelse. Vi fandt ud af, at prednison havde en regulerende virkning på pristane-induceret SLE. Sammenlignet med prednison havde melatonin en lignende eller lidt tidligere effekt på SLE-symptomerne. Som vi har kendt, er bivirkningerne af prednison mere almindelige og alvorlige end melatonin. Således troede vi, at melatonin kan være et potentielt lægemiddel til SLE.

afslutningsvis viser Pristan-induceret lupus forstyrrelse i immunsystemet, såsom højt niveau af autoantistoffer og ubalance i cytokinnetværk, hvilket inducerer den fulgte nefritis. Ændringerne ligner den humane lupus, og pristane er almindelig i miljøet; således er denne model passende til at undersøge virkningerne af melatonin på miljørelateret SLE. På den anden side demonstrerede vi også, at administrationen af melatonin hæmmede ændringerne i den Pristan-inducerede lupus. Og det antydede, at melatonin havde en gavnlig effekt på miljørelateret lupus. Mekanismerne kan involvere dens modulering af forstyrrelser i immunsystemet, især i cytokiner netværk. Imidlertid bør yderligere undersøgelser være nødvendige for en bedre forståelse af reguleringsprocessen og nøglefaktoren for dens virkning på autoimmune sygdomme.