ajaton TCID50: yksi ratkaisu moniin viruksiin
tässä kuussa käsittelemme vanhaa klassikkoa, Kudosviljelmän Infectious Dose 50 assay eli Tcid50. Tcid50-määritystä käytetään viruspitoisuuksien kvantifiointiin määrittämällä pitoisuus, jolla 50% infektoiduista soluista osoittaa sytopaattisen vaikutuksen (CPE). Niin kauan kuin kiinnostava virus aiheuttaa solukuoleman, tämän määrityksen etuna on se, että se on halpa ja helppo toteuttaa myös silloin, kun virukselle spesifisiä vasta-aineita ei ole saatavilla. Itse asiassa itse viruksesta tarvitaan hyvin vähän tietoa, joten se on keskeinen väline uusien ja kehittyvien taudinaiheuttajien tutkimisessa.
TCID50-määritys: mitä se on ja miten sitä käytetään
tcid50-määrityksessä viruksen sarjalaimennoksia lisätään solujen yksikerroksiin ja jätetään odottamaan CPE: tä. Tällöin sarjalaimennoksen vaikutus soluihin voidaan pisteyttää joko epäjatkuvana tai jatkuvana. Epäjatkuvasti yksittäistä laimennosta, jossa 50%: ssa soluista on CPE: tä, käytetään suunnilleen kvantifioimaan viruksen määrä alkuperäisessä varastossa. Tämä on melko suoraviivaista eikä vaadi tarkempaa analysointia. Kuitenkin se tulee myös jonkin verran epätarkkuutta, koska se ei salli tarkasti erottaa sisällä sama laimennus.
tarkempaa tietoa voidaan saada jatkuvalla tavalla käyttämällä kolorimetristä lukemaa, esim. metabolinen substraatti, jolla on spesifinen absorbanssi, jossa saadun signaalin määrä on verrannollinen elävien solujen määrään. Eri laimennosten absorbanssiarvot voidaan sitten piirtää jatkuvalla epälineaarisella regressioannos-vastekäyrällä, josta on mahdollista ekstrapoloida tarkemmat TC50-arvot. Epäjatkuva menetelmä on riittävä, jos tarkkaa tiitteriä ei vaadita, tai sen määrittämiseksi, mitä viruspitoisuutta tarvitaan tietyn tartuntaprosentin saamiseksi jatkotutkimuksissa (tcid50: n etuna on se, että se voidaan suorittaa kiinnostavalla solulinjalla, kunhan virus aiheuttaa CPE: tä). Kuitenkin jopa näissä tapauksissa voi olla parempi käyttää laimennoksia taittuu välillä 1:2 ja 1:5 parantaa tarkkuutta. Jos sen sijaan tarvitaan tarkempaa kvantifiointia, esimerkiksi vertailtaessa eri hoitojen tai mutaatioiden vaikutusta virustitteriin, voidaan suosia kolorimetristä menetelmää.
laimennoksista tittereihin
TCID50-arvot osoittavat, kuinka paljon viruksia tarvitaan CPE: n saamiseksi 50%: ssa soluista. Mutta miten tästä siirrytään viruksen todelliseen määrään millilitrassa? Kaava on melko yksinkertainen, ja siinä tcid50-arvo kerrotaan 0,7: llä. Tämä tulee virusinfektioon sovelletusta Poisson-jakaumasta, jonka mukaan täysin sallivassa solulinjassa todennäköisyys saavuttaa 50% infektio saavutetaan moninkertaisella infektiolla, joka on noin 0,7. Tämä ei ole aina totta, mutta se on hyvä likiarvo useimmille sovelluksille.
virusten laskeminen
niin tarkkaa kuin voi olla, virusten laskeminen ei ole koskaan helppoa. Ensinnäkin sarjalaimennokset ovat – omanlaisensa-virhelähde. Toiseksi-ja tämä on erityisen tärkeää korkeille virustittereille-pienikin määrä, joka jää pipetin kärjen päähän, voi kuljettaa niin paljon virushiukkasia, että niiden määrityksessä on huomattava ero. Kolmanneksi systeemin biologinen vaihtelu on suurta. Levy sama määrä soluja, lisää sama määrä virusta, lopeta infektio samaan aikaan, ja prosenttiosuus infektio voi olla lähellä, mutta ei koskaan täsmälleen sama.
lopuksi, kun arvioidaan hoitoa, että (kuten toivoisi!) laskee virustittereitä, virusmäärä voi alittaa määrityksen toteamiskynnyksen.
virusten laskemisen taito
hyvä uutinen on, että kun tietää ongelmansa, ei ole kaukana ratkaisusta! Tarkkuutta sarjalaimennuksessa voidaan vähentää automaatiolla, mutta silloinkin kun tätä ei ole saatavilla, jotkin pienet kärjet voivat tehdä eron. Näihin kuuluu pipetin kärkien vaihtaminen, eikä pipetin kärkeä saa koskaan laittaa milliä syvemmälle seuraavaan laimennukseen, jotta se ei vahingossa kantaisi päälliseen muoviin jämähtäneitä ylimääräisiä viruslokkeja. Myös rinnakkaisnäytteet ovat tärkeitä, etenkin miniatyrisoiduissa määrityksissä. 96 hyvin levyt mahdollistavat samanaikaisen käsittelyn useita näytteitä tavalla, että enemmän alhaisen suoritustehon menetelmiä (kuten plakin määritys) ei salli, mutta ne tulevat lisää vaihtelua, koska pienet määrät ovat vielä herkempiä edellä käsiteltyjä kysymyksiä. Vaikka tekniset kopiot menevät jonkin verran käsitellä tätä, klo VRS yritämme suorittaa kokeita, jotka vaativat kolorimetrinen tcid50 biologisessa kolmena. Tämä lisää lähestymistavan luotettavuutta ja mahdollistaa virheellisten pisteiden poissulkemisen aineistossa menettämättä merkitystä. Tarkat TC50-arvot edellyttävät kolorimetristen tietojen epälineaarista regressioannosvastetta, jonka graphpadin Prisman kaltaiset ohjelmat voivat helposti tuottaa. Kuitenkin minkä tahansa ohjelmiston kyky piirtää tällaista käyrää riippuu tiukasti tietojen laadusta ja toistojen läheisistä numeerisista arvoista. Käyrien ja tuotettujen TC50-arvojen silmämääräinen tarkastus on erittäin suositeltavaa, jotta voidaan korjata tilanteet, joissa ekstrapolointi on vääristynyt väärillä datapisteillä. Ennen kaikkea kokemuksemme viittaavat siihen, että normaalien viruskannan titrausten lisäksi kokeet, jotka edellyttävät TCID50: n lukemista, saattavat tarvita lisävaiheita optimointiin, sekä parhaiden biologisten olosuhteiden määrittämiseksi, jotka varmistavat viruksen lisääntymiskelpoisten määrien keruun (esim. valittu solulinja, levymuoto, infektioiden moninaisuus, aikapisteet) ja paras pitoisuusalue tcid50-määrityksellä testattavaksi (esim.aloituspitoisuus ja laimennuskertymä).
Sellikuolema vai kivoja kuvia?
kuolleiden solujen laskeminen ei ole helppoa, sillä hyvin usein ne hylkäävät levyn jo ensimmäisellä pesulla – oletetaankin niiden olevan vielä siellä! Tämä ei auta tarkkuudessa. Vaikka kalliimpaa ja työlästä, aina kun Hyvä vasta-aine on saatavilla, immunofluoresenssivärjäys on lähestymistapa, että olisimme yleensä valita. Määritys voidaan lopettaa ennen solukuolemaa ja herkkyys on yleensä suurempi, mikä mahdollistaa suuremman kontrollin ja suuremman tarkkuuden. Lisäksi tätä menetelmää voidaan käyttää viruksille, jotka eivät aiheuta CPE: tä tai jotka kestävät kauan (ja antaa kohdata sen, joitakin mukavia kuvia viruksesta toiminnassa ovat paljon kohottavampia!). Soluvauriot ovat kuitenkin useimpien infektioiden ja useiden uusien virusten tavaramerkki, joista tiedämme hyvin vähän. Useita kolorimetrisiä/fluoresoivia toimittajia on nyt saatavilla, jotta voidaan herkästi mitata ja erottaa eri sytotoksisuustyypit. Näyttää siltä, että tämä vanha klassikko on jopa uusia haasteita!