tetrahydrofolaattisidonnaisen dihydrofolaattireduktaasin kiderakenne paljastaa hitaan vapautumisen alkuperän

endogeenisen (6s)-5,6,7,8-tetrahydrofolaattisidonnaisen E. colin DHFR-kompleksin eristäminen kiteyttämällä

edhfr:n rakenne:FH4 binäärikompleksi määritettiin molekyylikorvauksella käyttäen edhfr:folaatti: NADP+ suljettu ternaarikompleksi (PDB Id: 7dfr)50. Kuten kuvassa. 2, kirkas elektronitiheys vahvistaa yhteisesti puhdistetun endogeenisen ligandin FH4: ksi perustuen sp3 C6: n tetraedriseen geometriaan, joka on yhdenmukainen 6s-stereoisomeerin kanssa. Tämä on vastakohta SP2 C6: n trigonaaliselle tasogeometrialle FH2-binäärikompleksissa, joka on saatu samanlaisista kiteytymisolosuhteista.

Edhfr:n ligandirakenteiden Vertailu: FH4 (vihreä, yläluku) ja eDHFR:FH2 (oranssi, alaluku) komplekseja. Ligandien ympärille muotoillut fo-Fc omit-elektronitiheyskartat esitetään tasolla 3,0 σ. Oikealla olevia näkymiä kierretään 90° vastapäivään pystyakselin ympäri vasemmalla näkyvistä näkökulmista. FH4 ja FH2 esitetään tikkuina. C6-hiiliatomi on väriltään magentan värinen, ja sen eri hybridisaatiotilat FH4: ssä ja FH2: ssa osoitetaan magentan osoittavilla nuolilla. Kaikki muut atomit väritetään seuraavasti: happi punaisena, typpi sinisenä, hiili vihreänä ja oranssi vastaavasti FH4 ja FH2. Vain muut kuin vetyatomit esitetään katselun yksinkertaisuuden vuoksi

yrittäessään ymmärtää, miksi saamme FH4-kompleksin, kun taas toiset ovat epäonnistuneet, tunnistimme, että kahden eri ligandikompleksin alkuperä (FH4 vs. FH2) on kidehakkuun ajoitus ja siten kidekasvun kesto. A time course study esitetty Fig. 3 joka seuraa muutoksia elektronitiheydet sidottu ligandin eri päivinä Kiteen kasvun paljasti, että FH4 FH2 hajoaminen (heijastuu sp3 sp2 siirtyminen C6 asemassa) tapahtui noin 2-3 päivän kuluttua kiteytys perustettu.

Stereonäkymät ajan kulusta Fo-Fc jättää elektronitiheyskartta muutokset vastaavat muuntaminen FH4 FH2. Ligandien ympärille muotoillut fo-Fc omit-elektronitiheyskartat esitetään tasolla 3,0 σ. EDHFR:FH4 binäärikompleksikiteitä kasvatettiin pimeässä huoneenlämmössä. Jokaisella ajankohdalla yksittäisestä kidepisarasta kerättiin salamajäädytyksellä yksittäinen kide Röntgendiffraktiota varten. FH4: n ja FH2: n täysin puhdistettujen binäärikompleksirakenteiden ligandirakenteet 2 ja 14 päivän kohdalla esitetään kussakin kuvassa viittauksina verrattaessa elektronitiheyden muutokseen. Poistetut kartat kiteistä, jotka on korjattu 3 ja 6 päivän kuluttua, on luotu alkuperäisen rakenteellisen tarkennuksen jälkeen lisäämättä ligandeja tai liuottimia. Proteiinirakenteiden superpositio suoritettiin käyttämällä pymol69: ää

tämä on tietääksemme ensimmäinen kerta, kun Aito FH4-sidottu yhden verkkotunnuksen DHFR-kompleksi on eristetty. Olemme validoineet protokollan toistamaan edhfr:FH4-kompleksin kiteytymisen ja vahvistaneet FH4: n ja FH2: n hajoamisen ajankulun vähintään kahdella erillisellä toistolla kullakin kidehakkuun ajankohdalla (täydentävä Kuva. 1). Ligandin hajoamisen aikaradalla olevat välielektronitiheydet osoittavat selvästi sp3-sp2-siirtymän C6-asemassa ja sidotun ligandin bentsoyylirenkaan samanaikaisen pyörimisen (Fig. 3). Tämä voi muistuttaa siirtymätilan ligandikonformaatiota eteenpäin suuntautuvassa katalyyttisessä suunnassa. Havaittu FH4: n ja FH2: n hajoaminen kidekasvun aikana ei todennäköisesti heijasta DHFR: n aiheuttamaa käänteistä katalyysiä, jossa FH4 muuttuu FH2: ksi. Se ei myöskään todennäköisesti indusoidu valosta, sillä kiteytymispisarat inkuboituivat huoneenlämmössä pimeässä Kiteen kasvun aikana, ja FH4: n ja FH2: n hajoamisen ajallinen kulku on päivien luokkaa. Olemme myös testanneet co-kiteytys pelkistäviä aineita ditiotreitol(DTT) tai Tris (2-karboksietyyli)fosfiini (TCEP) 2-3 mM pitoisuus sekä käyttöön DTT tai TCEP jopa 20 min Kiteen liotus ennen sadonkorjuuta 2 päivää, 3 päivää, 14 päivää jopa 7,5 kuukautta. Nämä menetelmät eivät myöskään vaikuttaneet ligandien elektronitiheyden laadullisten muutosten toistettavuuteen edhfr:FH4-kompleksin hajoamisajan kuluessa tässä tutkimuksessa yksilöidyssä kiteisessä muodossa (täydentävä Kuva. 1). Siten on todennäköistä, että nykyinen kiteytymisprotokolla ensisijaisesti kiteyttää endogeenisen FH4-kompleksin, joka on yhdessä puhdistettu edhfr-proteiininäytteissä, ja sen hajoaminen kiteessä on peruuttamatonta testaamissamme olosuhteissa, todennäköisesti hapettumisen vuoksi äärellisellä happitasolla. Vaikka nopea eteenpäin katalyyttinen reaktio tuottaa FH4 alkaen FH2 on termodynaamisesti suositaan läsnä ylimäärä NADPH kuin In vivo, hidas hajoaminen FH4 monimutkainen takaisin FH2 monimutkainen voi tapahtua ilman jatkuvaa tarjontaa NADPH kuten havaitsimme täällä alle vitro kiteytys kunnossa. Siksi mysteeri, miksi pitkään tavoiteltu FH4-kompleksi oli vaikea saada, paljastuukin sen luontaiseksi epävakaudeksi. On hyvin todennäköistä, että avain onnistumiseemme kemiallisesti labiilin FH4-kompleksirakenteen saamisessa on hyvin diffraktoivien kiteiden oikea-aikainen korjuu 2 päivän kuluessa kasvusta tässä yksilöidyssä kiteytymisvaiheessa. Lisäksi DHFR-kentän tutkimus osoittaa, että monet kristallografiset 19,20,24,28,29,32,43,45,47,48,50,51,52 ja NMR12,13,15,17,19,25,26 tutkimukset DHFR sovellettu dialyysi poistaa endogeenisia ligandeja ennen käyttöönottoa eksogeenisia ligandeja kiinnostavia. Tunnistimme kiteytymistilan, joka eristää endogeenisen FH4-sitoutuneen DHFR-kompleksin ilman proteiininäytteen dialyysihoitoa tai lisäalustojen tai-tuotteiden tuomista. Oletamme, että nykyinen kiteytymisehto eDHFR:FH4-kompleksille suosii FH4-sidottua muotoa muihin muotoihin, kuten eDHFR:FH2:NADP(H) – kompleksiin.

Edhfr:n rakenteellinen Luonnehdinta: FH4-kompleksi

FH4-kompleksi omaksuu edhfr: ssä piilevän konformaation (KS. 4 ja 5). Tämä on yhtäpitävä aiempien havaintojen kanssa, jotka viittaavat siihen, että kaikki katalyyttisen syklin maatilan FH4 binääriset ja ternaariset kompleksit (hydridin siirron jälkeinen ja sp2: n ja sp3: n muuntaminen C6: ssa) esiintyvät okkluusioformaatioissa. Tämä johtuu FH4: n kallistetun pteriinirenkaan STEERISESTÄ Yhteentörmäyksestä NADP(H): n nikotiiniamidirenkaan kanssa, joka tapahtuisi met20-silmukan suljetussa konformaatiossa (Kuva. 5)12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,35,36,37,38. Kuten kuvassa. 4, FH4: llä on van der Waals-kontakteja ja suotuisia polaarisia vuorovaikutuksia aktiivisen sivuston jäämien ja vesien kanssa. Erityisesti kaksi bidentaattisuolasiltaa, joissa on Asp27 ja Arg57, ankkuroivat FH4: n molemmat päät, aminopyrimidiinin (N3 ja eksosyklinen NH2) ja α-karboksylaatin, lähes identtisiin asentoihin kuin substraatti-analogisissa komplekseissa12, 20,24,45.

edhfr:FH4-kompleksin aktiivinen sijaintirakenne näkyy stereonäkymissä. sivuketjut (Syaani) 4 Å: n sisällä FH4: stä (vihreä) ja met20-silmukka (keltainen) esitetään tikkuina. Toissijaiset rakenteet näkyvät sarjakuvina harmaina, ja vedet 3,5 Å: n sisällä FH4: stä palloina. Polaariset interaktiot FH4: n kanssa on osoitettu katkoviivalla. Fo–Fc: n elektronitiheyskartta, josta puuttuu FH4, esitetään 3,5 σ: n tasolla punaisella ja 2Fo-Fc: n omit-kartta 1,0 σ: n tasolla sinisellä jäämien ja vesien osalta. Ile14-Gly15 amide-linkkien kolme konformia on merkitty katkeavalla ympyrällä ja punaisilla nuolilla. B laajennettu näkymä Ile14-Gly15-yhteydestä

FH4-kompleksin superpositio FH2-ja FH4-analogisilla komplekseilla. Nykyiset FH4 -, FH2-ja raportoidut eDHFR-kompleksit ja raportoidut 5-formyyli-FH4-kompleksit sekä niiden okkluusiot Met20-silmukkakonformaatiot, Phe31-jäämät ja vastaavat ligandit ovat värillisiä vihreillä, magentoilla ja keltaisilla. Kaikki muut PDB-tunnusten rakenteet: 1dyj (ddFH4)45, 5CCC (ddFH4:NADP+)12, 1RF7 (FH2)24, 4PDJ (FH2:NADPH)20 ja 4PSY (folaatti:NADP+)20 ovat väriltään harmaita. Punainen katkeava ympyrä osoittaa ehdotetut π–π-vuorovaikutukset Phe31: n ja ligandibentsoyyliryhmien välillä, jotka omaksuvat kaksi erillistä orientaatiota sidottujen ligandien mukaan. FH4 ja 5-formyyli-FH4 kuuluvat yhteen klusteriin toisin kuin ddFH4, FH2 ja folaatti, kun taas Phe31-sivuketjut pysyvät lähes samassa asennossa kaikissa linjassa olevissa rakenteissa. Met20-silmukat luokitellaan kolmeen yleiseen konformaatiotilaan, suljettuihin, osittain suljettuihin ja okkluusioihin. NADP(H) – kofaktorin nikotiiniamidiryhmä pääsee rakenteellisesti aktiiviseen kohtaan vain suljetuissa konformaatioissa.

kaksi vesimolekyyliä yhdistää Met20-silmukan ja FH4: n vetysidosverkon kautta, jossa on Gly15 (C = O)-wat1-FH4(N5) ja Glu17(NH)-wat2-FH4(N10) (Fig. 4). Näitä yhteisvaikutuksia ei esiinny aiemmin raportoiduissa (6R)-5,10-dideatsatetrahydrofolaatti (ddFH4) – komplekseissa12,45 johtuen N-C-korvautumisesta analogisessa kohdassa 5 ja 10. Tämä saattaa aiheuttaa analogisessa Met20-konformaatiossa havaitun eron FH4-kompleksiin verrattuna (Fig. 5). Ainoat saatavilla olevat rakenteet PDB: ssä, jotka muistuttavat läheisesti Met20-silmukkakonformaatiota FH4-kompleksissa, ovat 5-formyyli-FH4-kompleksi (Fig. 5, PDB ID: 1JOM) 51 ja kaksi eDHFR-nanobody allosteerista inhibitorista kompleksia, jotka kohdistuvat eri DHFR-epitooppeihin, joilla on nanomolaarinen affiniteetti(täydentävä Kuva. 2, PDB-tunnukset: 3K74 ja 4EIG) 28,29. 5-formyyli-FH4-kompleksi säilyttää siltaveden Glu17: n(NH) ja FH4: n(N10) välillä kuten FH4-kompleksissa, huolimatta niiden erilaisista tilaryhmistä P61 ja P212121. 5-Formyyli-FH4, joka tunnetaan myös foliinihappona tai leukovoriinina, on FDA: n hyväksymä ”rescue”-lääke metotreksaatin haitallisten vaikutusten estämiseen kemoterapian aikana53. FH4: n γ-karboksyyliryhmä näyttää vain vähän elektronitiheyttä (Kuva. 4), mikä viittaa häiriöön tai vapaampaan sidoksen kiertoon Cß-Cy-tai Cy-cδ-C-akselin ympäri kuin muissa ligandien osissa.

vesiverkoston lisäksi FH4-kompleksin ja hitaan tuotejulkistuksen stabiloivien vuorovaikutusten rakenteellinen alkuperä löytyi nykyisten FH4-ja FH2-binäärikompleksien ja aiemmin raportoitujen eDHFR-rakenteiden rakenteellisen vertailun perusteella. Ensinnäkin van der Waalsin kosketus Glu17-sivuketjuun johtaa FH4: n lisäsuojaukseen liuottimelta (Kuva. 4) joka puuttuu substraatissa tai tuotteen analogisessa (6R)-5,10-dideatsatetrahydrofolaattikompleksissa 12,20,24,45. Toiseksi säilyneen Ile14-Gly15-amidiliitoksen kolmen vaihtoehtoisen runkokonformaation selkeä elektronitiheys viittaa entropiseen vaikutukseen FH4-kompleksin stabiilisuuteen Met20-silmukan ankkurin paikallisella joustavuudella (Kuva. 4). Erityisesti aiemmat mutageneesitutkimukset osoittivat, että Ile14 on ratkaisevan tärkeä met20-silmukan joustavuuden hallitsemiseksi, kun taas i14v -, I14A-ja I14G-muunnokset osoittivat kaikissa hitaamman hydridin siirtonopeuden, met20-silmukan suuremman joustavuuden, joka on havaittu avoimessa konformaatiossa kiderakenteissa, primaarisen kineettisen isotooppivaikutuksen lisääntyneen lämpötilariippuvuuden ja korkeamman siirtymätilan aktivaatioenergian,joka lasketaan hybrideistä QM/MM simulaatioista23, 40. Kolmanneksi bentsoyylirenkaan kiertyminen johtaa elektrostaattisesti suotuisiin reuna-vastakkain π-π-vuorovaikutuksiin FH4-kompleksissa säilyneen Phe31: n kanssa toisin kuin FH2 -, folaatti-ja ddFH4-komplekseissa protoni-near-protoni (reunasta reunaan) – repulsiivisiin vuorovaikutuksiin riippumatta NADP(H) – sitoutumisesta (Fig. 5, laajennettu näkymä, kuva. 6)54,55. Tämän rakennemuutoksen funktionaalista vaikutusta tukee myös havainto bentsoyylirenkaan samanaikaisesta pyörimisestä ja SP3: sta sp2: een siirtymisestä sidotun ligandin C6-asemassa FH4: n ja FH2: n hajoamisen aikana kompleksissa (Fig. 3). Phe31: n roolia tuotteiden vapautumisen valvojana tukevat myös aiemmat mutageenitutkimukset56, jotka osoittivat, että edhfr: n f31v-ja F31Y-muunnokset osoittivat kcat: n vakaan tilan nopeusvakion kaksinkertaistuneen ja valmisteen vapautumisnopeuden nousseen arviolta 20 – 50-kertaiseksi sen lisäksi, että mutaatiot hidastivat hydridin siirtoa.

π-π-järjestelmien sähköstaattiset vuorovaikutukset. Katso lisätietoja viite 54,55

kun otetaan huomioon tietyn E. coli DHFR-järjestelmän dynaamiset ominaisuudet, tässä havaittu edhfr:FH4-kompleksin stabiili okkluusio (alhaisen vapaan energian Välituote dynaamisessa maisemassa) voi kohtuudella olla tuotteen hitaan vapautumiskinetiikan taustalla (FH4-dissosiaation Koff-nopeus, edhfr-katalyyttisyklin nopeutta rajoittava vaihe). Aiempien NMR: n relaksaatiohajontatutkimusten mukaan E. coli DHFR: n katalyyttisen syklin jokainen vaihe noudattaa ”konformaatiovalintaa” eikä ”indusoitua sopivuutta” mekanismia15. Näin ollen kunkin vaiheen mikroskooppinopeus reaktiokoordinaatistossa riippuu entsyme15: n konformaationäytteenottonopeudesta (esim.siirtymätilasta, joka on toimivaltainen nopeassa hydridin siirrossa tai nopeutta rajoittavassa tuotteen vapautumisessa). Tämä merkitsee sitä, että mitä vakaampi maan tila ja mitä erilaisempi se on viritetystä sähköasemasta, sitä suurempi on tällaisten konformaatioiden näytteenottoon vaadittava vapaa energiakustannus. EDHFR: n osalta tämä edellyttää aktiivisen kohdan uudelleenjärjestelyä ja joustavaa Met20-silmukkaa. EDHFR15: n NMR-relaksaatiohajontatutkimuksissa ehdotettiin, että hydridin siirtokemikaalivaiheen alipopuloitu viritetty tila hyväksyy okkluusiorakenteen (jonka maatila Michaelis-kompleksi on suljetussa konformaatiossa). Tuotteen vapautusvaiheen alapopuloitu viritetty tila hyväksyy kuitenkin suljetun konformaation (jonka maatila FH4-kompleksi on okkluusiossa). Reaktiokoordinaatistossa nykyisin havaittu edhfr:FH4-binäärikompleksi sijaitsee edhfr:FH4:NADP+ – ja eDHFR:FH4: NADPH-välikompleksien välissä (Kuva. 1). Molemmat hyväksyvät okkluusiot, joissa kofaktorin nikotiiniamidiosa osoittaa poispäin aktiivisesta sijaintipaikasta15. Näytteen saamiseksi ”suljetusta viritetystä sähköasemasta” nopeusrajoittavan tuotteen vapautumisvaiheen 15 aikana on tapahduttava aktiivinen alueen uudelleenjärjestely piilevästä maatilasta. Tätä edustaa tässä tutkimuksessa saatu stabiili katalyyttinen Välituote eDHFR: FH4. FH4:n tuotteen dissosiaationopeus Koff kasvoi kofaktorin sitoutuessa edhfr:FH4:NADP+-arvoon verrattuna eDHFR:FH4-arvoon ja edhfr:FH4: NADPH-arvoon verrattuna eDHFR: FH4-arvoon.:FH4 mitattuna sekä pH 6: ssa että pH 9: ssä kilpailukokeilla 35. Tämä viittaa nopeampaan tuotteen vapautumiseen ja lisääntyneeseen konformaationäytteenottonopeuteen, kun kofaktori sitoutuu. Vaikka aito eDHFR:FH4:NADPH ternary complex ground state structure ei ole koskaan raportoitu ennen, oletamme, että siellä voi olla huomattavaa samankaltaisuutta edhfr: FH4 binary complex, koska kaikki FH4-sidottu maahan väli-valtioiden hyväksyä okkluusiota konformaatio15. Odotamme kuitenkin, että kofaktorisidonta lisää jännittyneiden substaattien populaatiota, jota on aiemmin ehdotettu NMR: n relaksaatiohajontatutkimusten perusteella suljetuksi konformukseksi15. Tämän mukaisesti havaitsimme, että edhfr:FH2:NADP(H) – rakenteen (joka määritetään myös tutkimuksessamme erillisissä kiteytysolosuhteissa) kolmiosaisessa kompleksissa Met20-silmukka muuttui sekavaksi. Tämä viittaa yleinen mekanismi kofaktori helpotti ligandin vaihto tehostamalla konformaatio näytteenottotaajuus, kun kofaktori on sitoutunut sen nikotiiniamidi osa osoittaa pois aktiivisesta paikasta.

FH4-kompleksissa FH4–bentsoyylirenkaan (C1ʹ) ja Phe31: n (Cz) välinen etäisyys on 4,93 Å, joka on huomattavasti lyhyempi (~0,3-0,6 Å) kuin vastaavat etäisyydet nykyisissä FH2-ja aiemmin ilmoitetuissa FH2-komplekseissa (PDB ID: 1rf7, 4PDJ)20,24, jotka ovat vastaavasti 5,22, 5,55 ja 5,32 Å. Samanlainen edhfr: n reaktiokoordinaatiston matkan lyhenemisen suuntaus korostui kahdessa riippumattomassa laskennallisessa tutkimuksessa. Qm / MM-tutkimuksessa laskettiin, että vastaava etäisyys lyhenee ~0,3 Å: lla Michaelis-kompleksista siirtymätilaan hydridin siirtoreaktion tapahtuessa ja että tässä etäisyydessä (~0,01 Å) on vain vähän eroa siirtymätilan ja reaktiotuotteen27 välillä. Toinen tutkimus, jossa käytettiin kvantti – /klassista molekyylidynamiikkaa, ehdotti vastaavan etäisyyden dramaattisempaa lyhentämistä ~1 Å: lla, kun reaktio kehittyy reaktantista siirtymätilaan18. Siksi kristallografiset havaintomme ovat yleisesti yhtäpitäviä aiemman laskennallisen mallinnuksen kanssa, mikä viittaa siihen, että FH4-kompleksi säilyttää tietyssä määrin siirtymätilan fysikaalisen luonteen. Tämä on myös yhdenmukaista eDHFR: n dynaamista energiamaisemaa koskevien aiempien havaintojen kanssa, jotka on kartoitettu NMR: n relaksaatiohajonnalla, jonka mukaan jokainen katalyyttisyklin Välituote ottaa näytteitä matalista viritetyistä tiloista, joiden konformaatiot muistuttavat edeltävien tai seuraavien välituotteiden maatilarakenteita15. Koska entsyymit vakauttavat siirtymätilaa, DHFR-perheen hidas tuotteen vapautuminen saattaa johtua siirtymätilan fysikaalisen luonteen siirtymisestä reaktiotuotekompleksiin. Tähän viittaa tässä määritetty pitkään tavoiteltu FH4-kompleksi, katalyyttisyklin aikana vaadittavien lajikohtaisten konformaatiomuutosten lisäksi 32.

Luonnehdinta eDHFR: n okkluusiokompleksista, jolla on nanomolaarinen sitoutumisaffiniteetti hitaasti alkava inhibiittori

Röntgenkristallografia osoittaa, että edhfr: n kompleksissa, jossa on hitaasti alkava tiukka inhibiittori AMPQD46, näkyy myös okkluusiorakenne. Met20-silmukka hyväksyi konformaation AMPQD-kompleksissa, joka muistuttaa ternaarikompleksin konformaatiota diabeteslääkkeiden biguanidifenformiinin ja NADP+: n kanssa (PDB ID: 5UIH)52. Toisaalta FDA: n hyväksymä kemoterapeuttinen aine metotreksaatti osoitettiin aiemmin Röntgenkristallografialla 24,47, NMR48 ja yksimolekyylisellä kinetiikalla49 sitoutumaan suljettuun DHFR-konformaatioon (Kuva. 7). Tämä poikkeama proteiinien konformaatioissa oli odottamaton, koska kaikilla kolmella inhibiittorilla on yhteinen rakenteellinen piirre: fenformiinin biguanidiryhmä, ampqd: n diaminopyrimidiiniryhmä ja metotreksaatin diaminopteriiniryhmä, joista jokainen liittyy fenyyliryhmään, jossa on joustava linkeri. Kuitenkin tarkka tutkimus vastaavien eDHFR-inhibiittorikompleksien rakenteellisesta superpositiosta (Fig. 7) osoitti, että metotreksaatin metyyliamino-yhteysryhmällä (ei esiinny fenformiinissa ja AMPQD: ssä) oli asema, joka johtaisi mahdolliseen steeriseen yhteentörmäykseen Met20-silmukan kanssa, jos se omaksuisi okkluusiorakenteen kuten fenformiini-ja AMPQD-komplekseissa. Aiemmin osoitimme, että AMPQD osoitti suhteellisen korkeamman mieltymyksen (IC-50: n ja Ki: n kolminkertainen väheneminen) edhfr: n estämisessä ihmisen DHFR46: een verrattuna. Vielä suurempi lajispesifisyys E: lle. coli yli ihmisen DHFR (~30-kertainen) on havaittu kanta yhdiste AMPQD, joka puuttuu aminofenyylihäntä ryhmä ja metyleeni linker46. EDHFR: n okkluusiokompleksin nykyinen kiderakenne AMPQD: n kanssa antaa uskottavan mekanistisen selityksen sen lajispesifisyydelle, joka johtuu ihmisen DHFR: n ja eDHFR: n konformaatiotasapainon eroista. Edellinen havaitaan yksinomaan suljetuissa konformaatioissa, kun taas jälkimmäinen osoittaa korkeamman konformaatiomaisen joustavuuden näytteenoton sekä suljetuissa että okkluusioiduissa konformaatioissa, kuten Seuraavaksi käsitellään.

Edhfr:n rakenne: AMPQD-estokompleksi. Stereonäkymä aktiivisen kohteen vuorovaikutuksesta AMPQD: n kanssa Fo–Fc omit-kartan kanssa 3.5 σ-tasolla. Proteiinin sivuketjut (Syaani) 4 Å: n sisällä AMPQD: stä (vihreä) on esitetty tikkuina, mukaan lukien kaksi jäämää Met20-silmukasta (keltainen). Polaariset vuorovaikutukset on merkitty katkoviivalla. b Ampqd: n (vihreä), fenformiinin (keltainen, PDB: 5UIH)52 ja metotreksaattikompleksien superpositio (harmaa näkyy ohuina tikkuina PDB: 1RA3, 1dds)20,47. Met20-silmukat näkyvät sarjakuvina ja ligandit tikkuina. Ligandien kemialliset rakenteet piirretään päälle. NADP (H) ei näy missään rakenteissa katselun yksinkertaisuuden vuoksi

Vertailu DHFR konformaatioita perustuu clustering

a clustering DHFR PDB rakenteiden käyttäen rmsd Met20 silmukka selkärangan Ca atomien kuin etäisyys metrinen (Kuva. 8 ja täydentävä Kuva. 3) osoittaa, että ihmisen DHFR hyväksyy yksinomaan suljetun konformaation (katalyyttisesti Pätevä NADPH: n sitomiseen), kun taas eDHFR on paljon joustavampi sekä suljettujen että okkluusioiden konformaatioiden kanssa. Okkluusiorakenteita esiintyy harvemmin (17%) eDHFR-rakenteissa. Sekä nopeutta rajoittava valmisteen vapautumiskompleksi FH4: llä että hitaasti alkava inhibitorinen kompleksi AMPQD: llä omaksuvat edhfr: n tukkeutuneen konformaation (Kuva. 9), joka on harvoin edustettuna PDB: ssä (täydentävä Kuva. 3). Mielenkiintoista on, että sekä FH4 että AMPQD jakavat nanomolaarisen affiniteetin ja edhfr35: n,36: n,46: n hitaan vapautumisen ominaisuudet keskeisten typpiatomien heterosyklien voimakkaasti säilyneen aseman ja hännissä ilmenevien erojen kanssa. Tämä viittaa uuteen strategiaan DHFR-inhibiittorien kehittämiseksi kohdistamalla okkluusioita eDHFR-konformaatioihin. Ehdotamme myös strategiaa lääkeresistenssin torjumiseksi. Kuten on esitetty täydentävässä Kuvassa. 4, vertaamalla konformaatio AMPQD FH4 ja trimetopriimi FH4, on hienovaraisia eroja van der Waals kirjekuoret. E. coli DHFR: n trimetopriimi eDHFR-pakovarianteissa on mutaatioita, jotka myös estävät AMPQD57: n inhibitorisen toiminnan. Tutkimalla vuorovaikutusten eroja voidaan etsiä muita ligandeja, jotka minimoivat nämä vuorovaikutuserot FH2: n ja FH4: n kanssa. Näin voidaan varmistaa, että mutaatiot, jotka vähentävät inhibiittorien sitoutumista, vähentävät myös FH2: n ja FH4: n sitoutumisaffiniteettia.

ryhmittely 162 DHFR rakenteita perustuu niiden pairwise Ca RMSD Met20 silmukoita. DHFR-rakenteita edustavat sinisellä (ihmiset), vihreällä (eDHFR) ja punaisella (tässä tutkimuksessa) täytetyt ympyrät. Reunan pituus (värillinen violetti okkluusiota ja kulta suljettuja konformaatioita, vastaavasti) on verrannollinen suurin rmsd met20 loop conformations. Katso tarkempi ryhmittelykaavio lisätiedoista

Ampqd: n (vihreä) ja FH4: n kompleksien (keltainen) superpositio. Met20-silmukat esitetään sarjakuvina ja ligandit tikkuina. Oikeanpuoleista näkymää käännetään 90° myötäpäivään pystyakselin ympäri vasemmanpuoleisesta perspektiivistä

eDHFR

edhfr:n kolmannen kompleksin luonnehtiminen lopuksi: FH2:NADP (H)ternaarinen kompleksi, jossa on sekä koepuhdistettu endogeeninen ligandi että kofaktorit (Kuva. 10), huomasimme, että Met20-silmukka muuttuu häiriöksi. Tämä tukee kofaktorin sitoutumisen roolia konformaationäytteenotossa nopeaa ligandin vaihtoa varten tai helpottaa tuotteen vapautumista allosteerisen mekanismin kautta (ts‡2, Fig. 1)12,13,14,15. Nikotiiniamidi-riboosiosa irtoaa aktiivisesta kohdasta (Kuva. 10)samanlainen kuin piilevä FH4 ternaarinen kompleksi12. Sen redox-tilaa ei tunneta elektronitiheyden perusteella. Kyky eristää erilaisia endogeenisiä ligandeihin sitoutuneita, binäärisiä ja ternaarisia eDHFR-komplekseja vaihtelevissa kiteytymisolosuhteissa viittaa siihen, että eDHFR sisältää molekyylilajien seoksen, jossa on erilaisia sidottuja ligandeja ja konformaatioiden kokonaisuus. Tässä käytetyn kristallografisen lähestymistavan tehokkuus hyödyntää molekyylien inhomogeenisuutta jättämällä pois dialyysivaiheen eristämään pitkään tavoiteltu ja kemiallisesti labiili FH4-kompleksinen kiderakenne. Tämä on ristiriidassa tyypillisen prosessin kanssa, johon liittyy DHFR-näytteiden esikäsittely dialyysillä, joka poistaa jälkiä endogeenisistä ligandeista ja lisää näytteen homogeenisuutta. Parannettu homogeenisuus yleensä parantaa yleistä onnistumisastetta co-kiteytys tai crystal liotus kokeiluja, kun ligandit kiinnostavat eksogeenisesti käyttöön.

STEREONÄKYMÄT DHFR: FH2: NADP (H) ternary complex. Häiriintynyt Met20-silmukka (jäämät Ile14: n ja Pro21: n välillä) on merkitty mustiksi katkoviivaiksi. Fo-Fc omit kartta 3.0 σ tasolla näkyy punainen mesh. Sekundaarirakenteet esitetään sarjakuvina ja ligandit tikkuesityksessä. Atomit väritetään seuraavasti: hiili (valkoinen), typpi (sininen), happi (punainen) ja fosfori (oranssi))