Le test ELISA donne trois types de données différents:
Quantitatif
Les données ELISA peuvent être interprétées par rapport à une courbe standard (une dilution en série d’un antigène connu purifié) afin de calculer avec précision les concentrations d’antigène dans divers échantillons (Figure 6).
Qualitatif
Les ELISAs peuvent également être utilisés pour obtenir une réponse oui ou non indiquant si un antigène particulier est présent dans un échantillon, par rapport à un puits vierge ne contenant aucun antigène ou un antigène témoin non apparenté.
Semi-quantitatif
Les ELISAs peuvent être utilisés pour comparer les niveaux relatifs d’antigène dans les échantillons d’essai, car l’intensité du signal varie directement avec la concentration d’antigène.
Courbe standard
Les données ELISA sont généralement représentées avec une densité optique vs une concentration en log pour produire une courbe sigmoïdale comme le montre la figure 6. Les concentrations connues d’antigène sont utilisées pour produire une courbe standard, puis ces données sont utilisées pour mesurer la concentration d’échantillons inconnus par comparaison à la partie linéaire de la courbe standard. Cela peut être fait directement sur le graphique ou avec un logiciel d’ajustement de courbe que l’on trouve généralement sur les lecteurs de plaques ELISA.
Fig. 6. Une courbe standard ELISA typique.
Modèles de courbes d’étalonnage
Si un résultat quantitatif est nécessaire, le moyen le plus simple de procéder est de faire la moyenne du triple des lectures des étalons et de déduire la lecture de l’échantillon témoin vierge. Ensuite, tracez la courbe standard, trouvez la ligne de meilleur ajustement ou au moins tracez une courbe point à point afin que la concentration des échantillons puisse être déterminée. Toutes les dilutions effectuées doivent être ajustées à ce stade. C’est généralement la mesure pratique dans laquelle le calcul manuel peut être effectué.
Une variante consiste à tracer les données en utilisant semi-log, log/log, log/logit et ses dérivés – les modèles logistiques à 4 ou 5 paramètres. L’utilisation de solutions logicielles / automatisées permet d’envisager des approches graphiques plus sophistiquées. L’utilisation de la régression linéaire dans un progiciel ajoute plusieurs possibilités de vérification supplémentaires; il est possible de vérifier la valeur R2 pour déterminer la qualité globale de l’ajustement. Pour la partie de la courbe où la relation de concentration à lecture a une relation linéaire, les valeurs de R2 > 0,99 représentent un très bon ajustement. La précision peut ensuite être encore améliorée en utilisant d’autres concentrations standard dans cette plage.
Un aspect du tracé linéaire est qu’il comprime les points de données sur les concentrations les plus faibles de la courbe standard, ce qui en fait la plage la plus précise (zone la plus susceptible d’atteindre la valeur R2 requise). Pour contrer cette compression, un diagramme semi-log peut être utilisé; ici, le log de la valeur de concentration (sur l’axe des abscisses) est tracé contre la lecture (sur l’axe des ordonnées). Cette méthode donne une courbe de données en forme de S qui distribue plus de points de données dans le motif sigmoïdal plus convivial.
Le type de tracé log/log (log de concentration contre log de lecture) parvient à linéariser davantage de la courbe de données. La plage de concentration standard faible à moyenne est généralement linéaire dans ce modèle, seule l’extrémité supérieure de la plage a tendance à s’incliner. Le log/logit et ses dérivées, les modèles logistiques à 4 ou 5 paramètres, sont plus sophistiqués nécessitant des calculs et des estimations plus complexes des valeurs max, min, CE50 et de pente. Le modèle à 5 paramètres nécessite en outre la valeur d’asymétrie.
Bien que ces modèles de courbes d’étalonnage puissent offrir des performances améliorées, un bon point de départ serait d’utiliser le graphique log-log avec une vérification du pourcentage de récupération (récupération d’analyte à partir d’échantillons dopés). Alternativement, au moins « réajuster » les valeurs de lecture de la courbe standard est souvent une approche « assez bonne ». Le moyen le plus simple de vérifier est de calculer les étalons d’étalonnage et de vérifier qu’ils se situent à moins de 20% de la valeur nominale de lecture. Une mise en garde est de ne pas se fier à de « bonnes » valeurs R2 et de trouver le modèle de courbe d’étalonnage qui fournit les meilleures valeurs de récupération pour les étalons.
Sensibilité ELISA
Les ELISA sont l’un des immunoessais les plus sensibles disponibles. La plage de détection typique pour un ELISA est de 0,1 à 1 fmole ou de 0,01 ng à 0,1 ng, la sensibilité dépendant des caractéristiques particulières de l’interaction anticorps-antigène. De plus, certains substrats tels que ceux produisant un signal chimiluminescent ou fluorescent amélioré peuvent être utilisés pour améliorer les résultats.
Comme mentionné précédemment, la détection indirecte produira des niveaux de signal plus élevés et devrait donc être plus sensible. Cependant, il peut également provoquer un signal de fond plus élevé, réduisant ainsi les niveaux de signal spécifiques nets.