La structure cristalline d’une dihydrofolate réductase liée au tétrahydrofolate révèle l’origine de la libération lente du produit

Isolement par cristallisation du complexe E. coli DHFR lié au tétrahydrofolate (6s)-5,6,7,8

La structure de la dihydrofolate réductase liée au tétrahydrofolate

Comparaison des structures de ligands des complexes eDHFR:FH4 (vert, figure du haut) et eDHFR: FH2 (orange, figure du bas). Les cartes de densité électronique omettant Fo–Fc profilées autour des ligands sont représentées au niveau 3,0σ. Les vues de droite sont tournées de 90° dans le sens antihoraire autour de l’axe vertical à partir des perspectives affichées à gauche. FH4 et FH2 sont représentés sous forme de bâtons. L’atome de carbone C6 est coloré en magenta, et ses différents états d’hybridation en FH4 et FH2 sont indiqués par des flèches de pointage magenta. Tous les autres atomes sont colorés comme suit: l’oxygène en rouge, l’azote en bleu, le carbone en vert et l’orange pour FH4 et FH2, respectivement. Seuls les atomes non hydrogène sont affichés pour simplifier la visualisation

Dans un effort pour comprendre pourquoi nous obtenons le complexe FH4, alors que d’autres ont échoué, nous avons identifié que l’origine des deux complexes de ligands différents (FH4 vs FH2) est le moment de la récolte des cristaux, et donc la durée de la croissance des cristaux. Une étude de parcours temporel illustrée à la Fig. 3 qui suit les changements de densités électroniques du ligand lié à différents jours de croissance cristalline a révélé que la désintégration FH4 à FH2 (reflétée dans la transition sp3 à sp2 en position C6) s’est produite environ 2-3 jours après la mise en place de la cristallisation.

Les vues stéréo du parcours temporel de Fo-Fc omettent les changements de carte de densité électronique correspondant à la conversion de FH4 en FH2. Les cartes de densité électronique omettant Fo–Fc profilées autour des ligands sont représentées au niveau 3,0σ. L’eDHFR:Les cristaux du complexe binaire FH4 ont été cultivés dans l’obscurité à température ambiante. À chaque instant, un monocristal provenant d’une goutte de cristal indépendante a été récolté par congélation éclair pour la diffraction des rayons X. Les structures de ligands de FH4 et FH2 de structures complexes binaires entièrement raffinées à 2 et 14 jours, respectivement, sont représentées sur chaque figure comme références à comparer avec la variation des densités d’électrons. Les cartes d’omission pour les cristaux récoltés à 3 et 6 jours ont été générées après un affinement structurel initial sans introduction de ligands ou de solvants. La superposition des structures protéiques a été réalisée à l’aide de PyMOL69

C’est la première fois à notre connaissance qu’un complexe DHFR à domaine unique lié à FH4 authentique est isolé. Nous avons validé le protocole de reproduction de la cristallisation du complexe eDHFR:FH4 et confirmé l’évolution temporelle de la désintégration de FH4 en FH2 par au moins deux répliques indépendantes à chaque point temporel de la récolte des cristaux (Fig. supplémentaire. 1). Les densités d’électrons intermédiaires le long du cours temporel de la désintégration du ligand montrent clairement la transition sp3 à sp2 en position C6 et la rotation concomitante du cycle benzoyle du ligand lié (Fig. 3). Cela peut ressembler à la conformation du ligand à l’état de transition dans le sens catalytique direct. La désintégration observée de FH4 en FH2 pendant la croissance cristalline ne reflète probablement pas la catalyse inverse par DHFR impliquant la conversion de FH4 en FH2. Elle n’est probablement pas non plus induite par la lumière, étant donné que les gouttes de cristallisation ont été incubées à température ambiante dans l’obscurité pendant la croissance cristalline, et que le cours temporel de la désintégration de FH4 à FH2 est de l’ordre de quelques jours. Nous avons également testé la co-cristallisation avec les agents réducteurs dithiothréitol (DTT) ou Tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP) à une concentration de 2-3 mM ainsi que l’introduction de DTT ou de TCEP pendant jusqu’à 20 min de trempage des cristaux avant la récolte à 2 jours, 3 jours, 14 jours jusqu’à 7,5 mois. Encore une fois, ces procédures n’ont pas affecté la reproductibilité des changements qualitatifs de la densité électronique du ligand le long du cours du temps de désintégration du complexe eDHFR:FH4 sous la forme cristalline identifiée dans cette étude (Fig. supplémentaire. 1). Ainsi, il est probable que le protocole de cristallisation actuel cristallise préférentiellement le complexe endogène FH4 co-purifié dans les échantillons de protéines eDHFR, et que sa désintégration dans le cristal soit irréversible dans les conditions que nous avons testées, probablement due à une oxydation à un niveau fini d’oxygène. Bien que la réaction catalytique rapide de production de FH4 à partir de FH2 soit favorisée thermodynamiquement en présence d’une quantité excessive de NADPH in vivo, la lente désintégration du complexe FH4 en un complexe FH2 peut se produire sans apport continu de NADPH comme nous l’avons observé ici dans la condition de cristallisation in vitro. Ainsi, le mystère de la raison pour laquelle le complexe FH4 longtemps poursuivi était difficile à obtenir se révèle être son instabilité intrinsèque. Il est très probable que la clé de notre succès pour obtenir la structure du complexe FH4 chimiquement labile est la récolte en temps opportun de cristaux bien diffractants dans les 2 jours de croissance dans la condition de cristallisation identifiée ici. En outre, une étude du champ DHFR indique que de nombreuses cristallographies19,20,24,28,29,32,43,45,47,48,50,51,52 et RMN 12,13,15,17,19,25,26 les études de DHFR ont appliqué la dialyse pour éliminer les ligands endogènes avant d’introduire les ligands exogènes d’intérêt. Nous avons identifié une condition de cristallisation qui isole le complexe DHFR endogène lié à FH4 sans dialyse de l’échantillon protéique ni introduction de substrats ou de produits supplémentaires. Nous postulons que la condition de cristallisation actuelle pour le complexe eDHFR: FH4 favorise la forme liée à FH4 par rapport à d’autres formes telles que le complexe ternaire eDHFR: FH2: NADP(H).

Caractérisation structurale du complexe eDHFR:FH4

Le complexe FH4 adopte une conformation occluse en eDHFR (voir Fig. 4 et 5). Ceci est cohérent avec les résultats précédents qui suggèrent que tous les complexes binaires et ternaires FH4 de l’état fondamental du cycle catalytique (transfert post hydrure et conversion sp2 en sp3 en C6) se produisent dans des conformations occluses. Cela est dû au choc stérique du cycle ptérine incliné de FH4 avec le cycle nicotinamide du NADP (H), qui se produirait dans la conformation fermée de la boucle Met20 (Fig. 5)12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,35,36,37,38. Comme indiqué à la Fig. 4, FH4 a des contacts de van der Waals et des interactions polaires favorables avec les résidus de site actifs et les eaux. En particulier, deux ponts de sel bidentate avec Asp27 et Arg57 ancrent les deux extrémités du FH4, de l’aminopyrimidine (N3 et exocyclique-NH2) et de l’α-carboxylate, respectivement, dans des positions quasi identiques à celles des complexes substrat/analogique12, 20, 24,45.

La structure du site actif du complexe eDHFR:FH4 est illustrée en vues stéréo. les chaînes latérales (cyan) à moins de 4 Å de FH4 (vert) et la boucle Met20 (jaune) sont représentées sous forme de bâtonnets. Les structures secondaires sont affichées sous forme de dessins animés en gris et les eaux à moins de 3,5 Å de FH4 sous forme de sphères. Les interactions polaires avec FH4 sont indiquées par des lignes pointillées. La carte de densité électronique Fo–Fc omettant FH4 est affichée à un niveau de 3,5 σ en rouge et la carte d’omission 2Fo–Fc à un niveau de 1,0 σ est affichée en bleu pour les résidus et les eaux. Les trois conformères des liaisons amides Ile14-Gly15 sont indiquées par un cercle en pointillés et des flèches rouges. b Une vue élargie de la liaison Ile14-Gly15

Superposition du complexe FH4 avec des complexes analogiques FH2 et FH4. Les complexes actuels FH4, FH2 et eDHFR rapportés et le complexe 5-formyl-FH4 rapporté ainsi que leurs conformations de boucle Met20 occlus, les résidus Phe31 et les ligands correspondants sont colorés en vert, magenta et jaune, respectivement. Toutes les autres structures des ID PDB : 1DYJ (ddFH4) 45, 5CCC (ddFH4: NADP +) 12, 1RF7 (FH2) 24, 4PDJ (FH2: NADPH) 20 et 4PSY (folate: NADP +) 20 sont colorées en gris. Le cercle en pointillés rouges indique les interactions π–π proposées entre Phe31 et les groupes benzoyles ligands qui adoptent deux orientations distinctes en fonction des ligands liés. FH4 et 5-formyl-FH4 appartiennent à un seul groupe contrairement à ddFH4, FH2 et folate, tandis que les chaînes latérales Phe31 restent presque à la même position dans toutes les structures alignées. Les boucles Met20 sont classées en trois états conformationnels généraux, fermés, partiellement fermés et occlus. Seules les conformations fermées peuvent structurellement accueillir le groupe nicotinamide du cofacteur NADP(H) entrant dans le site actif

Il existe deux molécules d’eau reliant la boucle Met20 et FH4 via un réseau de liaisons hydrogène impliquant Gly15 (C=O)-wat1-FH4 (N5) et Glu17(NH)-wat2-FH4 (N10) (Fig. 4). Ces interactions sont absentes dans les complexes (6R)-5,10-didéazatétrahydrofolate (ddFH4) rapportés antérieurement12,45 en raison du remplacement de N à C aux positions 5 et 10 de l’analogue. Cela pourrait entraîner la différence observée dans la conformation Met20 de l’analogue par rapport au complexe FH4 (Fig. 5). Les seules structures disponibles dans l’APB qui ressemblent étroitement à la conformation de boucle Met20 dans le complexe FH4 sont un complexe 5-formyl-FH4 (Fig. 5, PDB ID: 1JOM) 51 et deux complexes inhibiteurs allostériques eDHFR-nanobody qui ciblent différents épitopes DHFR avec une affinité nanomolaire (Fig. supplémentaire. 2, ID APB: 3K74 et 4EIG) 28,29. Le complexe 5-formyl-FH4 préserve l’eau de pontage entre Glu17 (NH) et FH4 (N10) comme dans le complexe FH4, malgré leurs différents groupes d’espace P61 et P212121 respectivement. Le 5-Formyl-FH4, également appelé acide folinique ou leucovorine, est un médicament de « sauvetage » approuvé par la FDA pour prévenir les effets nocifs du méthotrexate pendant la chimiothérapie53. Le groupe γ-carboxylique de FH4 présente peu de densité électronique (Fig. 4), suggérant un trouble ou une plus grande liberté de rotation de la liaison autour de l’axe Cß-Cy ou Cy-Cδ que dans d’autres parties des ligands.

En plus du réseau d’eau, nous avons trouvé l’origine structurelle des interactions stabilisantes dans le complexe FH4 et la libération lente du produit sur la base de la comparaison structurelle des complexes binaires actuels FH4 et FH2 et des structures eDHFR précédemment rapportées. Tout d’abord, le contact de van der Waals avec la chaîne latérale Glu17 entraîne un blindage supplémentaire du FH4 contre le solvant (Fig. 4) qui est absent des complexes analogiques de substrat ou de produit (6R)-5,10-didéazatétrahydrofolate 12,20, 24,45. Deuxièmement, la densité électronique claire de trois conformations alternatives du squelette de la liaison amide Ile14-Gly15 conservée suggère une contribution entropique à la stabilité du complexe FH4 à partir de la flexibilité locale au niveau de l’ancre de boucle Met20 (Fig. 4). Notamment, des études de mutagenèse antérieures ont montré qu’Ile14 est crucial pour contrôler la flexibilité de la boucle Met20, alors que les variantes I14V, I14A et I14G ont toutes montré un taux de transfert d’hydrure plus lent, une plus grande flexibilité de la boucle Met20 telle qu’observée dans une conformation ouverte dans les structures cristallines, une dépendance accrue en température de l’effet isotopique cinétique primaire et une énergie d’activation de l’état de transition plus élevée calculée à partir de simulations hybrides QM/mm23,40. Troisièmement, la rotation du cycle benzoyle conduit à des interactions π-π bord à face électrostatiquement favorables avec le Phe31 conservé dans le complexe FH4 contrairement aux interactions répulsives proton-proche proton (bord à bord) dans les complexes FH2, folate et ddFH4 indépendamment de la liaison NADP(H) (Fig. 5, vue agrandie, Fig. 6)54,55. L’implication fonctionnelle de ce changement structurel est également corroborée par l’observation de la rotation concomitante du cycle benzoyle et de la transition sp3 en sp2 à la position C6 du ligand lié pendant le cours temporel de la désintégration de FH4 en FH2 dans le complexe (Fig. 3). Le rôle de Phe31 dans le contrôle de la libération du produit est en outre corroboré par des études de mutagenèse précédentes56, qui ont démontré que les variantes F31V et F31Y de l’eDHFR présentaient une augmentation de deux fois la constante de vitesse à l’état d’équilibre kcat et une augmentation estimée de 20 à 50 fois la vitesse de libération du produit en plus de l’effet des mutations sur le ralentissement du transfert d’hydrure.

Interactions électrostatiques des systèmes π-π. Voir refs 54,55 pour plus de détails

Compte tenu des propriétés dynamiques du système DHFR particulier d’E. coli, le complexe eDHFR:FH4 occlus stable (un intermédiaire à faible énergie libre dans son paysage dynamique) observé ici peut raisonnablement sous-tendre la cinétique de libération lente du produit (taux de koff de dissociation de FH4, étape limite de vitesse du cycle catalytique eDHFR). Selon des études antérieures de dispersion de relaxation par RMN, chaque étape du cycle catalytique de la DHFR d’E. coli suit un mécanisme de  » sélection de conformation  » plutôt que d' » ajustement induit « 15. Par conséquent, la vitesse microscopique de chaque étape le long de la coordonnée réactionnelle dépend de la vitesse d’échantillonnage conformationnelle de l’enzyme 15 (par exemple l’état de transition compétent pour un transfert rapide d’hydrure ou une libération de produit limitant la vitesse). Cela implique que plus l’état fondamental est stable, et plus il est différent du sous-état excité, plus le coût d’énergie libre nécessaire pour échantillonner de telles conformations est important. Pour eDHFR, cela impliquera nécessairement la réorganisation du site actif et de la boucle Met20 flexible. Il a été proposé dans les études de dispersion de relaxation RMN de l’eDHFR15 que l’état excité sous-peuplé pour l’étape chimique de transfert d’hydrure adopte une conformation occluse (dont le complexe de Michaelis à l’état fondamental est dans une conformation fermée). Cependant, l’état excité sous-peuplé pour l’étape de libération du produit adopte une conformation fermée (dont le complexe d’état fondamental FH4 est dans une conformation occluse). Le long de la coordonnée réactionnelle, le complexe binaire eDHFR:FH4 actuellement observé réside entre les complexes intermédiaires eDHFR:FH4: NADP+ et eDHFR:FH4:NADPH (Fig. 1). Les deux adoptent des conformations occluses, où la fraction nicotinamide du cofacteur pointe à l’écart du site active15. Pour échantillonner le « sous-état excité fermé » au cours de l’étape de libération de produit limitant la vitesse 15, une réorganisation active du site à partir de l’état fondamental occlus doit se produire. Ceci est représenté par l’intermédiaire catalytique stable eDHFR: FH4 capturé dans cette étude. Le taux de dissociation koff du produit de FH4 a été augmenté lors de la liaison du cofacteur avec une augmentation de deux fois pour eDHFR: FH4: NADP + par rapport à eDHFR: FH4, et une augmentation de huit fois pour eDHFR: FH4: NADPH par rapport à eDHFR:FH4 mesuré à la fois à pH 6 et à pH 9 par des expériences de concurrence35. Cela indique une libération accélérée du produit et des taux d’échantillonnage conformationnels accrus lorsqu’un cofacteur est lié. Bien qu’une structure d’état fondamental du complexe ternaire eDHFR:FH4:NADPH authentique n’ait jamais été rapportée auparavant, nous émettons l’hypothèse qu’il peut y avoir une similitude appréciable avec le complexe binaire eDHFR:FH4, car tous les états intermédiaires du sol liés à FH4 adoptent une conformation occlusée15. Nous nous attendons cependant à ce que la liaison de cofacteurs augmente la population des sous-états excités, proposée précédemment sur la base d’études de dispersion de relaxation RMN pour être dans une conformation fermée15. En cohérence avec cela, nous avons observé que dans un complexe ternaire de la structure eDHFR: FH2: NADP(H) (également déterminé dans notre étude dans des conditions de cristallisation distinctes), la boucle Met20 est devenue désordonnée. Cela suggère un mécanisme général d’échange de ligands facilité par le cofacteur en augmentant le taux d’échantillonnage conformationnel lorsque le cofacteur est lié avec sa fraction nicotinamide pointant loin du site actif.

Dans le complexe FH4, la distance entre le cycle benzoyle FH4 (C1ʹ) et le Phe31 (Cz) est de 4,93 Å, ce qui est significativement plus court de (~0,3–0,6 Å) que les distances correspondantes dans les complexes FH2 actuels et FH2 précédemment rapportés (PDB ID: 1RF7, 4PDJ) 20,24, qui sont respectivement de 5,22, 5,55 et 5,32 Å. Une tendance similaire de raccourcissement de la distance le long de la coordonnée de réaction de l’eDHFR a été soulignée dans deux études informatiques indépendantes. Une étude QM/MM a calculé que la distance correspondante est raccourcie de ~ 0,3 Å du complexe de Michaelis à l’état de transition au fur et à mesure de la réaction de transfert d’hydrure et qu’il y a peu de différence de cette distance (~0,01 Å) entre l’état de transition et le produit réactionnel 27. Une autre étude utilisant la dynamique moléculaire mixte quantique / classique a suggéré un raccourcissement plus spectaculaire de la distance correspondante de ~ 1 Å à mesure que la réaction évolue du réactif à l’état de transition 18. Par conséquent, nos observations cristallographiques sont en accord général avec la modélisation informatique précédente suggérant que, dans une certaine mesure, le complexe FH4 préserve la nature physique de l’état de transition. Ceci est également cohérent avec les observations précédentes sur le paysage énergétique dynamique de l’eDHFR cartographié par dispersion de relaxation RMN selon laquelle chaque intermédiaire du cycle catalytique échantillonne des états excités de basse altitude dont les conformations ressemblent aux structures d’état fondamental des intermédiaires précédents ou suivants15. Étant donné que les enzymes stabilisent l’état de transition, la libération lente du produit de la famille des DHFR peut être attribuable au report de la nature physique de l’état de transition vers le complexe du produit de réaction. Ceci est suggéré à partir du complexe FH4 longtemps recherché déterminé ici, en plus des changements conformationnels spécifiques à l’espèce requis pendant le cycle catalytique 32.

Caractérisation d’un complexe occlus d’eDHFR avec un inhibiteur à début lent d’affinité de liaison nanomolaire

La cristallographie aux rayons X montre que le complexe d’eDHFR avec un inhibiteur serré à début lent AMPQD46 montre également la conformation occluse. La boucle Met20 a adopté une conformation dans le complexe AMPQD qui ressemble à celle du complexe ternaire avec un biguanide antidiabétique phenformine et NADP+ (PDB ID: 5UIH) 52. D’autre part, l’agent chimiothérapeutique approuvé par la FDA, le méthotrexate, a déjà été démontré par cristallographie aux rayons x24,47, RMN48 et cinétiques à une seule molecule 49 pour se lier dans la conformation DHFR fermée (Fig. 7). Cette divergence dans les conformations protéiques était inattendue car les trois inhibiteurs partagent une caractéristique structurelle commune: le groupe biguanide de la phénformine, le groupe diaminopyrimidine de l’AMPQD et le groupe diaminoptérine du méthotrexate, chacun relié à un groupe phényle avec un lieur flexible. Cependant, un examen attentif de la superposition structurelle des complexes inhibiteurs d’eDHFR correspondents (Fig. 7) ont montré que le groupe de liaison méthylamino du méthotrexate (absent dans la phenformine et l’AMPQD) occupait une position qui entraînerait un choc stérique potentiel avec la boucle Met20 s’il adoptait une conformation occluse comme dans les complexes phenformine et AMPQD. Nous avons précédemment démontré que l’AMPQD présentait une préférence relativement plus élevée (une diminution de trois fois de l’IC-50 et du Ki) pour l’inhibition de l’eDHFR par rapport au DHFR46 humain. Une spécificité d’espèce encore plus élevée pour E. coli sur DHFR humain (~30 fois) est observé pour le composé parent de l’AMPQD, qui n’a pas le groupe queue aminophényle et le lieur méthylène46. La structure cristalline actuelle du complexe occlus de l’eDHFR avec AMPQD fournit une explication mécaniste plausible de sa spécificité par espèce, attribuable aux différences d’équilibres conformationnels du DHFR humain par rapport à l’eDHFR. Le premier est observé exclusivement dans les conformations fermées, tandis que le second montre un échantillonnage de flexibilité conformationnelle plus élevé dans les conformations fermées et occluses, comme nous le verrons plus loin.

Structure de l’eDHFR : Complexe inhibiteur de l’AMPQD. une vue stéréo des interactions du site actif avec AMPQD avec la carte omit Fo-Fc à un niveau de 3,5σ. Les chaînes latérales protéiques (cyan) à moins de 4 Å d’AMPQD (vert) sont représentées sous forme de bâtonnets, y compris deux résidus de la boucle Met20 (jaune). Les interactions polaires sont indiquées par des lignes pointillées. b Superposition des complexes AMPQD (vert), phenformine (jaune, PDB: 5UIH) 52 et méthotrexate (gris représenté sous forme de bâtonnets minces de PDB: 1RA3, 1DDS) 20,47. Les boucles Met20 sont présentées sous forme de dessins animés et les ligands sous forme de bâtons. Les structures chimiques des ligands sont dessinées sur le dessus. NADP(H) n’est affiché dans aucune des structures pour une visualisation simplifiée

Comparaison des conformations DHFR basées sur le clustering

Un clustering de structures PDB DHFR utilisant le RMSD des atomes de Ca du squelette de boucle Met20 comme métrique de distance (Fig. 8 et la Fig. 3) indique que le DHFR humain adopte exclusivement une conformation fermée (catalytiquement compétente pour la liaison au NADPH), alors que l’eDHFR est beaucoup plus flexible avec des conformations fermées et occluses. Les conformations occluses sont moins fréquemment observées (17%) dans les structures eDHFR. Le complexe de libération de produit limitant la vitesse avec FH4 et le complexe inhibiteur à début lent avec AMPQD adoptent tous deux une conformation occluse de l’eDHFR (Fig. 9) qui est rarement représenté dans l’APB (Fig. 3). Fait intéressant, FH4 et AMPQD partagent les caractéristiques d’affinité nanomolaire et de libération lente de eDHFR35, 36, 46 avec la position des atomes d’azote clés sur les hétérocycles fortement conservés, et des différences évidentes dans les queues. Cela suggère une nouvelle stratégie pour développer des inhibiteurs de DHFR en ciblant les conformations eDHFR occluses. Nous proposons également une stratégie de lutte contre la résistance aux médicaments. Comme le montre la Fig. 4, en comparant la conformation de l’AMPQD à FH4 et du triméthoprime à FH4, il existe des différences subtiles dans les enveloppes de van der Waals. Les variantes d’échappement du triméthoprime eDHFR d’E. coli DHFR possèdent des mutations qui bloquent également la fonction inhibitrice de l’AMPQD57. En étudiant les différences d’interactions, on peut rechercher d’autres ligands qui minimisent ces différences d’interaction avec FH2 et FH4. Cela pourrait garantir que les mutations, qui diminuent la liaison inhibitrice, diminueront également l’affinité de liaison de FH2 et FH4.

Regroupement de 162 structures DHFR en fonction de leur RMSD Ca par paire des boucles Met20. Les structures DHFR sont représentées par des cercles remplis de bleu (humains), de vert (eDHFR) et de rouge (dans cette étude). La longueur du bord (colorée en violet pour les conformations occlusives et en or pour les conformations fermées, respectivement) est proportionnelle au RMSD maximal des conformeurs de boucle Met20. Veuillez consulter un diagramme de regroupement plus détaillé dans les Informations supplémentaires

Superposition des complexes AMPQD (vert) et FH4 (jaune). Les boucles Met20 sont présentées sous forme de dessins animés et les ligands sous forme de bâtons. La vue de droite est tournée de 90° dans le sens des aiguilles d’une montre autour de l’axe vertical à partir de la perspective montrée à gauche

Caractérisation d’un complexe ternaire d’eDHFR

Enfin, dans un eDHFR : FH2:Complexe ternaire NADP(H) avec ligand endogène co-purifié et cofacteurs (Fig. 10), nous avons constaté que la boucle Met20 devient désordonnée. Cela soutient le rôle de la liaison des cofacteurs dans l’amélioration de l’échantillonnage conformationnel pour un échange rapide de ligands ou la facilitation de la libération de produit via un mécanisme allostérique (TS‡2, Fig. 1)12,13,14,15. La fraction nicotinamide ribose s’éloigne du site actif (Fig. 10) semblable au complexe ternaire occlus FH412. Son état redox est inconnu en fonction de la densité électronique. La capacité d’isoler différents complexes eDHFR liés aux ligands endogènes, binaires et ternaires dans différentes conditions de cristallisation suggère que l’eDHFR contient un mélange d’espèces moléculaires avec différents ligands liés et un ensemble de conformations. L’efficacité de l’approche cristallographique appliquée ici tire parti de l’inhomogénéité moléculaire en omettant l’étape de dialyse pour isoler une structure cristalline complexe FH4 chimiquement labile et recherchée depuis longtemps. Cela s’oppose au processus typique impliquant un prétraitement des échantillons de DHFR par dialyse, qui élimine les ligands endogènes à l’état de traces et augmente l’homogénéité de l’échantillon. Une homogénéité améliorée améliore généralement le taux de réussite global des expériences de co-cristallisation ou de trempage des cristaux, lorsque les ligands d’intérêt sont introduits de manière exogène.

Vues stéréo du complexe ternaire DHFR: FH2: NADP(H). La boucle désordonnée Met20 (résidus entre Ile14 et Pro21) est indiquée sous forme de traits pointillés noirs. La carte d’omission Fo–Fc à un niveau σ de 3,0 est affichée sous forme de maille rouge. Les structures secondaires sont représentées sous forme de dessins animés et de ligands dans une représentation en bâtonnet. Les atomes sont colorés comme suit: carbone (blanc), azote (bleu), oxygène (rouge) et phosphore (orange)