Timeless TCID50: Une solution à de nombreux virus
Ce mois-ci, nous couvrons un vieux classique, le test de dose infectieuse de culture tissulaire 50, ou TCID50. Le test TCID50 est utilisé pour quantifier les titres viraux en déterminant la concentration à laquelle 50% des cellules infectées présentent un effet cytopathique (CPE). Tant que le virus d’intérêt provoque la mort cellulaire, ce dosage présente l’avantage d’être peu coûteux et facile à mettre en oeuvre même lorsque des anticorps spécifiques au virus ne sont pas disponibles. En fait, très peu d’informations sur le virus lui-même sont nécessaires, ce qui en fait un outil clé pour étudier les agents pathogènes nouveaux et émergents.
Test TCID50: qu’est-ce que c’est et comment l’utiliser
Dans un test TCID50, des dilutions en série d’un virus sont ajoutées sur des monocouches de cellules et laissées jusqu’à ce que le CPE soit visible. À ce stade, l’effet de la dilution en série sur les cellules peut être noté de manière discontinue ou continue. De manière discontinue, la dilution unique à laquelle 50% des cellules présentent du CPE est utilisée pour quantifier approximativement la quantité de virus présente dans le stock d’origine. C’est assez simple et ne nécessite pas d’analyse plus approfondie. Cependant, il est également livré avec un degré d’inexactitude, car il ne permet pas de distinguer avec précision dans la même dilution.
Des informations plus précises peuvent être obtenues de manière continue en utilisant une lecture colorimétrique, p.ex. substrat métabolique à absorbance spécifique, où la quantité de signal acquise est proportionnelle au nombre de cellules vivantes. Les valeurs d’absorbance des différentes dilutions peuvent ensuite être tracées dans une courbe dose-réponse de régression non linéaire continue, à partir de laquelle il sera possible d’extrapoler des valeurs TC50 plus précises. La méthode discontinue est suffisante si un titre précis n’est pas requis, ou pour déterminer quelle concentration de virus est nécessaire pour obtenir un certain pourcentage d’infection dans les dosages en aval (un avantage du TCID50 est qu’il peut être réalisé sur la lignée cellulaire d’intérêt, tant que le virus provoque des CPE). Cependant, même dans ces cas, il peut être préférable d’utiliser des plis de dilutions entre 1: 2 et 1: 5 pour améliorer la précision. Lorsqu’une quantification plus précise est nécessaire, par exemple lors de la comparaison de l’effet de différents traitements ou mutations sur les titres de virus, une méthode colorimétrique peut être préférée.
Des dilutions aux titres
Les valeurs TCID50 donnent une indication de la quantité de virus nécessaire pour avoir du CPE dans 50% des cellules. Mais comment passer de cela à la quantité réelle de virus par ml? La formule est assez simple, et elle consiste à multiplier la valeur TCID50 par 0,7. Ceci provient de la distribution de Poisson appliquée à l’infection virale qui stipule que, dans une lignée cellulaire entièrement permissive, la probabilité d’atteindre 50% d’infection est atteinte par une multiplicité d’infection d’environ 0,7. Ce n’est pas toujours vrai, mais c’est une bonne approximation pour la plupart des applications.
Les problèmes du comptage des virus
Aussi précis que l’on puisse l’être, le comptage des virus n’est jamais facile. Premièrement, les dilutions en série sont – par leur nature – une source d’erreur. Deuxièmement – et cela est particulièrement pertinent pour les titres de virus élevés – même le plus petit volume qui reste attaché à l’extrémité d’une pointe de pipette peut transporter suffisamment de particules virales pour faire une différence substantielle dans la quantification. Troisièmement, la variation biologique du système est élevée. Plaquez la même quantité de cellules, ajoutez la même quantité de virus, arrêtez l’infection en même temps, et le pourcentage d’infection peut être proche, mais jamais exactement le même.
Enfin, lors de l’évaluation d’un traitement qui (comme vous l’espérez !) diminue les titres de virus, la quantité de virus peut tomber en dessous du seuil de détection du test.
L’art de compter les virus
La bonne nouvelle est qu’une fois que vous connaissez vos problèmes, vous n’êtes pas loin d’une solution! La précision de la dilution en série peut être réduite par l’automatisation, mais même lorsque cela n’est pas disponible, quelques petits conseils peuvent faire la différence. Il s’agit notamment de changer les pointes de pipette et de ne jamais insérer une pointe de pipette plus profonde qu’un millimètre dans la dilution suivante, pour éviter de transporter accidentellement des traces de virus supplémentaires qui viennent de se coincer sur le plastique extérieur. Les répliques sont également importantes, et d’autant plus pour les dosages miniaturisés. les plaques à 96 puits permettent la manipulation simultanée de plusieurs échantillons d’une manière que des méthodes plus à faible débit (comme le dosage de la plaque) ne permettraient pas, mais elles présentent une variabilité supplémentaire, car les petits volumes sont encore plus sensibles aux problèmes discutés ci-dessus. Alors que les répliques techniques permettent de résoudre ce problème, chez VRS, nous essayons de mener des expériences qui nécessiteront un TCID50 colorimétrique en triple exemplaire biologique. Cela augmente la robustesse de l’approche et permet d’exclure des points parasites dans l’ensemble de données sans perdre de signification. Des valeurs précises de TC50 nécessiteront une régression dose-réponse non linéaire des données colorimétriques, que des programmes tels que GraphPad Prism peuvent facilement générer. Cependant, la capacité de tout logiciel à tracer ce type de courbe dépendra strictement de la qualité des données et des valeurs numériques proches des répliques. Une inspection visuelle des courbes et des valeurs TC50 générées est fortement recommandée pour corriger les situations où l’extrapolation a été faussée par des points de données erronés. Surtout, notre expérience suggère qu’au-delà des titrages standard des stocks de virus, les expériences qui nécessiteront une lecture du TCID50 peuvent nécessiter des étapes d’optimisation supplémentaires, à la fois pour déterminer les meilleures conditions biologiques qui assureront la collecte en amont de quantités reproductibles de virus (par ex. lignée cellulaire de choix, format de plaque, multiplicité d’infection, points temporels), et la meilleure gamme de concentrations à tester sur le test TCID50 (par exemple concentration de départ et pli de dilution).
Mort cellulaire ou belles images?
Compter les cellules mortes n’est pas facile, car très souvent elles abandonnent la plaque au premier lavage – supposées être toujours là en premier lieu! Cela n’aide pas à la précision. Bien que plus coûteuse et laborieuse, chaque fois qu’un bon anticorps est disponible, la coloration par immunofluorescence est l’approche que nous choisirions généralement. Le dosage peut être arrêté avant la mort cellulaire et la sensibilité est généralement plus élevée, ce qui permet plus de contrôle et une plus grande précision. De plus, cette méthode peut être utilisée pour les virus qui ne causent pas de CPE, ou qui prennent beaucoup de temps à le faire (et avouons-le, de belles photos d’un virus en action sont beaucoup plus édifiantes!). Les dommages cellulaires, cependant, sont la marque de la plupart des infections et de plusieurs virus émergents dont nous savons très peu de choses. Plusieurs marqueurs colorimétriques / fluorescents sont maintenant disponibles pour mesurer et distinguer de manière sensible les différents types de cytotoxicité. Il semble que ce vieux classique soit prêt à relever de nouveaux défis!