időtlen TCID50: egy megoldás sok vírusra
ebben a hónapban egy régi klasszikus, a Tissue Culture Infectious Dose 50 assay vagy TCID50. A tcid50 vizsgálatot a vírustiterek számszerűsítésére használják annak a koncentrációnak a meghatározásával, amelynél a fertőzött sejtek 50% – A mutat citopátiás hatást (CPE). Mindaddig, amíg a kérdéses vírus sejthalált okoz, ennek a vizsgálatnak az az előnye, hogy olcsó és könnyen megvalósítható akkor is, ha vírusspecifikus antitestek nem állnak rendelkezésre. Valójában nagyon kevés információra van szükség magáról a vírusról, ami kulcsfontosságú eszköz az új és feltörekvő kórokozók tanulmányozásához.
TCID50 assay: mi ez és hogyan kell használni
egy tcid50 assay során a vírus soros hígításait hozzáadják a sejtek egyrétegeihez, és addig hagyják, amíg a CPE nem látható. Ezen a ponton a Soros hígításnak a sejtekre gyakorolt hatása szakaszos vagy folyamatos módon értékelhető. Szakaszos módon az egyszeri hígítást, amelynél a sejtek 50% – a CPE-t mutat, az eredeti törzsállományban jelen lévő vírus mennyiségének megközelítőleg számszerűsítésére használják. Ez meglehetősen egyszerű, és nem igényel további elemzést. Ugyanakkor bizonyos fokú pontatlansággal is jár, mivel nem teszi lehetővé az azonos hígításon belüli pontos megkülönböztetést.
pontosabb információ folyamatos módon érhető el kolorimetriás leolvasással, pl. specifikus abszorbanciájú metabolikus szubsztrát, ahol a megszerzett jel mennyisége arányos az élő sejtek számával. A különböző hígítások abszorbanciaértékeit ezután egy folyamatos, nem lineáris regressziós dózis-válasz görbében ábrázolhatjuk, amelyből pontosabb TC50 értékeket lehet extrapolálni. A szakaszos módszer elegendő, ha nincs szükség pontos titerre, vagy annak meghatározására, hogy milyen víruskoncentrációra van szükség a fertőzés bizonyos százalékának megszerzéséhez a downstream vizsgálatokban (a TCID50 előnye, hogy a kérdéses sejtvonalon elvégezhető, mindaddig, amíg a vírus CPE-t okoz). Azonban még ezekben az esetekben is jobb lehet 1:2 és 1:5 közötti hígítási redőket használni a pontosság javítása érdekében. Ha ehelyett pontosabb számszerűsítésre van szükség, például a különböző kezelések vagy mutációk vírustiterekre gyakorolt hatásának összehasonlításakor, a kolorimetriás módszer előnyben részesíthető.
a hígításoktól a
titerekig a TCID50 értékek jelzik, hogy mennyi vírus szükséges a CPE-hez a sejtek 50% – ában. De hogyan lehet ebből a tényleges vírusmennyiséghez jutni ml-enként? A képlet meglehetősen egyszerű, és a TCID50 értéket 0,7-gyel szorozza meg. Ez a vírusfertőzésre alkalmazott Poisson-eloszlásból származik, amely kimondja, hogy egy teljesen megengedő sejtvonalban az 50% – os fertőzés elérésének valószínűségét körülbelül 0,7-es fertőzés sokaságával érik el. Ez nem mindig igaz, de ez egy jó közelítés a legtöbb alkalmazás.
a bajok a számlálás vírusok
olyan pontos, mint lehet, számlálás vírusok soha nem könnyű. Először is, a Soros hígítások – saját természetüknél fogva-hibaforrást jelentenek. Másodszor -és ez különösen fontos a magas vírustiterek esetében-még a legkisebb térfogat is, amely a pipettacsúcs legvégéhez kapcsolódik, elegendő vírusrészecskét hordozhat ahhoz, hogy lényeges különbséget tegyen a mennyiségi meghatározásban. Harmadszor, a rendszer biológiai variációja magas. Rendezzen ugyanannyi sejtet, adjon hozzá ugyanannyi vírust, állítsa le a fertőzést egyszerre, és a fertőzés százalékos aránya közel lehet, de soha nem pontosan ugyanaz.
végül egy olyan kezelés értékelésekor, amely (ahogy remélné!) csökkenti a vírus titerét, a vírus mennyisége a vizsgálati kimutatási küszöb alá csökkenhet.
a vírusok számlálásának művészete
a jó hír az, hogy ha ismeri a problémáit, akkor nem áll messze a megoldástól! A Soros hígítás pontossága automatizálással csökkenthető, de még akkor is, ha ez nem áll rendelkezésre, néhány apró tipp megváltoztathatja a különbséget. Ezek közé tartozik a pipettahegyek cseréje, és soha ne helyezzen egy pipettahegyet milliméternél mélyebbre a következő hígításba, nehogy véletlenül átvigyen néhány extra vírusnaplót, amelyek éppen a külső műanyagra ragadtak. Az ismétlések szintén fontosak, különösen a miniatürizált vizsgálatok esetében. A 96 kútlemez lehetővé teszi több minta egyidejű kezelését oly módon, hogy az alacsony áteresztőképességű módszerek (például a plakkvizsgálat) nem teszik lehetővé, de további változékonysággal járnak, mivel a kis mennyiségek még érzékenyebbek a fent tárgyalt kérdésekre. Míg a technikai ismétlések valamilyen módon foglalkoznak ezzel, a VRS-nél olyan kísérleteket próbálunk futtatni, amelyekhez kolorimetrikus TCID50 szükséges biológiai három példányban. Ez növeli a megközelítés robusztusságát, és lehetővé teszi a hamis pontok kizárását az adatkészletből anélkül, hogy elveszítené jelentőségét. A pontos TC50 értékek megkövetelik a kolorimetrikus adatok nemlineáris regressziós dózis-válaszát, amelyet a GraphPad Prism-hez hasonló programok könnyen előállíthatnak. Azonban az, hogy bármely szoftver képes-e ilyen görbét ábrázolni, szigorúan függ az adatok minőségétől, valamint az ismétlések szoros számértékeitől. A görbék és a generált TC50 értékek szemrevételezése erősen ajánlott olyan helyzetek kijavítására, amikor az extrapolációt hamis adatpontok torzították. Mindenekelőtt tapasztalataink azt sugallják, hogy a szokásos vírusállomány titráláson túl a TCID50 leolvasást igénylő kísérletekhez további optimalizálási lépésekre lehet szükség, mind a legjobb biológiai feltételek meghatározásához, amelyek biztosítják a reprodukálható mennyiségű vírus (pl. választott sejtvonal, lemezformátum, a fertőzés sokasága, időpontok) és a tcid50 vizsgálattal vizsgálandó legjobb koncentrációtartomány (pl. kezdő koncentráció és hígítási redő).
sejthalál vagy szép képek?
az elhalt sejtek számlálása nem könnyű, mivel nagyon gyakran elhagyják a lemezt az első mosáskor – feltételezve, hogy még mindig ott vannak! Ez nem segít a pontosságban. Bár drágább és fáradságos, amikor jó antitest áll rendelkezésre, az immunfluoreszcens festés az a megközelítés, amelyet általában választanánk. A vizsgálatot le lehet állítani a sejthalál előtt, és az érzékenység általában nagyobb, ami nagyobb ellenőrzést és nagyobb pontosságot tesz lehetővé. Ezenkívül ez a módszer olyan vírusok esetében is használható, amelyek nem okoznak CPE-t, vagy amelyek hosszú időt vesznek igénybe (és nézzünk szembe a tényekkel, néhány szép kép egy működő vírusról sokkal felemelőbb!). A sejtkárosodás azonban a legtöbb fertőzés és számos feltörekvő vírus védjegye, amelyekről nagyon keveset tudunk. Számos kolorimetriás / fluoreszcens riporter áll rendelkezésre a citotoxicitás különböző típusainak érzékeny mérésére és megkülönböztetésére. Úgy tűnik, hogy ez a régi klasszikus új kihívásokra készül!