Effetti Antivenom di 1,2,3-triazoli contro Bothrops jararaca e Lachesis muta Serpenti

Abstract

I veleni di serpente sono miscele complesse di proteine sia di enzimi che di nonenzimi, che sono responsabili della produzione di diversi effetti biologici. L’invenomazione umana da morsi di serpente in particolare quelli della famiglia dei viperidi induce un quadro fisiopatologico complesso caratterizzato da cambiamenti spettacolari nell’emostasi e frequentemente si osserva anche emorragia. Il presente lavoro riporta la capacità di sei di una serie di derivati 1,2,3-triazolici di inibire alcuni effetti farmacologici causati dai veleni di Bothrops jararaca e Lachesis muta. Le analisi in vitro hanno mostrato che questi composti erano alterati in modo dipendente dalla concentrazione, dal fibrinogeno o dalla coagulazione del plasma, dall’emolisi e dalla proteolisi prodotte da entrambi i veleni. Inoltre, questi composti hanno inibito gli effetti biologici in vivo pure. I topi trattati con questi composti erano completamente protetti dalle lesioni emorragiche causate da tali veleni. Ma, solo la B. l’attività che induce l’edema di jararaca è stata neutralizzata dai triazoli. Quindi l’effetto inibitorio dei derivati dei triazoli contro alcuni test biologici in vitro e in vivo di veleni di serpente indica aspetti promettenti che possono indicarli come modelli molecolari per migliorare la produzione di antivenomi efficaci o per integrare la neutralizzazione degli antivenomi, in particolare gli effetti patologici locali, che sono parzialmente neutralizzati dagli antivenomi.

1. Introduzione

I veleni di serpente sono miscele complesse di proteine tra cui enzimi (metalloproteinasi, serina proteinasi, fosfolipasi A2 e L-aminoacido ossidasi) e proteine senza attività enzimatica, come disintegrine, lectine di tipo C, proteine secretorie ricche di cisteina (CROCCANTI) tossine, peptidi natriuretici e miotossine. Le vipere velenose Bothrops jararaca e Lachesis muta sono responsabili di incidenti che coinvolgono gli esseri umani in diverse regioni del Sud America. Mentre B. jararaca si trova nel Brasile meridionale, Paraguay e Argentina settentrionale, L. muta è distribuita nelle foreste equatoriali ad est delle Ande, che vanno dall’Ecuador orientale, Colombia, Perù, Bolivia settentrionale e Venezuela orientale e settentrionale, alla Guyana, Guyana francese, Suriname e Brasile settentrionale. All’interno della loro gamma, sono spesso abbondanti e sono causa importante di morsi di serpente . L’invasione da parte di questi serpenti è caratterizzata principalmente da effetti sistemici (sanguinamento generalizzato, coagulopatia, insufficienza renale e shock) e locali (emorragia, edema e necrosi) . Come riportato altrove, i morsi di serpente costituiscono un problema di salute pubblica in America Latina e in altri paesi tropicali e subtropicali, in cui sono considerati come un problema di salute trascurato, secondo l’Organizzazione mondiale della Sanità (OMS) . In Sud America, B. jararaca induce una maggiore incidenza di morsi (95%) rispetto a L. muta (circa 2%); tuttavia, i morsi di L. muta di solito portano a sintomi più gravi e la sua incidenza di mortalità è tre volte superiore a B. jararaca . Al giorno d’oggi, la somministrazione parenterale di antivenom di origine animale è l’unico trattamento specifico per l’envenoming da parte dei morsi di serpente. In Brasile, la somministrazione endovenosa di entrambi Bothrops polivalente antivenom è usato per trattare i casi envenoming causati da morsi Bothrops o il siero polivalente bothropic-lachetic per L. muta e Bothrops (B. atrox) morsi di serpente nelle regioni amazzoniche. Come detto sopra, le invasioni da moderate a gravi inflitte dai serpenti Bothrops e Lachesis sono caratterizzate da una serie complessa di alterazioni locali e sistemiche come emorragia, mionecrosi, coagulopatia, shock cardiovascolare, insufficienza renale e infine morte . Come riportato da altri autori, nonostante siano sicuri, alte dosi di antivenomi talvolta utilizzati in Brasile per il trattamento di pazienti con Bothrops/Lachesis envenoming comprovati o sospetti possono contribuire a reazioni anafilattiche precoci e tardive (malattia da siero). Pertanto, la produzione di antiveleni di qualità adeguata rappresenta una sfida considerevole. Inoltre, i prezzi degli antiveleni sono aumentati e alcuni paesi hanno interrotto la loro produzione . Alcuni antiveleni neutralizzano efficacemente gli effetti tossici sistemici del veleno; tuttavia, gli effetti locali non sono bloccati e questa situazione può portare all’amputazione o alla disabilità .

A causa di tali problemi, sono stati ricercati trattamenti alternativi e alcuni di essi hanno comportato la ricerca di nuove molecole in grado di neutralizzare gli effetti sistemici e locali dei veleni. Estratti di piante e altre fonti naturali (come quelli di organismi marini) sono stati testati per la loro capacità di neutralizzare una varietà di effetti biologici e tossici dei veleni di serpente. Sono state identificate varie molecole farmacologicamente attive e molti effetti sono già stati elencati per loro, inclusa la loro capacità antiveleno . Al giorno d’oggi, molti nuovi approcci bioprospecting sono in fase di studio. Tuttavia, in relazione a ciò, va notato che finora gli effetti biologici delle molecole derivate dalla sintesi organica non sono stati ben esplorati. La letteratura ha descritto il composto 1,2,3-triazole come una classe importante di sistema eterociclico dell’azoto di cinque membri che esibisce i profili farmacologici differenti , quale attività antipiastrinica , anticlotting , antivirale , tripanocida , antimicrobica e/o il loro uso nel trattamento della schizofrenia e della leishmaniosi . Sono disponibili due metodi generali per la costruzione di anelli 1,2,3-triazolici: reazioni di cicloaddizione 1,3-dipolare di Huisgen , in particolare la cicloaddizione catalizzata dal rame(I) e l’elettrociclizzazione intramolecolare 1,5 di composti β-sostituiti-α-diazocarbonilici . I nostri studi precedenti hanno indicato che sei nuovi composti sintetici 1,2,3-triazole (1-arylsulfonylamino-5-methyl-1H tri triazole-4-carboxylic acid etil esteri) inibito l’emolisi indotta da L. muta venom . In effetti, tali derivati mostravano una vasta gamma di attività farmacologiche .

Lo scopo di questo lavoro era quello di valutare la capacità di questi sei derivati 1,2,3-triazolici basati su activities 1-(p-clorofenil)-1H tri triazole-4-carboidrazide contro le attività in vivo e in vitro di Bothrops jararaca e Lachesis muta veleni.

2. Materiale

2.1. Veleno e materiale

Bothrops jararaca, Lachesis muta veleni liofilizzati e antiveleni anti-Lachesis o anti-Bothropic sono stati forniti da Fundação Ezequiel Dias, Belo Horizonte, MG, Brasile, e conservati a -20°C fino alle analisi. Dimetilsufossido (DMSO), fibrinogeno bovino e azocaseina sono stati ottenuti da Sigma Chemical Co. Tutti gli altri reagenti erano del miglior grado disponibile.

2.2. Derivati sintetici

I sei derivati etilici dell’acido 1-arilsulfonilammino-5-metil-1H tri triazole-4-carbossilico sono stati sintetizzati secondo il nostro precedente rapporto e le loro strutture chimiche sono mostrate nella Figura 1. Questi composti sono stati disciolti in dimetilsufossido (DMSO) e conservati a 4°C, fino a quando richiesto.

Figura 1

Strutture chimiche dei sei derivati 1,2,3-triazoli N’1 1 – (p-clorofenil)-1H tri triazole-4-carbohydrazide. I sei derivati sono stati progettati come numeri, come mostrato nella parentesi dopo ogni derivato.

2.3. Animali

Topi BALB/c (18-20 g) sono stati ottenuti dal Núcleo de Animais de Laboratório (NAL) dell’Università federale Fluminense. Gli animali sono stati alloggiati in condizioni controllate di temperatura (°C) e luce. Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato istituzionale UFF per l’etica nella sperimentazione animale (numero di protocollo 297) che erano in conformità con le linee guida del Comitato brasiliano per la sperimentazione animale (COBEA) e le leggi e le politiche internazionali.

3. Metodi

3.1. Inibizione dell’emolisi indiretta

Il grado di emolisi causato dai veleni di L. muta e B. jararaca è stato determinato dal test emolitico indiretto utilizzando eritrociti umani e emulsione di tuorlo d’uovo di gallina come substrato . La quantità di L. muta e B. il veleno di jararaca (µg / mL) che ha prodotto il 100% di emolisi è stato indicato come dose emolitica indiretta minima (MIHD). Gli esperimenti inibitori sono stati eseguiti incubando derivati del triazolo con un MIHD per 30 minuti a temperatura ambiente e quindi è stata valutata l’attività emolitica. Gli esperimenti di controllo sono stati fatti incubando veleni con DMSO o soluzione salina.

3.2. Attività Anticlotting

L’attività di coagulazione dei veleni L. muta e B. jararaca è stata determinata utilizzando un coagulometro digitale Amelung, modello KC4A (Labcon, Germania). Diverse concentrazioni di L. il veleno muta (10 µg/mL) e B. jararaca (40 µg/mL) sono stati miscelati con una soluzione di fibrinogeno bovino (2 mg/mL) o con plasma umano e la quantità di veleno che ha coagulato fibrinogeno o plasma in 60 secondi è stata indicata come dose minima di coagulante (MCD). Per valutare il loro effetto inibitorio, i derivati del triazolo sono stati incubati per 30 minuti a temperatura ambiente con un MCD di veleni, quindi la miscela è stata aggiunta al fibrinogeno o al plasma e il tempo di coagulazione registrato. Gli esperimenti di controllo sono stati eseguiti in parallelo aggiungendo DMSO o soluzione salina incubata con veleni, invece dei triazoli.

3.3. Attività antiproteolitica

L’attività proteolitica dei veleni L. muta e B. jararaca è stata determinata utilizzando azocaseina come substrato (0,2% p/v, in 20 mM Tris-HCl, 8 mM CaCl2, pH 8,8), con modificazioni minori . Una concentrazione efficace (EC) è stata definita come la quantità di veleno (µg/mL) in grado di produrre una variazione a 420 nm di circa 0,2. I derivati del triazolo sono stati incubati con un EC di veleno per 30 minuti a temperatura ambiente e quindi è stata misurata la proteolisi. Gli esperimenti di controllo sono stati fatti incubando veleni con DMSO o soluzione salina.

3.4. Attività antiemorragica

Le lesioni emorragiche prodotte dai veleni di L. muta e B. jararaca sono state quantificate utilizzando una procedura descritta da Kondo et al. , con modifiche. In breve, i campioni sono stati iniettati per via intradermica (i. d.) nella pelle addominale dei topi. Due ore dopo, gli animali sono stati sottoposti a eutanasia mediante decapitazione, la pelle addominale rimossa, allungata e ispezionata per i cambiamenti visivi nell’aspetto interno al fine di localizzare le macchie emorragiche. L’emorragia è stata quantificata come dose emorragica minima (MHD), definita come la quantità di veleno (mg/kg) in grado di produrre un alone emorragico di 10 mm . L’effetto inibitorio dei derivati del triazolo è stato studiato incubando composti con due MHD di veleno L. muta o B. jararaca per 30 minuti a temperatura ambiente e quindi la miscela è stata iniettata nei topi e l’emorragia è stata misurata. L’attività emorragica è stata espressa come il diametro medio (in millimetro) dell’alone emorragico indotto dai veleni in assenza e presenza dei derivati del triazolo. Gli esperimenti di controllo negativo sono stati eseguiti iniettando DMSO o soluzione salina.

3.5. L’attività antiedematogena

L’attività che induce edema dei veleni L. muta e B. jararaca è stata determinata secondo Yamakawa et al. , con modifiche. Gruppi di cinque topi sono stati iniettati per via sottocutanea (s. c) nel pad del piede destro con 50 µL di veleno, mentre il pad di cibo sinistro ha ricevuto 50 µL di soluzione salina. Un’ora dopo l’iniezione, l’edema è stato valutato ed espresso come percentuale di aumento del peso del cuscinetto del piede destro rispetto a quello sinistro. L’effetto inibitorio dei derivati del triazolo è stato studiato incubando composti con veleno L. muta o B. jararaca per 30 minuti a temperatura ambiente e quindi la miscela è stata iniettata nei topi (cuscinetto del piede destro) ed è stato misurato l’edema.

3.6. Analisi statistica

I risultati sono espressi come mezzi ± SEM ottenuti con il numero indicato di animali o esperimenti eseguiti. La significatività statistica delle differenze tra i gruppi sperimentali è stata valutata utilizzando il test dello Studente. Un valore di ≤ 0,05 è stato considerato significativo.

4. Risultati e discussione

Lo sviluppo di antiveleni efficaci, sicuri, più economici e più accessibili merita attenzione, poiché i morsi di serpente possono causare gravi disabilità e uccidere anche migliaia di persone. Un numero crescente di studi si è concentrato sulla ricerca di inibitori di veleni di serpente da una varietà di fonti, siano esse naturali o sintetiche . Suramin e benzoil fenil benzoato sono molecole sintetiche in grado di inibire la miotossicità, la coagulazione e le attività della fosfolipasi A2 e della ialuronidasi dei veleni di serpente di diverse famiglie. Gli analoghi del lattone sono stati sintetizzati e hanno inibito la miotossicità e le attività che inducono edema ed enzimatiche indotte da una fosfolipasi A2 isolata da B. jararacussu . D’altra parte, i principi bioattivi marini hanno anche attirato l’attenzione a causa delle loro azioni farmacologiche diffuse .

In questo lavoro, è stata valutata la capacità di sei esteri etilici dell’acido 1-arilsulfonilammino-5-metil-1H tri triazole-4-carbossilico di neutralizzare alcune attività in vitro (emolisi, coagulazione e proteolisi) e in vivo (emorragia ed edema) causate da B. jararaca e L. veleni muta, poiché i risultati precedenti indicavano che questi sei derivati inibivano l’emolisi indotta dal veleno di L. muta, ma con potenze diverse . Per questo motivo, si è pensato che sarebbe utile indagare le azioni di tali derivati su altre importanti attività biologiche legate ai morsi di serpente, come proteolisi, coagulazione, emolisi, emorragia ed edema. È stato dimostrato che questi composti inibivano l’emolisi causata dal veleno di B. jararaca (50 µg/mL) e L. muta (15 µg/mL) (Figura 2(a)). La percentuale inibitoria dei derivati era superiore al 50% contro entrambi i veleni. Tuttavia, una leggera differenza sul profilo inibitorio è stata osservata per il derivato 6, dove è stata raggiunta un’inibizione del 50% e del 90% sull’emolisi per B. jararaca e L. muta venom, rispettivamente. Né i derivati né il DMSO hanno portato gli eritrociti all’emolisi, né il DMSO ha interferito nel grado di emolisi causato dai veleni.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 2

Effetto di derivati di emolisi e di proteolisi. I derivati 1-6 (45 µM) sono stati incubati con B. jararaca (colonne scure) o con L. muta (colonne tratteggiate) per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi sono state eseguite attività emolitiche (a) e proteolitiche (b). I dati sono espressi come media ± SEM dei singoli esperimenti ().

Envenomation da questi morsi di serpente produce grave emorragia a causa dell’elevato contenuto di metalloproteasi zinco-dipendente o serina proteasi che digeriscono componenti proteici della matrice extracellulare o consumano fattori di coagulazione del sangue . B. jararaca e L. il veleno di muta ha idrolizzato l’azocaseina in modo dipendente dalla concentrazione con una EC di 20 µg/mL e 6 µg/mL, rispettivamente (dati non mostrati). I derivati inibivano la proteolisi indotta da B. jararaca o L. muta(Figura 2 (b)). I derivati 1, 2, 3 e 6 hanno inibito la proteolisi indotta da entrambi i veleni fino all ‘ 80% e il derivato 5 ha inibito tale attività al di sotto del 50%. Una differenza marcata sul profilo inibitorio dei derivati è stata osservata per il derivato 4, in cui ha inibito 97% e 25% la proteolisi indotta da B. jararaca o L. muta venom, rispettivamente (Figura 2(b)).

Come si vede nella Figura 3, i derivati 1, 2, 4, 5 e 6, ma non il derivato 3 inibito in modo dipendente dalla concentrazione (23-94 µM), la coagulazione del fibrinogeno indotta dai veleni di B. jararaca (40 µg/mL) o L. muta (10 µg/mL). Sembrava che i derivati inibissero in modo più efficiente la coagulazione indotta da L. muta rispetto a B. jararaca. Alla massima concentrazione (94 µM), i derivati 1, 2, 3, 5 e 6 impedivano la coagulazione di L. muta (Figura 3(b)), mentre i derivati 2 e 6 impedivano una volta il B. jararaca (Figura 3(b)). A concentrazioni fino a 200 µM, tutti i derivati 1,2,3-triazolici hanno efficacemente impedito la coagulazione del fibrinogeno causata da entrambi i veleni, ma a concentrazioni inferiori a 10 µM, nessuno di questi composti ha impedito la coagulazione. Tuttavia, quando i derivati (10 µM) sono stati messi tutti insieme e incubati con B. jararaca o L. muta venom, il tempo di coagulazione è stato ritardato di due volte. È stato notato che, se il derivato 2 o 6 è stato rimosso dalla miscela, l’effetto inibitorio su coagulazione non è stato osservato. Inoltre, i derivati impedivano anche la coagulazione indotta dai veleni quando veniva usato il plasma. Né DMSO (1% v/v, concentrazione finale) né soluzione salina hanno interferito con i processi di coagulazione.

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(b)
(b)

(a)(b)
(b)

Figura 3

Effetto dei derivati sul fibrinogeno coagulazione. Ventitré derivati µM (colonne grigie), 46 µM (colonne bianche) o 94 µM (colonne nere) sono stati incubati con 40 µg/mL B. jararaca (a) o con 10 µg/mL L. muta (b) per 30 min a temperatura ambiente. Quindi, la miscela è stata aggiunta al fibrinogeno (2 mg/mL) e il tempo di coagulazione è stato registrato. I veleni sono stati incubati con soluzione salina (C1); 1% v / v DMSO (C2); derivato 1 (colonna 1); derivato 2 (colonna 2); derivato 3 (colonna 3); derivato 4 (colonna 4); derivato 5 (colonna 5); e con derivato 6 (colonna 6). # significa che il fibrinogeno non si è coagulato fino a 600 secondi di osservazione. I dati sono espressi come media ± SEM dei singoli esperimenti ().

L’iniezione intradermica di veleno di B. jararaca (12 mg/Kg) o L. muta (20 mg/Kg) ha prodotto un alone di emorragia di 20 mm nei topi. Tale alone rappresenta due MHD di veleni. Quando ogni veleno è stato mescolato con derivati (90 µM) e poi iniettato nei topi, è stata osservata una protezione completa dall’emorragia (dati non mostrati). Al contrario, i risultati precedenti hanno mostrato che il siero antilaquetico non inibiva l’emorragia indotta dal veleno di L. muta . L’iniezione di DMSO, derivati o soluzione salina non ha prodotto emorragia. L’induzione dell’edema è un altro effetto importante che segue il morso del serpente . La figura 4 mostra che l’edema indotto da 5 mg/Kg B. jararaca(Figura 4 (a)) o 8 mg / Kg L. muta(Figura 4 (b)) è stata significativamente ridotta dai derivati (90 µM). I derivati triazolici 1, 2 e 4 inibivano sopra l ‘ 80% l’edema indotto da B. jararaca, mentre i derivati 3, 5 e 6 inibivano intorno al 70% (Figura 4(a)). Come visto, tutti i derivati hanno inibito meno attività edematogenica indotta da L. muta (Figura 4(b)).

(a)

(b)

(a)
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Figura 4

Effetto di derivati edema di indurre l’attività. I derivati (90 µM) sono stati incubati con 5 mg/Kg di B. jararaca (a) o con 8 mg/Kg L. muta (b) per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi è stata eseguita un’attività che induce edema. Le colonne sono derivate 1 più venom (1); derivate 2 più venom (2); derivate 3 più venom (3); derivate 4 più venom (4); derivate 5 più venom (5) e derivate 6 più venom (6). I dati sono espressi come media ± SEM dei singoli esperimenti ().

In conclusione, i derivati degli esteri etilici dell’acido 1-arilsulfonilammino-5-metil-1H tri triazole-4-carbossilico possono essere utili come prototipi per la progettazione di nuove molecole per migliorare l’attuale trattamento utilizzato per i morsi di serpente B. jararaca e L. muta. La potenza inibitoria di questi derivati può variare o può essere migliorata quando sono stati messi tutti insieme, probabilmente agendo sinergicamente. Pertanto, una concentrazione inferiore di questi sarebbe necessaria per raggiungere una completa neutralizzazione degli effetti biologici causati dai veleni B. jararaca e L. muta. Inoltre, l’analisi precedente della relazione struttura-attività dei derivati è già stata eseguita . I derivati sono stati sottoposti all’analisi della “Lipinski la regola del cinque”, che indica che una molecola chimica potrebbe essere un attivo per via orale del farmaco negli esseri umani e tale regola afferma che una molecola di aver violato due dei seguenti regole è probabile che sia scarsamente assorbiti: (1) peso molecolare inferiore a 500 Da, (2) numero di donatori di legame idrogeno (OH o NH gruppi) uguale o inferiore a 5, (3) numero di idrogeno accettori di legame inferiore a 10, e, infine, (4) calcolata meno di 5 . I risultati hanno mostrato che tutti i derivati hanno soddisfatto questa regola (peso molecolare = 296,31–341,30; 2,6–3,4; nHBA = 8-11 e nHBD = 1-3) indicando una buona biodisponibilità teorica .

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Internazionale per la Scienza (IFS Grant F / 4571-1) e dalle seguenti agenzie di finanziamento brasiliane: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico( CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro Carlos Chagas Filho (Faperj), Coordinação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (capes), e la Universidade Federal Fluminense/pró-recitoria de Pesquisa e Pós-graduação e Inovação (Uff/PROPPi).