Modelli di mouse
Humanized mice – topi innestati con cellule o tessuti umani – o topi transgenici che esprimono geni umani rappresentano un potente metodo per lo studio delle cellule umane in vivo. Progressi significativi nei modelli murini umanizzati si sono verificati negli ultimi 25 anni dopo la scoperta della mutazione scid (severe combined immunodeficiency) nel ceppo murino C. B-17 negli 1980 (Bosma et al., 1983). Molti gruppi sono stati in grado di dimostrare che C irradiato subletalmente.I topi SCID B-17 supportano l’attecchimento e la differenziazione delle cellule progenitrici CD34+ da BM umano e UCB (Vormoor et al., 1994; Lapidot et al., 1992) in più lignaggi emopoietici. Alla luce di ciò, le cellule staminali CD34+ sono state coniate SCID repopulating cells (SRC) in quanto erano in grado di ripopolare lignaggi ematopoietici in un topo SCID. Tuttavia, l’attecchimento umano, in particolare quello del lignaggio delle cellule T, era ancora piuttosto basso in questo ceppo. Una seconda svolta è stata fatta a metà degli anni 1990 attraverso l’introduzione della mutazione SCID sullo sfondo del topo diabetico nonobese (NOD) (NOD/SCID) (Shultz et al., 1995). Il ceppo inbred NOD mouse manca di molti aspetti della funzione immunitaria innata in particolare, ridotta attività delle cellule NK che rappresenta una barriera importante per attecchimento. A causa del significativo aumento del chimerismo umano osservato in questi topi, è diventato il “gold-standard” per lo studio dell’emopoiesi umana e dell’HSCs (Larochelle et al., 1996; Greiner et al., 1995). Successivamente allo sviluppo di questi topi è stato dimostrato che gli animali NOD / SCID trattati con un anticorpo che blocca IL topo IL-2Rß, riducendo così ulteriormente la funzione NK, hanno mostrato un miglioramento della linfopoiesi T (Kerre et al., 2002).
Una delle principali limitazioni dell’uso di topi NOD/SCID era l’alta incidenza di timoma e sensibilità alle radiazioni che accorciavano la durata della vita di questi topi e precludevano l’analisi a lungo termine (Shultz et al., 1995). Nel 2002 è stata sviluppata una nuova generazione di topi con una delezione mirata della catena γ del recettore dell’interleuchina-2 (Il2rg−/−), nota anche come citochina comune (yc). Il Il2rg yc è una subunità critica per le citochine IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21, rendendo queste citochine non funzionali sulle loro cellule bersaglio. Due modelli ora ampiamente utilizzati per lo studio dello sviluppo ematolinfoide sono i ceppi di topo immunodeficienti BALB/C RAG2−/−yc−/− e NOD/SCID/ycnull. I topi RAG2-carenti mancano di cellule T e B mature, a causa dell’assenza di riarrangiamento dei recettori TCR e immunoglobuline (Ig) (Shinkai et al., 1992; Mombaerts et al., 1992), esibendo così un fenotipo simile ai topi SCID. Inoltre, poiché la citochina IL-15 è fondamentale per lo sviluppo delle cellule NK, questi topi sono anche privi di cellule NK, rendendoli triplicati per le cellule T, B e NK. Traggiai e colleghi (Traggiai et al., 2004) sono stati il primo gruppo a descrivere il modello in cui i neonati RAG2 – / – yc – / – sono stati trapiantati con cellule umane CD34+ CB tramite iniezione intraepatica. Utilizzando questo modello, le cellule T umane mature sono state rilevate nel timo di topo, nella milza e nei linfonodi e sono state generate a livelli notevolmente più alti rispetto ai modelli precedenti. Inoltre, le cellule T umane generate in questi topi sembravano essere funzionali. Risultati simili sono stati osservati da Ishikawa et al. (2005), compresa l’analisi per altri sottoinsiemi ematopoietici umani presenti nei topi ricostituiti NOD/SCID/yc−/−).
Un certo numero di studi che utilizzano topi adulti anziché neonati RAG2−/−yc−/− e NOD/SCID/yc−/− dimostrano un maggiore supporto dello sviluppo dell’ematolinfoide umano rispetto ai ceppi precedentemente disponibili (Yahata et al., 2002; Shultz et al., 2005; Watanabe et al., 2009). È importante sottolineare che il ceppo genetico dei topi influenza in gran parte la capacità di ricostituzione. Quando le cellule CD34+ da UCB sono state iniettate in topi adulti C57BL/6 RAG2−/−yc−/−, meno dell ‘ 1% di cellule CD45 umane sono state rilevate nel BM dei topi riceventi, che era drammaticamente inferiore a quello osservato per i topi NOD / SCID (Mazurier et al., 1999). Sebbene il ragionamento esatto per questo non fosse chiaro, è stato ipotizzato che una ragione per un maggiore attecchimento nei topi NOD/SCID fosse che la mutazione NOD conferisce molteplici difetti nell’immunità innata non attribuiti esclusivamente alle cellule NK (Shultz et al., 1995). Infatti, un’ampia analisi genetica di vari loci ha rivelato che la base per le differenze specifiche del ceppo nell’attecchimento dello xenotrapianto era dovuta a polimorfismi nel gene Sirpa che codifica la proteina regolatrice del segnale-α (SIRPa) (Takenaka et al., 2007). Questi polimorfismi genetici fanno sì che la proteina SIRPa presente sulle cellule mieloidi del topo si leghi con capacità differenziale al ligando CD47 trovato sulle cellule ematopoietiche umane (Seiffert et al., 2001). Le forti interazioni recettore-ligando provocano un segnale inibitorio e fuggono dalla morte a causa dell’inibizione della fagocitosi da parte dei macrofagi murini delle cellule umane che esprimono CD47 (van den Berg e van der Schoot, 2008). Fornendo così una ragione per migliorare l’attecchimento delle cellule umane nei topi NOD/SCID/ycnull (Legrand et al., 2006). Infatti, quando l’interazione ottimale di CD47/SIRPa è ottenuta attraverso l’espressione forzata del mouse CD47 su progenitori ematopoietici umani, gli HSC iniettati sono meglio in grado di sopravvivere nei topi RAG2−/−yc−/− con conseguente sopravvivenza delle cellule T molto migliorata nel timo e nella periferia (Legrand et al., 2011).
Sebbene i modelli xenogenici siano strumenti eccellenti per studiare lo sviluppo delle cellule T umane, la specificità delle specie delle citochine (IL7) e di altre molecole (MHC di classe I e II) importanti per la sopravvivenza delle cellule T può rendere difficili da valutare sottoinsiemi di cellule T periferiche umane in questi topi. È probabile che le nuove generazioni di topi umanizzati faciliteranno la generazione e la funzione delle cellule T e di altri lignaggi attraverso citochine transgeniche. In effetti, questo lavoro è già in corso come un topo knock-in IL-3 / GM-CSF per migliorare lo sviluppo delle cellule mieloidi umane in questi topi, così come un topo knock-in trombopoietina per una migliore sopravvivenza ed espansione dell’HSC umano (Rongvaux et al., 2011; Willinger et al., 2011; Brehm et al., 2012) sono stati generati. Inoltre, i topi NOD / SCID / ycnull sono stati recentemente sviluppati per esprimere l’antigene umano MHC di classe I HLA-A2 (Shultz et al., 2010). Ciò consente di sviluppare le cellule T per essere MHC umano limitato rendendo lo studio delle infezioni umane e la risposta immunitaria delle cellule T più appropriato e quindi un modello migliorato per gli approcci traslazionali.