OMIM Entry – * 609631-DExD / H-BOX HELICASE 58; DDX58

TESTO

DDX58 è una RNA elicasi che appartiene alla famiglia DEAD/H box. I membri della famiglia DEAD / H box hanno diversi ruoli nella regolazione dell’espressione genica e dei processi cellulari (Imaizumi et al., 2002).

Utilizzando l’ibridazione sottrattiva per identificare i geni inducibili dal lipopolisaccaride (LPS) nelle cellule endoteliali, seguiti dalla RAZZA, Imaizumi et al. (2002) ha isolato una codifica cDNA DDX58, che hanno chiamato RIGI. Imaizumi et al. (2002) ha osservato che RIGI era stato identificato nel 1997 come un gene inducibile acido retinoico in una linea cellulare di leucemia promielocitica (GenBank AF038963). La proteina 925-aminoacidica prevista ha una massa molecolare calcolata di 101 kD e appartiene alla famiglia DEAD / H box. RIGI contiene un motivo GxGKT, suggerendo che si tratta di una RNA elicasi. L’analisi Northern blot delle cellule endoteliali ha rilevato una trascrizione 3.0-kb solo dopo la stimolazione LPS.

Yoneyama et al. (2004) ha osservato che RIGI ha 2 copie di un dominio di reclutamento caspasi (CARD) al suo terminale N oltre al suo dominio elicasi C-terminale.

Gross (2012) ha mappato il gene DDX58 al cromosoma 9p21.1 sulla base di un allineamento della sequenza DDX58 (GenBank AF038963) con la sequenza genomica (GRCh37).

Utilizzando l’ibridazione sottrattiva, Imaizumi et al. (2002) ha mostrato che le cellule endoteliali stimolate da LPS esprimevano RIGI e COX2 (PTSG2; 600262). Le analisi Northern blot, Western blot e RT-PCR hanno mostrato che l’mRNA e la proteina RIGI sono stati espressi nelle cellule endoteliali solo dopo stimolazione LPS in modo dipendente dalla concentrazione. Sovraespressione di RIGI espressione selettivamente sovraregolata di mRNA COX2 e proteine in cellule di cancro della vescica trasfettate e attività del promotore COX2 indotta in cellule endoteliali.

Di RT-PCR e Western blot analysis, Imaizumi et al. (2004) ha dimostrato che gamma-interferone (IFNG; 147570)-stimolato cellule muscolari lisce dell’arteria ombelicale (SMCS) espresso RIGI mRNA e proteine. Analisi di microscopia immunoistochimica e confocale di Imaizumi et al. (2004) ha dimostrato l’espressione citoplasmatica di RIGI in SMCS in vivo. Ulteriori analisi immunoblot e microscopiche hanno indicato che IFNG stimolato l’espressione di RIGI nella vena ombelicale. L’espressione di RIGI è stata rilevata anche in normali cellule endoteliali polmonari umane.

Cui et al. (2004) ha rilevato l’espressione RIGI in una linea cellulare di cancro al seno stimolata da IFNG. Sovraespressione di RIGI espressione sovraregolata di ISG15 (G1P2; 147571).

Yoneyama et al. (2004) ha dimostrato che l’RNA a doppio filamento (dsRNA) ha indotto l’espressione RIGI in modo dipendente dall’ATPasi e ha aumentato la produzione di interferone di tipo I (ad esempio, IFNB; 147640). Una forma troncata di RIGI priva del dominio dell’elicasi ma contenente i motivi della CARTA tandem ha trasdotto i segnali che portano all’attivazione di IRF3 (603734) e NFKB (vedi 164011). Usando l’interferenza dell’RNA, Yoneyama et al. (2004) ha scoperto che RIGI era essenziale per l’espressione indotta da virus di IRF3. Hanno concluso che RIGI è essenziale per la rilevazione e l’eradicazione dei genomi virali replicanti.

Uso di un virus dell’epatite C (HCV; vedi 609532) linea cellulare che esprime replicone, Breiman et al. (2005) ha mostrato che la proteasi HCV NS3/4A ha compromesso la produzione di IFNB in entrambi i percorsi TRIF (TICAM1; 607601)-dipendenti e TRIF-indipendenti. Hanno dimostrato che la compromissione della via indipendente dal TRIF è dovuta all’inibizione dell’attivazione del promotore IFNB mediata da RIGI da parte di NS3/4A. Breiman et al. (2005) ha proposto che RIGI sia un fattore chiave nel percorso di attivazione IFNB indipendente da TRIF e sensibile a NS3/4A.

Li et al. (2005) ha scoperto che le cellule dell’epatoma non hanno mostrato il recettore Toll-like-3 (TLR3; 603029) – attivazione IFNB dipendente in risposta a un analogo dsRNA, poly(I-C), mentre gli epatociti non neoplastici hanno mostrato una robusta espressione IFNB TLR3-dipendente in risposta a poly (I-C). In contrasto con il poli (I-C), sia l’epatoma che le normali linee cellulari degli epatociti hanno prodotto IFNB in risposta al virus Sendai in modo indipendente da TLR3 e RIGI-dipendente. Il silenziamento dell’espressione RIGI ha compromesso la risposta al virus Sendai, ma non al poly(I-C). Li et al. (2005) ha concluso che gli epatociti contengono 2 distinte vie di segnalazione antivirale che portano all’espressione dell’interferone di tipo I, una dipendente da TLR3 e l’altra dipendente da RIGI.

Hornung et al. (2006) ha dimostrato che l’estremità 5-primo-trifosfato dell’RNA generata dalle polimerasi virali è responsabile del rilevamento mediato da RIGI delle molecole di RNA. Il rilevamento dell’RNA 5-primo-trifosfato viene abrogato mediante capping dell’estremità 5-primo-trifosfato o mediante modificazione nucleosidica dell’RNA, entrambi verificatisi durante l’elaborazione dell’RNA posttranscrizionale negli eucarioti. L’RNA genomico preparato da un virus a RNA a filamento negativo e l’RNA preparato da cellule infette da virus (ma non da cellule non infette) hanno innescato una potente risposta interferone-alfa (vedere IFNA; 147660) in modo sensibile alla fosfatasi. L’RNA a cinque primi trifosfati si lega direttamente a RIGI. Così, uncapped 5-prime-trifosfato RNA (chiamato 3pRNA) presente nei virus noti per essere riconosciuti da RIGI, ma assente nei virus noti per essere rilevati da MDA5 (606951), come i picornavirus, serve come la firma molecolare per la rilevazione di infezione virale da RIGI.

Pichlmair et al. (2006) ha dimostrato che l’infezione da virus dell’influenza A non genera dsRNA e che RIGI è attivato da RNA genomico virale a filamento singolo (ssRNA) con 5-prime-fosfati. Questo è bloccato dalla proteina influenzale proteina non strutturata 1 (NS1), che si trova in un complesso con RIGI nelle cellule infette. Pichlmair et al. (2006) ha concluso che questi risultati hanno identificato RIGI come sensore ssRNA e potenziale bersaglio dell’evasione immunitaria virale e hanno suggerito che la sua capacità di percepire l’RNA 5-prime-fosforilato si è evoluta nel sistema immunitario innato come mezzo per discriminare tra sé e non se stesso.

Gack et al. (2007) ha riferito che i domini di reclutamento della caspasi N-terminale (CARDs) di RIGI subiscono una robusta ubiquitinazione indotta da TRIM25 (600453) in cellule di mammifero. Il dominio SPRY C-terminale di TRIM25 interagisce con le schede N-terminale di RIGI; questa interazione fornisce efficacemente la porzione di ubiquitina collegata a lys63 alle schede N-terminale di RIGI, con un conseguente marcato aumento dell’attività di segnalazione a valle di RIGI. Il residuo lys172 di RIGI è fondamentale per l’ubiquitinazione efficiente mediata da TRIM25 e per il legame MAVS (609676), nonché la capacità di RIGI di indurre la trasduzione del segnale antivirale. Il targeting genetico ha dimostrato che TRIM25 è essenziale non solo per l’ubiquitinazione RIGI, ma anche per la produzione di interferone-beta mediata da RIGI e l’attività antivirale in risposta all’infezione da virus RNA. Quindi, Gack et al. (2007) ha dimostrato che TRIM25 E3 ubiquitina ligasi induce l’ubiquitinazione lys63-linked di RIGI, che è cruciale per la via di segnalazione RIGI citosolica per suscitare l’immunità innata antivirale ospite.

Utilizzando l’analisi del lievito 2-ibrido, Arimoto et al. (2007) isolato RNF125 (610432) come una proteina simile all’ubiquitina con attività E3-ligasi che ha interagito con l’enzima E2 UBCH8 (UBE2L6; 603890). Inoltre, hanno scoperto che RIGI ha interagito con UBCH8 e RNF125. L’interazione di RIGI con RNF125 richiedeva il dominio della CARTA e la regione C-terminale di RIGI. Il Downregulation di RNF125 da piccolo RNA interferente ha ridotto i livelli di RIGI ed ha impedito la poliubiquitinazione di RIGI. La mutazione di cys72 e cys75 di RNF125 ad ala ha abolito la sua capacità di mediare l’ubiquitinazione RIGI. IFNA espressione upregulated di RNF125, UBCH5 (UBE2D1; 602961), e RIGI. Arimoto et al. (2007) ha concluso che la funzione di ubiquitinazione RNF125 funge da percorso normativo negativo per la produzione di IFN.

Saito et al. (2007) ha scoperto che RIGI e LGP2 (608588), ma non MDA5, legavano in modo efficiente l’RNA HCV per conferire l’espressione IFNB. Dopo l’infezione da HCV e il legame con l’RNA, RIGI si è spostato da un monomero a una proteina autoassociante che ha anche interagito attraverso il suo dominio CARD con IPS1 (HISPPD2A; 610979) per segnalare i geni IRF3 e NFKB-responsive. L’analisi delle mutazioni ha mostrato che era necessario un dominio di repressore RIGI C-terminal (RD) per la multimerizzazione RIGI e l’interazione IPS1. L’eliminazione della RD ha provocato la segnalazione costitutiva al promotore di IFNB, mentre l’espressione della RD da sola ha impedito la segnalazione e ha aumentato la permissività cellulare all’HCV. Saito et al. (2007) ha identificato un analogo RD in LGP2 che ha interagito in trans con RIGI per ablare l’auto-associazione e la segnalazione. Hanno concluso che RIGI è un recettore di riconoscimento patogeno per HCV e che il suo RD è un modulatore chiave delle difese dell’ospite che controllano l’infezione da HCV e la produzione. Saito et al. (2007) ha proposto che la modulazione delle dinamiche di interazione RIGI/LGP2 possa avere implicazioni terapeutiche per la regolazione immunitaria.

Di RT-PCR, Western blot e analisi di microscopia a fluorescenza, Zhang et al. (2008) ha rilevato una maggiore espressione di RIGI nelle cellule di leucemia mieloide umana e murina su differenziazione granulocitica terminale indotta da acido retinoico, suggerendo che l’espressione di RIGI è regolata in modo evolutivo insieme alla differenziazione mieloide. I topi privi di Rigi hanno sviluppato granulocitosi progressiva e leucemia mieloide cronica (vedere LMC; 608232). La granulopoiesi progressiva è stata associata a una ridotta espressione di Icsbp1 (601565). Zhang et al. (2008) ha concluso che RIGI ha un ruolo normativo critico nel modulare la generazione e la differenziazione dei granulociti.

RIGI è una proteina citosolica multidominio che rileva RNA virale e suscita una risposta immunitaria antivirale. Due domini della SCHEDA N-terminale trasmettono il segnale e il dominio normativo impedisce la segnalazione in assenza di RNA virale. Cinque-prime-trifosfato e dsRNA sono 2 modelli molecolari che consentono RIGI di discriminare patogeni da auto-RNA. Utilizzando il miglioramento della fluorescenza indotta da proteine a singola molecola, Myong et al. (2009) ha scoperto una robusta attività di traslocazione dsRNA alimentata da adenosina 5-prime trifosfato di RIGI. Le CARTE sopprimono drammaticamente la traslocazione in assenza di 5-prime-trifosfato e l’attivazione da parte di 5-prime-trifosfato innesca RIGI per traslocare preferenzialmente su dsRNA in cis. Myong et al. (2009) ha concluso che questa integrazione funzionale di 2 modelli molecolari di RNA può fornire un mezzo per rilevare e contrastare in modo specifico i virus replicanti.

Oshiumi et al. (2010) ha dichiarato che RIPLET (RNF135; 611358) media la poliubiquitinazione legata al lys63 del dominio repressore RIGI C-terminal e delle schede N-terminal. Hanno scoperto che i fibroblasti, i macrofagi e le cellule dendritiche dei topi Riplet -/- erano difettosi per la produzione di IFN e altre citochine in risposta all’infezione da virus a RNA, ma non virus a DNA. La mancanza di Riplet ha abolito l’attivazione di Rigi durante l’infezione da virus RNA e i topi Riplet -/- erano più suscettibili all’infezione da virus della stomatite vescicolare. Oshiumi et al. (2010) ha concluso che RIPLET è essenziale per regolare la risposta immunitaria innata RIGI-mediata contro l’infezione da virus RNA in vivo.

Kok et al. (2011) ha osservato che RIGI condivide la somiglianza strutturale con DICER (606241), una nucleasi di tipo RNasi III che media l’interferenza dell’RNA e richiede partner che legano dsRNA, come PACT (PRKRA; 603424), per un’attività ottimale. Hanno dimostrato che il PATTO è fisicamente legato al dominio di repressione del terminale C di RIGI e ha stimolato la produzione IFN di tipo I indotta da RIGI. PACT ha potenziato l’attivazione di RIGI da parte di poly (I:C) e ha contribuito a sostenere le risposte antivirali. Kok et al. (2011) ha concluso che PACT ha un ruolo importante nell’avviare e sostenere le risposte antivirali RIGI-dipendenti.

Goubau et al. (2014) ha dimostrato che RIGI, codificato da DDX58, media le risposte antivirali agli RNA con 5-prime-difosfati (5-prime-pp) e quelli con 5-prime-trifosfati (5-prime-ppp). Genomi da reovirus di mammiferi con termini 5-prime-pp, RNA 5-prime-pp isolato dal virus L-A del lievito e RNA 5-prime-pp accoppiati alla base realizzati mediante trascrizione in vitro o sintesi chimica si legano tutti a RIGI e fungono da agonisti RIGI. Inoltre, una risposta RIGI-dipendente all’RNA 5-prime-pp è essenziale per controllare l’infezione da reovirus nelle cellule coltivate e nei topi. Goubau et al. (2014) ha concluso che il determinante minimo per il riconoscimento RIGI è un RNA accoppiato alla base con 5-prime-pp. Tali RNA si trovano in alcuni virus ma non in cellule non infette, indicando che il riconoscimento dell’RNA 5-prime-pp, come quello dell’RNA 5-prime-ppp, agisce come un potente mezzo di auto/non auto discriminazione da parte del sistema immunitario innato.

Mutazioni in TDP43 (TARDBP; 605078), tra cui ala315-to-thr (A315T; 605078.0009), sono una rara causa di sclerosi laterale amiotrofica (ALS10; 612069). Tuttavia, la patologia di TDP43, che codifica una proteina ribonucleare RNA-legante coinvolta nell’elaborazione del RNA, è comune a oltre il 95% dei casi di SLA. I topi transgenici Tdp43 A315T sviluppano la degenerazione del motoneurone dipendente dall’età e fungono da modello per la SLA. Utilizzando traducendo purificazione affinità ribosoma e analisi microarray, MacNair et al. (2016) ha rilevato che diversi MRNA erano regolati in modo anomalo nei topi Tdp43 A315T sintomatici di 10 mesi rispetto ai controlli wildtype e ai topi Tdp32 A315T presintomatici di 5 mesi. Tra gli MRNA misregulated c’era Ddx58, che è stato sovraregolato oltre 2 volte nei topi mutanti. L’analisi immunoistochimica ha mostrato un’espressione Ddx58 anormalmente elevata nel citoplasma dei motoneuroni nei topi Tdp43 A315T di 10 mesi. L’espressione di DDX58 umano è stata anche sovraregolata nei motoneuroni e nelle cellule gliali circostanti nei cordoni spinali di pazienti con SLA sporadica e familiare. L’analisi di immunoprecipitazione dell’RNA ha mostrato che Ddx58 era un bersaglio diretto di Tdp43 in cellule di neuroblastoma di topo trasfette.

Struttura cristallina

Per comprendere la sinergia tra l’elicasi e il dominio repressore per il legame dell’RNA e il contributo dell’idrolisi dell’ATP all’attivazione di RIGI, Jiang et al. (2011) ha determinato la struttura del dominio repressore umano RIGI helicase in complesso con dsRNA e un analogo ATP. Il dominio helicase repressor si organizza in un anello attorno a dsRNA, tappando un’estremità, mentre contatta entrambi i fili usando motivi precedentemente non caratteristici per riconoscere dsRNA. Lo scattering a raggi X di piccolo angolo, la proteolisi limitata e la fluorimetria a scansione differenziale hanno indicato che RIGI è in una conformazione estesa e flessibile che si compatta sull’RNA legante. Questi risultati hanno fornito una visione dettagliata del ruolo dell’elicasi nel riconoscimento del dsRNA, della sinergia tra il dominio repressore e l’elicasi per il legame dell’RNA e dell’organizzazione dei RIGI a lunghezza intera legati al dsRNA, e hanno fornito prove di un cambiamento conformazionale sul legame dell’RNA. La struttura del dominio del repressore dell’elicasi RIGI è coerente con la traslocazione del dsRNA senza svolgimento e legame cooperativo con l’RNA. La struttura ha prodotto una visione senza precedenti dell’immunità innata e ha avuto un impatto più ampio su altre aree della biologia, tra cui l’interferenza dell’RNA e la riparazione del DNA, che utilizzano domini elicasi omologhi con DICER (606241) e FANCM (609644).

Peisley et al. (2014) ha riportato la struttura cristallina del tetramero del dominio di attivazione e reclutamento caspasi tandem RIGI umano (2CARD) legato da 3 catene di diubiquitina legata a lys63 (K63-Ub2). 2CARD si assembla in un tetramero elicoidale simile a una “rondella di bloccaggio”, in cui la superficie tetramerica funge da piattaforma di segnalazione per il reclutamento e l’attivazione della molecola di segnalazione a valle, MAVS (609676). Le catene di ubiquitina sono legate lungo il bordo esterno della traiettoria elicoidale, colmando le subunità adiacenti di 2 CARTE e stabilizzando il tetramero a 2 CARTE. La combinazione di analisi strutturali e funzionali ha rivelato che l’avidità di legame determina la specificità del legame K63 e della lunghezza della catena di 2CARD e che la coniugazione covalente dell’ubiquitina di 2CARD stabilizza ulteriormente l’interazione Ub-2CARD e quindi il tetramero 2CARD.

Sindrome di Singleton-Merten 2

In una grande famiglia coreana di 4 generazioni con glaucoma, calcificazione aortica e valvolare e anomalie scheletriche (SGMRT2; 616298), Jang et al. (2015) ha identificato l’eterozigosità per una mutazione missense nel gene DDX58 (E373A; 609631.0001) che si è segregata con la malattia. Gli individui affetti in un’altra famiglia coreana con SGMRT2 che mostravano solo glaucoma e anomalie scheletriche erano eterozigoti per una diversa mutazione missense in DDX58 (C268F; 609631.0002). L ‘analisi funzionale ha rivelato che entrambe le mutazioni conferiscono attivazione costitutiva e determinano un aumento dell ‘attività dell’ interferone e dell ‘espressione genica stimolata dall’ interferone.

Associazioni in attesa di conferma

A causa del tasso di fallimento primario dal 2 al 10% della vaccinazione contro il morbillo e dell’importanza dell’immunità innata per prevenire o ridurre la replicazione virale e la diffusione fino alla risposta immunitaria adattativa per eliminare il virus, Haralambieva et al. (2011) ha eseguito uno studio completo di candidate gene association in una coorte razziale di 745 scolari sani in Minnesota che avevano avuto 2 dosi di vaccino contro il morbillo. Varianti all’interno della DDX58 sono state associate a variazioni anticorpali specifiche per il morbillo nei caucasici. Quattro polimorfismi DDX58 nello squilibrio ad alto legame sono stati anche associati a variazioni nella secrezione IFNG specifica per il morbillo e IL2 (147680) nei caucasici. Le varianti ADAR (146920) hanno anche avuto un ruolo nella regolazione delle risposte IFNG specifiche del morbillo nei caucasici. Due SNP intronici OAS1 (164350) sono stati associati ad un aumento dei livelli di anticorpi neutralizzanti negli afroamericani. Haralambieva et al. (2011) ha concluso che più geni di immunità innata e varianti genetiche sono probabilmente coinvolti nella modulazione della risposta immunitaria adattativa al vaccino vivo attenuato del morbillo nei caucasici e negli afroamericani.

Kato et al. (2005) ha generato topi Rigi-carenti e, usando cellule di questi topi, ha scoperto che Rigi, e non il sistema TLR, ha svolto un ruolo essenziale nelle risposte antivirali nei fibroblasti e nelle cellule dendritiche convenzionali (DCS). Al contrario, le risposte antivirali nei DCS plasmacitoidi, che producono abbondanti IFNA (147660), hanno utilizzato il sistema TLR, principalmente Tlr7 (300365) e Tlr9 (605474), piuttosto che Rigi. I topi Rigi – / – raramente sono sopravvissuti fino alla nascita e l’esame istologico dei topi embrionali day-12.5 ha mostrato una massiccia degenerazione del fegato. I sopravvissuti avevano ritardato la crescita e sono morti entro 3 settimane dopo la nascita.

Utilizzando topi carenti di MDA5( 606951), Kato et al. (2006) ha dimostrato che MDA5 e RIG1 riconoscono diversi tipi di RNA a doppio filamento: MDA5 riconosce l’acido poliinosina-policitidilico e RIG1 rileva gli RNA a doppio filamento trascritti in vitro. I virus a RNA sono anche riconosciuti in modo differenziato da RIG1 e MDA5. Kato et al. (2006) ha scoperto che RIG1 è essenziale per la produzione di interferoni in risposta ai virus a RNA inclusi i paramixovirus, il virus dell’influenza e il virus dell’encefalite giapponese, mentre MDA5 è fondamentale per il rilevamento del picornavirus. Inoltre, i topi Rig1-null e Mda5-null sono altamente suscettibili all’infezione con questi rispettivi virus a RNA rispetto ai topi di controllo. Kato et al. (2006) ha concluso che, presi insieme, i loro dati mostrano che RIG1 e MDA5 distinguono diversi virus a RNA e sono fondamentali per le risposte antivirali dell’ospite.