Le cellule chimeriche del recettore dell’antigene T (CAR-T) hanno mostrato una notevole attività nelle neoplasie ematologiche. Le molecole dell’AUTOMOBILE sono create fondendo il singolo frammento variabile a catena (scFv) derivato da un anticorpo che mira ad un antigene di superficie con il dominio di segnalazione della cellula T. Queste molecole sono innestate sulle cellule T attraverso un processo ingegneristico che utilizza più comunemente retro-o lentivirus, o, in alcuni casi, plasmidi. CD19 è un bersaglio razionale per le neoplasie a cellule B, inclusi i linfomi, poiché è espresso sulle cellule B durante tutte le fasi di differenziazione e nelle cellule che si sono trasformate malignamente . Le cellule CAR-T dirette contro CD19 hanno mostrato risposte eccellenti nei pazienti con linfomi a cellule B recidivanti o refrattari, in particolare il linfoma a cellule B di grandi dimensioni diffuso (DLBCL) con alcune remissioni durature , ottenendo l’approvazione della FDA per questa indicazione. Tuttavia sono necessari obiettivi alternativi per altri tipi di linfoma che mancano di espressione CD19, comprese malattie come il linfoma classico di Hodgkin (HL), il linfoma anaplastico a grandi cellule (ALCL) e altri linfomi a cellule T.
Sebbene la maggior parte dei pazienti con HL sia curata con terapie di prima linea, circa il 15% dei pazienti ha una malattia refrattaria primaria o una recidiva successiva dopo una risposta iniziale al trattamento . Lo standard di cura per i pazienti che ricadono dopo il trattamento di prima linea è la chemioterapia ad alte dosi seguita da trapianto autologo di cellule staminali (ASCT) con circa la metà dei pazienti che ricadono dopo il trapianto . Sfortunatamente, la prognosi per questi pazienti è scarsa, con il trapianto di cellule staminali allogeniche (alloSCT) che offre tradizionalmente le migliori possibilità di remissione sostenuta . Tuttavia, questo trattamento è anche associato a una significativa morbilità e mortalità. Sono necessarie nuove terapie per i pazienti con HL recidivante e refrattario.
ALCL è un sottotipo di linfoma a cellule T periferiche con caratteristiche eterogenee . Mentre la prognosi per il linfoma anaplastico chinasi-positivo (ALK+) ALCL è buona, con tassi di sopravvivenza a 5 anni che vanno generalmente dal 70 al 90%, ALCL ALK-negativo ha una prognosi più protetta, con tassi di sopravvivenza a 5 anni del 40-60% . La terapia di salvataggio per i pazienti con la malattia chemosensitive consiste generalmente della chemioterapia ad alta dose seguita da ASCT. Tuttavia, la prognosi per i pazienti con ALCL recidivante/refrattario che non sono eleggibili per il trapianto o falliscono la terapia di seconda linea è triste, con uno studio retrospettivo che mostra una sopravvivenza libera da progressione mediana e una sopravvivenza globale di 3 e 1,8 mesi, rispettivamente . Sono pertanto necessari approcci terapeutici alternativi per il trattamento di pazienti con ALCL recidivante o refrattario.
Una caratteristica distintiva sia per HL che per ALCL è la presenza di una molecola di superficie comune, CD30, un recettore transmembrana e membro della superfamiglia del recettore del fattore di necrosi tumorale (TNF). CD30 è anche espresso in altri linfomi, tra cui universalmente nella papulosi linfomatoide e in alcuni casi di DLBCL, linfoma primario mediastinico a cellule B, micosi fungoidi, linfoma periferico a cellule T e leucemia/linfoma a cellule T adulte . Nuovi trattamenti sono necessari anche per questi linfomi, soprattutto per i pazienti che non rispondono al trattamento iniziale.
CD30 è un candidato eccellente per le terapie immunitarie-basate dovuto la sua espressione limitata sulle cellule tumorali , con espressione limitata su piccoli sottoinsiemi dei linfociti (non maligni) normali attivati, piombo al rischio basso per fuori dal tumore sulla tossicità dell’obiettivo.
Il CD30 è stato ampiamente esplorato come terapia basata sugli anticorpi, dal nudo all’immuno-coniugato. I risultati più notevoli sono stati ottenuti con brentuximab vedotin (BV), un coniugato anticorpale diretto contro CD30, che ha effettivamente mostrato una buona tolleranza e un’attività promettente nei linfomi CD30+, con un tasso di risposta globale (ORR) del 75% e un tasso di risposta completa (CR) del 34% nei pazienti con HL recidivato o refrattario e un tasso di risposta globale (ORR) dell ‘ 86% e un tasso di CR del 57% in ALCL sistemico recidivato o refrattario . Sebbene BV sembra avere risposte eccellenti, questi di solito non sono durevoli con solo il 22% dei pazienti con HL recidivato o refrattario non aver progredito dopo 5 anni . Per superare alcune delle sfide con la terapia basata su anticorpi, vale a dire la persistenza limitata e la penetrazione del tumore , sono state esplorate le cellule CAR-T. Il successo e la tollerabilità di BV hanno fornito prove della fattibilità del targeting di CD30 con cellule CAR-T.
Studi preclinici di cellule CAR-T dirette da CD30
I primi studi di cellule CAR-T mirate a CD30 sono stati eseguiti alla fine degli anni ‘ 90 da Hombach et al. e ha mostrato citolisi efficace delle linee cellulari CD30 + HL in vitro . Tuttavia queste molecole di AUTO mancavano di segnalazione co-stimolante, che limitava la loro efficacia. Savoldo et al. proposto di esprimere questa molecola AUTO sul virus (Virus di Epstein Barr)-cellule T citotossiche specifiche (EBV-CTLs) per garantire che queste cellule chimeriche ricevessero segnali costimulatori appropriati nel tempo. Come previsto, queste cellule hanno mantenuto la loro capacità di riconoscere e uccidere i tumori EBV+ mentre, allo stesso tempo, mirando alle cellule tumorali CD30+ (come le linee cellulari tumorali HL e ALCL) sia in vitro che in vivo in un modello murino xenogenico . I successivi progressi nel processo di ingegneria hanno introdotto endodomains co-stimolatori all’interno della molecola AUTO, che ha reso la produzione meno ingombrante e la necessità di cellule T con doppia specificità antigene obsoleto .
Indipendentemente da ciò, questi studi hanno affrontato le principali sfide teoriche associate al targeting della molecola CD30. Prima di tutto, un aumento dei livelli di CD30 solubile sono presenti nel plasma di pazienti con HL e ALCL, sollevando preoccupazioni di concorrenza per il legame con l’AUTO . Tuttavia, studi in vitro hanno dimostrato che livelli elevati di CD30 solubile non hanno avuto un impatto negativo sull’attività delle cellule CAR-T dirette da CD30 , probabilmente perché l’epitopo preso di mira dall’AUTO non viene trattenuto nella forma solubile della molecola o perché sono necessarie più molecole immobilizzate per attivare la segnalazione dell’AUTO.
In secondo luogo, questi studi hanno esplorato i livelli di espressione della molecola CD30 per sensibilizzare l’uccisione delle cellule CAR-T. CD30 è espresso transitoriamente da un sottoinsieme di linfociti al momento dell’attivazione che solleva preoccupazioni per l’eliminazione prematura delle cellule T o B durante le risposte virali. Ampi studi ex vivo hanno tuttavia escluso questo problema, suggerendo che il livello di sovraregolazione CD30 nelle cellule T di memoria che rispondono alla stimolazione dell’antigene associato al virus è inferiore a quello presente sulle cellule tumorali e quindi incapace di attivare completamente il macchinario di uccisione. L’antigene che percepisce dalle molecole dell’AUTOMOBILE sta diventando una caratteristica importante, poichè l’espressione differenziale delle molecole targetable fra le cellule normali vs del tumore infine detterà la selezione del scFv per le applicazioni dell’AUTOMOBILE contro i tumori solidi. Tuttavia, il potenziale per le cellule CAR-T dirette al CD30 di eliminare le cellule T allo-reattive o le cellule T regolatorie (Treg), che sembrano esprimere CD30 a un livello significativamente più alto, rimane da esplorare completamente e potrebbe aprire questo approccio ad altre applicazioni nel campo del trapianto di cellule staminali.
Un ultimo aspetto importante affrontato in questi studi preclinici riguardava la resistenza di alcune cellule CD30+ all’uccisione mediata dalle cellule CAR-T. CD30 è infatti espresso da staminali ematopoietiche e cellule progenitrici (HSPCS) durante l’attivazione , potenzialmente portando a disturbi di emopoiesi tra cui aplasia del midollo osseo. Tuttavia, confrontando la potenza delle cellule CAR-T dirette da CD30 contro le cellule CD30+ HSPCs e CD30 + MyLa cellule cutanee di linfoma a cellule T, è stata osservata un’attività minima contro le prime. Inoltre, gli HSPC che sono stati ordinati in cellule CD30 + e CD30-hanno mostrato citolisi solo leggermente superiore in presenza di cellule CAR-T, che era tuttavia molto più bassa rispetto alla lisi delle cellule del linfoma MyLa . Anche gli HSPC che sono stati co-coltivati con cellule CAR – T dirette a CD30 hanno avuto una normale formazione di colonie mieloidi, con solo una leggera diminuzione della formazione di colonie eritroidi. È importante sottolineare che il trasferimento adottivo di cellule CAR-T autologhe dirette a CD30 durante la ricostituzione di HSPC in topi umanizzati non ha prodotto alcuna compromissione nelle cellule T e B periferiche umane, suggerendo l’emopoiesi conservata e confermando la mancanza di tossicità significativa del midollo osseo.
Oltre all’espressione differenziale di CD30 sugli HSPC a un livello inferiore alla soglia per l’attivazione delle cellule CAR-T, sembra probabile una certa resistenza intrinseca delle cellule progenitrici. Gli HSPCS esprimono livelli più elevati di proteasi della serina SP6/PI-9 che inattiva granzyme B, un importante facilitatore dell’apoptosi mediata dalle cellule T. Sebbene cellule diverse utilizzino strategie diverse, questa osservazione è coerente con studi su cellule embrionali e tumori che, nonostante esprimano CD30, sono più resistenti all’uccisione delle cellule CAR-T.
Studi clinici su cellule CAR-T dirette CD30
Sono stati pubblicati fino ad oggi due studi su cellule CAR-T dirette CD30, con entrambi gli studi che mostrano che questo trattamento è ben tollerato con una certa attività antitumorale (Tabella 1). I due studi hanno utilizzato diversi scFv, segnali costimulatori, sistemi di consegna, regimi di preparazione e dosi, rendendo difficili i confronti da eseguire, fornendo allo stesso tempo ampi scenari di funzione.
Wang et al. trattati 18 pazienti con linfoma CD30+ recidivante/refrattario (17 con HL e 1 con ALCL cutaneo) con un CAR anti-CD30 . Questa VETTURA (derivata dall’anticorpo AJ878606.1) ha utilizzato l’endodominio costimulatorio 4-1BB e un vettore lentivirale per l’ingegneria delle cellule T. Dei 18 pazienti trattati, 9 avevano ricevuto una precedente ASCT e 5 erano stati trattati con BV. I pazienti hanno ricevuto una dose media di 1.56 × 107 cellule CAR-T / kg dopo un regime di linfodepleting, costituito da 3 diverse combinazioni, che ha causato un certo grado di citopenie . Tutti i pazienti hanno avuto una reazione febbrile di infusione di grado 1 o 2 (febbri e brividi) che si è ripresa durante la notte. C’erano solo due tossicità di grado 3 o superiore: un paziente presentava anomalie nei test di funzionalità epatica ritenute secondarie alla tossicità da linfodepletione e un paziente aveva disfunzione sistolica, probabilmente correlata a una precedente esposizione alle antracicline. Non c’era alcuna sindrome da rilascio di citochine.
Su 18 pazienti trattati e valutabili per la risposta, 7 pazienti avevano una risposta parziale (PR) e 6 pazienti avevano una malattia stabile (DS) dopo infusione Non c’erano CR e l’ORR era del 39%. La sopravvivenza libera da progressione mediana è stata di 6 mesi con 4 pazienti che hanno continuato la risposta al momento della pubblicazione. Ci sono stati 5 pazienti che hanno ricevuto una seconda infusione di cellule CAR-T, con 3 pazienti che hanno mantenuto la PR dopo il 2 ° trattamento, 1 paziente che ha mantenuto la SD e 1 paziente che ha ottenuto una PR dopo essere stato valutato come avente SD dopo la 1a infusione. I linfonodi sembravano rispondere meglio al trattamento rispetto alla malattia extranodale e le lesioni polmonari sembravano rispondere meno al trattamento, anche se è difficile trarre conclusioni con una dimensione del campione così piccola.
Nella maggior parte dei pazienti trattati, AUTO transgene livelli nel sangue periferico ha raggiunto la posizione 3-9 giorni dopo l’infusione e diminuito di base a 4-8 settimane dopo l’infusione di un maggior numero di AUTO transgeni così come una diminuzione del numero di CD30+ cellule tumorali sono stati trovati in alcuni pazienti che hanno avuto tumore biopsie eseguite in quel momento, suggerendo che funzionali di AUTO-cellule T trafficate siti tumorali.
Ramos et al. riportati i risultati di 9 pazienti con linfoma CD30+ recidivante/refrattario (6 con HL, 1 con ALCL cutaneo ALK negativo, 1 con ALCL sistemico ALK+ e 1 con DLBCL evoluto in HL) . Per questo studio, il CAR CD30 (derivato dall’anticorpo HSR3) è stato combinato con un endodominio costimolante CD28 e consegnato nelle cellule T tramite un vettore gammaretrovirale . Dei 9 pazienti trattati, 8 presentavano una malattia attiva al momento dell’infusione cellulare. Tutti i pazienti erano stati pretrattati pesantemente e avevano avuto una ricaduta dopo 3 o più linee di terapia precedenti, 7 erano stati precedentemente trattati con BV e 6 avevano avuto una ricaduta dopo ASCT.
I pazienti hanno ricevuto fino a 2 × 108 cellule CAR-T dirette CD30/m2 senza un regime di linfodepleting somministrato prima dell’infusione . Il trattamento è stato ben tollerato senza tossicità attribuibile alle cellule CAR-T o episodi di sindrome da rilascio di citochine riportati. Gli autori hanno anche monitorato l’immunità delle cellule T agli antigeni virali prima e dopo l’infusione e non hanno trovato alcuna differenza nella risposta delle cellule T ai patogeni virali comuni . Inoltre, non ci sono state segnalazioni di infezioni virali dopo il trattamento con cellule CAR-T CD30.
Su 8 pazienti trattati con malattia attiva al momento dell’infusione, 2 pazienti sono entrati nella CR con 1 paziente con ALK+ ALCL che ha mantenuto la CR per 9 mesi prima della ricaduta e l’altro paziente con HL che ha continuato ad essere nella CR per più di 2,5 anni al momento della pubblicazione . Tre pazienti presentavano SD e 3 pazienti presentavano malattia progressiva. L’unico paziente trattato che era già in CR al momento dell’infusione dopo aver ricevuto la chemioterapia di salvataggio post ASCT ha mantenuto una CR per oltre 2 anni al momento della pubblicazione. La maggior parte delle risposte è stata osservata nei pazienti che hanno ricevuto il livello di dose più alto. C’è stata un’espansione dose-dipendente delle cellule CAR-T nel sangue periferico e i livelli hanno raggiunto il picco entro 1 settimana dall’infusione e sono diminuiti successivamente, ma i segnali CAR erano ancora rilevabili 6 mesi dopo l’infusione in 6 pazienti .
Nonostante entrambi gli studi dimostrino una buona tollerabilità e alcuni effetti, i risultati sono modesti rispetto a quelli ottenuti con cellule CAR-T dirette a CD19. Ci sono attualmente diversi studi clinici in corso con diversi costrutti di cellule CAR-T CD30 in linfomi recidivati / refrattari che affrontano modi per migliorare l’esito (Tabella 2).
Direzioni future delle cellule CAR-T dirette da CD30
Le strategie di dissezione per migliorare le cellule T CD30-CAR devono essere graduali e sfaccettate.
Prima di tutto, i regimi di linfodepleting devono essere considerati a fondo (Fig. 1 bis). La chemioterapia di linfodepleting o condizionamento somministrata prima dell’infusione di cellule CAR-T migliora chiaramente la persistenza e l’efficacia delle cellule CAR-T dirette al CD19 . La chemioterapia linfodepleting riduce il carico tumorale del paziente e il numero di cellule soppressive . Il microambiente HL, in particolare, ha numerose cellule inibitorie tra cui Treg, cellule T helper di tipo 2 e macrofagi associati al tumore (TAM) , che supportano la sopravvivenza delle cellule di Hodgkin Reed Sternberg (HRS), le cellule maligne in HL . Pertanto, in HL, linfodepletion può inoltre rendere le cellule di linfoma più suscettibili all’eliminazione delle cellule CAR-T interrompendo questo microambiente inibitorio. Infine, lymphodepletion rimuove le cellule sink concorrenti, rendendo le citochine IL-7 e IL-15 prontamente disponibili per l’espansione delle cellule CAR-T.
a. La chemioterapia di Lymphodepleting riduce il numero delle cellule soppressive, quali le cellule T regolatorie ed il tipo 2 cellule dell’assistente, che possono disturbare il microenvironment del tumore. Stimola anche la produzione di citochine, come IL-7 e IL-15, che possono promuovere l’espansione delle cellule CAR-T. b. Le cellule di Hodgkin Reed-Sternberg producono timo e chemochina regolata dall’attivazione / CC chemochina ligando 17 (TARC/CCL17) e chemochina derivata dai macrofagi (MDC/CCL22), che attirano le cellule helper di tipo 2 e le cellule T regolatorie che esprimono CCR4. Le cellule CAR-T progettate per esprimere CCR4 potrebbero aver migliorato il traffico verso il sito tumorale. c. Le cellule anti-CD30 CAR-T sono state trovate per esprimere PD-1, che suggerisce che possono essere suscettibili alla via PD-1/PD-L1 che conduce all’inibizione immunitaria. Inoltre, le cellule di Hodgkin Reed-Sternberg esprimono anche PD-L1, che può avere un effetto inibitorio sulle cellule CAR-T che esprimono PD-1. Gli inibitori del checkpoint possono interrompere il percorso PD-1/PD-L1 e portare a una migliore espansione e persistenza delle cellule CAR-T. I fattori di crescita, come il fattore stimolante le colonie 1 (CSF1) stimolano i macrofagi associati al tumore (TAM) ad essere antinfiammatori e promuovono lo sviluppo del tumore. Le combinazioni con gli inibitori del recettore CSF1 (CSF1R) potrebbero aiutare a interrompere il microambiente tumorale inibitorio e migliorare l’efficacia delle cellule CAR-T
Non è noto il regime linfatico ottimale da utilizzare con cellule CAR-T CD30. Nel loro studio clinico su cellule CAR-T dirette a CD30, Wang et al. pazienti trattati con 1 su 3 diversi regimi di condizionamento (costituiti da fludarabina e ciclofosfamide, o gemcitabina, mustargen e ciclofosfamide, o nab-paclitaxel e ciclofosfamide), ma non hanno trovato una differenza statisticamente significativa tra loro . Molti studi in corso utilizzano fludarabina e ciclofosfamide come linfodepletione, estrapolando dai dati con studi clinici CAR-T diretti a CD19 (vedere Tabella 2; NCT02259556, NCT02917083, NCT03049449). Un regime alternativo esplorato combina fludarabina e bendamustin come linfodepletione (NCT02690545). Un altro approccio è quello di infondere pazienti con cellule CD30 CAR-T come consolidamento dopo ASCT. In questo scenario, ASCT agisce come l’ultimo regime di linfodepletion, portando ad alti livelli di citochine stimolanti come IL-7 e IL-15 che possono supportare l’espansione delle cellule CAR-T ed eliminare le cellule linfoidi soppressive . È in corso uno studio clinico di cellule CAR-T dirette a CD30 come consolidamento dopo ASCT in pazienti con linfomi CD30+ (NCT02663297).
Un altro aspetto importante da considerare per le neoplasie CD30 è la localizzazione della malattia (Fig. 1 ter). I linfomi sono principalmente una malattia dei tessuti linfoidi (linfonodi e midollo osseo), ma i tumori CD30+ presentano ulteriori sfide. In HL, l’ambiente chemochine è molto importante nell’influenzare quali cellule si accumulano nel tumore . Le cellule HRS producono timo e chemochina regolata dall’attivazione / CC chemochina ligando 17 (TARC/CCL17) e chemochina derivata dai macrofagi (MDC/CCL22). Queste chemochine attirano le cellule che esprimono il loro recettore affine, CCR4, come le cellule helper di tipo 2, i Treg e le cellule soppressori derivate mieloidi (MDSC) . L’infiltrazione di queste cellule protegge le cellule HRS creando non solo un ambiente soppressivo, ma anche una barriera fisica dall’accesso dei linfociti T citotossici. Per garantire il traffico preferenziale verso le cellule HL, Savoldo et al. cellule T create che, oltre ad esprimere l’AUTO CD30, hanno anche co-espresso il recettore della chemochina, CCR4 . Hanno scoperto che le cellule CAR-T dirette a CD30 che esprimevano CCR4 avevano migliorato la migrazione al tumore e aumentato l’attività anti-linfoma rispetto alle cellule CAR-T dirette a CD30 che non esprimevano CCR4 nei modelli murini HL . Una preoccupazione per questo approccio è che TARC e MDC sono prodotti da altri tessuti, come la pelle, che potrebbero aumentare la tossicità. Tuttavia, poiché il CD30 non è espresso in questi siti, le cellule CAR-T dirette da CD30 non dovrebbero causare tossicità tumorale sull’obiettivo. Invece, le cellule CAR-T dirette da CD30 che co-esprimono CCR4 potrebbero anche essere più efficaci nei linfomi cutanei CD30+ a causa di un maggiore traffico sulla pelle. Uno studio clinico di cellule CAR-T dirette a CD30 che co-esprimono CCR4 in pazienti con linfomi CD30+ recidivati/refrattari è previsto per l’apertura nel prossimo futuro.
Come descritto sopra, l’ambiente tumorale dei linfomi e dell’HL, in particolare, è ricco di cellule e molecole inibitorie. Pertanto, è imperativo considerare l’associazione dell’AUTO CD30 con altri regolatori immunitari. Tra le strategie candidate, inibitori del checkpoint immunitario (ICIs, Fig. 1c) sono la chiave. Ciò è particolarmente interessante in HL, dove le ICI hanno mostrato un’eccellente attività di singolo agente . Inoltre, Ramos et al. trovato che PD1 è stato espresso dal 33% delle cellule CAR-T CD30-dirette infuse , il che suggerisce che queste cellule rimarranno suscettibili alla via inibitoria PD1/PDL1 una volta al sito del tumore. Nei casi segnalati di pazienti che hanno progredito dopo aver ricevuto cellule CAR-T dirette al CD19 e successivamente sono stati trattati con pembrolizumab, è stata osservata una nuova espansione delle cellule CAR-T CD19 e una risposta clinica . Tuttavia, è necessario identificare la tempistica e il sequenziamento ottimali della combinazione per le cellule ICIS e CD30 CAR-T. Inoltre, l’effetto di questa combinazione sugli eventi avversi correlati al sistema immunitario e sulla sindrome da rilascio di citochine non è noto. In alternativa, con i progressi nell’ingegneria genetica, la downregolazione selettiva dei recettori inibitori da parte delle cellule T CAR rappresentano alternative intriganti .
La presenza di MDSC e il loro ruolo nella protezione del tumore in HL richiede anche test di combinazioni con nuovi modulatori come inibitori del recettore del fattore 1 stimolante le colonie (CSF1R), poiché gli MDSC esprimono CSF1R . Inoltre, i fattori di crescita, come il CSF1, stimolano i macrofagi associati al tumore ad essere antinfiammatori, o il fenotipo M2 e promuovono la crescita del tumore . L’aumento del numero di macrofagi associati al tumore è associato a prognosi peggiore in HL . Ciò supporta ulteriormente la logica degli inibitori del CSF1R nell’HL e gli studi di fase I sugli inibitori del CSF1R sono stati testati nell’HL e mostrano una buona tolleranza ma un’efficacia limitata . Tuttavia, le combinazioni con le cellule T CD30CAR possono rivelarsi utili.