内因性(6s)-5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸結合大腸菌DHFR複合体の結晶化による単離
eDHFRの構造:FH4二成分複合体を、ＥＤＨＦＲ：葉酸：ｎａｄｐ＋閉鎖三元複合体（ＰＤＢ Ｉｄ：７Ｄｆｒ）５ ０を用いた分子置換によって決定した。 図に示すように。 図2に示すように、明確な電子密度は、6s立体異性体と一致するsp3C6の四面体幾何学に基づいてFH4として共精製された内因性配位子を確認する。 これは、同様の結晶化条件から得られたfh2バイナリ複合体におけるsp2C6の三角平面幾何学とは対照的に立っています。
eDHFR:FH4(緑、上図)とeDHFR:FH2(オレンジ、下図)錯体の配位子構造の比較。 配位子の周りに輪郭を描かれたFo–Fc省略電子密度マップは3.0μレベルで示されています。 右側のビューは、左側に表示されている視点から垂直軸を中心に反時計回りに90°回転します。 Fh4およびFH2は棒として示されています。 C6炭素原子はマゼンタで着色されており、FH4とFH2の異なるハイブリダイゼーション状態はマゼンタのポインティング矢印で示されている。 他のすべての原子は、赤色の酸素、青色の窒素、緑色の炭素、およびfh4およびFH2のオレンジ色のように着色されている。 表示を簡単にするために、非水素原子のみが示されています
我々はFH4複合体を得る理由を理解するために、他の人が失敗しているのに対し、我々は二つの異なるリガンド複合体（fh4対FH2）の起源は、結晶収穫のタイ 時間コースの研究を図に示す。 結晶成長の異なる日で結合した配位子の電子密度の変化に続く図3は、fh4からFH2崩壊（C6位置でのsp3からsp2遷移に反映される）が結晶化セット
Fo–Fcの時間経過のステレオビューでは、FH4からFH2への変換に対応する電子密度マップの変化を省略しています。 配位子の周りに輪郭を描かれたFo–Fc省略電子密度マップは3.0μレベルで示されています。 EDHFR:FH4二元錯体結晶は、室温で暗所で成長させた。 各時点で、独立した結晶滴からの単結晶を、ｘ線回折のためのフラッシュ凍結によって回収した。 Fh4とFH2の配位子構造は、それぞれ2日と14日で完全に精製された二元錯体構造であり、電子密度の変化と比較するための参考として、各図に示されている。 3および6日で収穫された結晶の省略マップは、配位子または溶媒を導入することなく、最初の構造微細化後に生成された。 タンパク質構造の重ね合わせは、Pymol69を用いて行われました
これは、本物のFH4結合単一ドメインDHFR複合体が単離されていることを我々の知識に初めてです。 我々は、eDHFR:FH4複合体の結晶化を再現するためのプロトコルを検証し、結晶収穫の各時点で少なくとも二つの独立した複製によってFH4からFH2崩壊の時 1). 配位子の崩壊の時間経過に沿った中間電子密度は、c6位置でのsp3からsp2への遷移と、結合した配位子のベンゾイル環の付随する回転を明確に表 3). これは前方触媒方向の遷移状態配位子立体配座に似ていると考えられる。 結晶成長中に観察されたFH4からFH2への崩壊は、FH4からFH2への変換を含むDHFRによる逆触媒作用を反映していない可能性が高い。 また、結晶化滴が結晶成長中に暗所で室温でインキュベートされ、FH4からFH2崩壊の時間経過が日のオーダーであることを考慮すると、おそらく光によっ 我々はまた、還元剤ジチオトレイトール（DTT）またはトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）との共結晶化を2-3mM濃度で試験しただけでなく、DTTまたはTCEPを20分までの結晶浸漬を2日、3日、14日まで7.5ヶ月で収穫する前に導入した。 再び、これらの手順は、この研究で同定された結晶形態におけるeDHFR：FH4複合体の減衰時間経過に沿って定性的にリガンド電子密度変化の再現性に影響 1). したがって、現在の結晶化プロトコルは、優先的にeDHFRタンパク質サンプルで共精製された内因性FH4複合体を結晶化し、結晶中のその崩壊は、我々がテストした条件下で不可逆的である可能性が高い酸素の有限レベルでの酸化に起因する可能性が高い。 FH2からfh4を生産する急速な前方触媒反応は、in vivoのようにNADPHの過剰量の存在下で熱力学的に好まれるが、我々はin vitro結晶化条件下でここで観察されたようにfh4複合体のバックFH2複合体への遅い崩壊は、NADPHの継続的な供給なしに発生する可能性があります。 このように、長年追求されてきたFH4複合体がなぜ得ることが困難であったのかの謎は、その本質的な不安定性であることが明らかになった。 それは非常に可能性が高い化学的に不安定なFH4複雑な構造を得ることの私達の成功へのキーはここに識別される結晶化の条件の下で2日の成長 また、DHFR分野の調査では、多くの結晶学的19が示されています,20,24,28,29,32,43,45,47,48,50,51,52 とNMR12,13,15,17,19,25,26 DHFRの研究は、目的の外因性リガンドを導入する前に、内因性リガンドを除去するために透析を適用した。 我々は、タンパク質サンプルの透析または追加の基質または製品の導入なしで内因性FH4結合DHFR複合体を単離する結晶化条件を同定した。 我々は、eDHFR：FH4複合体の現在の結晶化条件は、eDHFR：FH2：NADP（H）三元複合体のような他の形態よりもFH4結合型を好むと仮定している。
eDHFR:FH4複合体の構造特性
FH4複合体はeDHFRに閉塞した立体配座を採用している（図を参照。 4および5）。 これは、触媒サイクルのすべての基底状態FH4バイナリと三元錯体（ポスト水素化物移動とSp2c6でsp3変換）が閉塞立体配座で発生することを示唆 これは、FH4の傾いたプテリン環とNADP(H)のニコチンアミド環との立体衝突によるものであり、これはMet20ループの閉じた立体配座で起こる（図。 5)12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,35,36,37,38. 図に示すように。 図4に示すように、FH4は、ファンデルワールス接触および活性部位残基および水との良好な極性相互作用を有する。 特に、Asp27およびArg57を有する二つの二座塩橋は、それぞれFH4、アミノピリミジン（N3および環外-NH2）、およびα-カルボキシレートの両端を、基質/アナログ複合体12、20、24、45のようにほぼ同一の位置に固定している。
eDHFR:FH4複合体の活性部位構造は、ステレオビューで示されています。 FH4の4Å以内の側鎖（シアン）（緑）およびMet20ループ（黄色）は棒として示されている。 二次構造は灰色で表示され、fh4の3.5Å以内の水は球として表示される。 Fh4との極性相互作用は破線で示されている。 FH4を省略したFo–Fc電子密度マップは3.5μレベルで赤色で示され、2FO–Fc省略マップは1.0μレベルで青色で示されています。 Ile14-Gly15アミド結合の三つの立体配座は、破線の円と赤い矢印で示されています。 b Ile14-Gly15リンケージの拡大図
fh4複合体とFH2およびFH4アナログ複合体の重ね合わせ。 現在のFH4、FH2、および報告されたeDHFR複合体とその閉塞Met20ループ立体配座、Phe31残基と対応する配位子と一緒に報告された5-ホルミル-FH4複合体は、それぞれ、緑、マゼンタ、および黄色で着色されている。 ＰＤＢ Ｉｄ：１ＤＹＪ（ＤＤＦＨ４）４ ５、５ＣＣＣ（ＤＤＦＨ４：ＮＡＤＰ＋）１ ２、１ＲＦ７（Ｆ Ｈ２）２ ４、４ＰＤＪ（Ｆ Ｈ２：ＮＡＤＰＨ）２ ０、および４ＰＳＹ（葉酸：ＮＡＤＰ＋）２ ０からの他の全ての構造は、灰色である。 赤い破線の円は、Phe31と結合した配位子に応じて二つの異なる向きを採用する配位子ベンゾイル基との間の提案されたπ–π相互作用を示している。 Fh4および5-ホルミル-Fh4は、ddfh4、FH2、および葉酸とは対照的に一つのクラスターに属し、Phe31側鎖はすべての整列した構造でほぼ同じ位置にとどまる。 Met20ループは、閉じた、部分的に閉じた、および閉塞した三つの一般的な立体配座状態に分類されます。 閉じた立体配座のみが構造的に活性部位に入るNADP（H）補因子のニコチンアミド基を収容することができます
Gly15(C=O)-wat1-FH4(N5)およびGlu17(NH)-wat2-FH4(N10)を含む水素結合ネットワークを介してMet20ループとFH4を橋渡しする2つの水分子が存在する(図 4). これらの相互作用は、以前に報告された（6R）-5,10-ジデアザテトラヒドロ葉酸（ddfh4）複合体12、45アナログの5と10の位置でC置換にNのために存在しない。 これは、fh4複合体と比較して、アナログ中のMet20立体配座の観察された違いを引き起こす可能性がある（図4）。 5). FH4複合体におけるMet20ループ立体配座に密接に類似しているPDB内で利用可能な構造は、5-ホルミル-FH4複合体である（図。 び異なるＤＨＦＲエピトープをナノモル親和性で標的とする２つのＥＤＨＦＲ−ナノボディアロステリック阻害複合体（図５、ＰＤＢ ＩＤ：１ＪＯＭ）５ １（補足図５、ＰＤＢ ＩＤ：１ＪＯＭ）５ １および２つのＥＤＨＦＲ−ナ 2、PDB Id：3K74および4EIG）28,29。 5-ホルミル-FH4複合体は、それぞれ異なる空間基P61とP212121にもかかわらず、Fh4複合体のようにGlu17（NH）とFH4（N10）の間の架橋水を保存します。 5-ホルミル-FH4は、フォリン酸またはロイコボリンとしても知られており、化学療法中のメトトレキサートの有害な影響を防止するためのFDA承認の「救助」薬です53。 Fh4のπ-カルボン基は電子密度がほとんど表示されません(Fig. 図4に示すように、配位子の他の部分よりもC Γ-C ΓまたはC Γ-C Δ c軸の周りの結合回転の障害またはより多くの自由度を示唆している。
水ネットワークに加えて、我々は、現在のFH4とFH2二元錯体と以前に報告されたeDHFR構造の構造比較に基づいて、FH4複合体および遅い生成物放出の安定化相互作用の構造的起源を見出した。 第一に、Ｖａｎ ｄｅｒ ＷａａｌｓがＧｌｕ１ ７側鎖と接触することにより、溶媒からのＦ Ｈ４のさらなる遮蔽が生じる（図１ ０Ａ）。 基質または生成物類似体(6R)-5,10-ジデアザテトラヒドロ葉酸複合体には存在しない12,20,24,45。 第二に、保存されたIle14-Gly15アミド結合の三つの代替バックボーン立体配座の明確な電子密度は、Met20ループアンカーでの局所的な柔軟性からFH4複合体の安定性へのエントロピーの寄与を示唆している（図。 4). 特に、以前の変異誘発研究では、Ile14がMet20ループの柔軟性を制御するために重要であることが示されましたが、I14V、I14A、およびI14G変異体はすべて、より遅い水素化物移動速度、結晶構造の開配座で観察されるMet20ループのより高い柔軟性、一次速度論的同位体効果の温度依存性の増加、およびハイブリッドQM/MMシミュレーションから計算されたより高い遷移状態活性化エネルギーを示した23,40。 第三に、ベンゾイル環の回転は、NADP（H）結合に関係なく、fh2、葉酸、およびddfh4複合体におけるプロトン-ニアプロトン（エッジ-ツー–エッジ）反発相互作用とは対照的に、FH4複合体における保存されたPhe31と静電的に良好なエッジ-ツー-フェイスγ-γ相互作用をもたらす（図。 図5に示すように、拡大図である。 6)54,55. この構造変化の機能的含意は、複合体におけるfh4からFH2崩壊の時間経過中に結合したリガンドのC6位置でのベンゾイル環の付随する回転とsp3からsp2への遷移の観察によっても支持されている（図。 3). 生成物の放出を制御する上でPhe31の役割は、さらにeDHFRのF31VとF31Y変異体は、定常状態の速度定数kcatの二倍の増加と水素化物移動を遅くする上で変異の効果に加えて、生成物の放出速度の推定20-50倍の増加を表示することを示した以前の変異誘発studies56によって確証されている。
π-π系の静電相互作用。 詳細については、参考文献54,55を参照してください
特定の大腸菌DHFRシステムの動的特性を考慮すると、安定した閉塞eDHFR：FH4複合体（その動的景観上の低自由エネルギー中間体）ここで観察された合理的に遅い生成物放出速度論（FH4解離のkoff速度、eDHFR触媒サイクルの律速段階）の基礎となる可能性がある。 これまでのNMR緩和分散研究によれば、大腸菌DHFRの触媒サイクルの各ステップは、「誘導された適合」メカニズムではなく「立体配座選択」に従う15。 その結果、反応座標に沿った各ステップの微視的速度は、酵素15の立体配座サンプリングレート（例えば、急速な水素化物移動または律速生成物放出のた これは、基底状態がより安定であり、励起状態と異なるほど、そのような立体配座をサンプリングするために必要な自由エネルギーコストが大きくなることを意味する。 EDHFRの場合、これは必然的にアクティブサイトと柔軟なMet20ループの再編成を伴います。 Edhfr15のNMR緩和分散研究では、水素化物移動化学ステップの亜集団励起状態が閉塞した立体配座（基底状態ミカエリス錯体が閉じた立体配座にある）を採用することが提案された。 しかし、生成物放出ステップのための亜集団励起状態は、（その基底状態FH4複合体が閉塞した立体配座にある）閉じた立体配座を採用しています。 反応座標に沿って、現在観察されているＥＤＨＦＲ：Ｆ Ｈ４二成分複合体は、ＥＤＨＦＲ：Ｆ Ｈ４：ＮＡＤＰ＋とＥＤＨＦＲ：Ｆ Ｈ４：ＮＡＤＰＨ中間体複合体の間に存在する（図３）。 1). どちらも、補因子のニコチンアミド部分が活性部位から離れている閉塞立体配座を採用している15。 律速生成物放出ステップ15中に”閉じた励起サブステート”をサンプリングするには、閉塞基底状態からの活性部位再編成が行われなければならない。 これは、この研究で捕獲された安定な触媒中間体eDHFR：FH4によって表される。 Ｆ Ｈ４の生成物解離速度ｋｏｆｆは、ＥＤＨＦＲ：Ｆ Ｈ４と比較して、ＥＤＨＦＲ：Ｆ Ｈ４：ＮＡＤＰ＋について２倍の増加、およびＥＤＨＦＲ：Ｆ Ｈ４：ＮＡＤＰＨについて、ＥＤＨＦＲ：Ｆ Ｈ４：ＮＡＤＰＨについて、ＥＤＨＦＲ：Ｆ Ｈ４：ＮＡＤＰＨについて、ＥＤＨＦＲ：Ｆ Ｈ４：ＮＡＤＰＨに対:FH4は、競争実験によってpH6およびpH9の両方で測定35。 これは、補因子が結合しているときに、生成物の放出が加速され、立体配座サンプリングレートが増加することを示しています。 本物のeDHFR:FH4:NADPH三元複合体基底状態構造はこれまでに報告されたことはありませんでしたが、fh4結合した基底中間状態のすべてが閉塞したコンフォメーション15を採用するため、eDHFR:FH4二元複合体とかなりの類似性があると仮定しました。 しかし、nmr緩和分散研究に基づいて以前に提案された補因子結合は、励起されたサブステートの集団が閉じた立体配座にあることを期待しています15。 これと一致して、我々はeDHFRの三元複合体でことが観察された：FH2：NADP（H）構造（また、別々の結晶化条件下で我々の研究で決定）、Met20ループが無秩序になった。 これは，補因子が活性部位から離れたニコチンアミド部分と結合しているときの配座サンプリング速度を高めることによって補因子促進配位子交換の一般的な機構を示唆している。
FH4複合体では、FH4ベンゾイル環（C1Β）とPhe31（Cz）との間の距離は4.93Åであり、これは現在のFH2および以前に報告されたFH2複合体（PDB ID：1RF7、4PDJ）20,24の対応する距離よりも有意に短い（–0.3-0.6Å）5.22、5.55、および5.32Åである。 二つの独立した計算研究において，ｅｄｈｆｒの反応座標に沿った距離短縮の同様の傾向を強調した。 QM/MMの研究では、水素化物移動反応が起こるにつれてミカエリス錯体から遷移状態までの距離が-0.3Å短くなり、遷移状態と反応生成物との間のこの距離（-0.01Å）にはほとんど差がないことが計算されている27。 混合量子/古典分子動力学を用いた別の研究では、反応が反応物から遷移状態に進化するにつれて、対応する距離が-1Åでより劇的に短縮されることが示唆された18。 したがって、我々の結晶学的観察は、ある程度、FH4複合体は、遷移状態の物理的性質を維持することを示唆している以前の計算モデリングと一般的に これはまた、触媒サイクルの各中間体が、その配座が先行または後続の中間体の基底状態構造に似ている低位励起状態をサンプルするNMR緩和分散に 酵素は遷移状態を安定化させるので，ＤＨＦＲファミリーの遅い生成物放出は反応生成物複合体への遷移状態の物理的性質の持ち越しに起因する可能性がある。 これは、触媒サイクル中に必要な種特異的な立体配座の変化に加えて、ここで決定された長い追求されたFH4複合体から示唆されている32。
ナノモル結合親和性遅発性阻害剤とeDHFRの閉塞複合体の特性評価
X線結晶学は、遅発性タイト阻害剤AMPQD46とeDHFRの複合体も閉塞立体配座を表示す Met20ループは、抗糖尿病ビグアニドフェンホルミンとNADP+（PDB ID）と三元複合体のそれに似ているAMPQD複合体の立体配座を採用しました: 5月52日にメジャー契約を結んでアクティブ-ロースター入り。 一方、ＦＤＡが承認した化学療法剤メトトレキサートは、ｘ線結晶学２ ４、４ ７、ＮＭＲ４ ８、および単分子運動学４ ９によって、閉鎖ＤＨＦＲ立体配座において結合することが以前に実証された（図４）。 7). フェンホルミンのビグアニド基、AMPQDのジアミノピリミジン基、メトトレキサートのジアミノプテリン基、それぞれが柔軟なリンカーでフェニル基に接続されている。 しかし、対応するeDHFR-阻害剤複合体の構造重ね合わせからの綿密な検討（図。 7）メトトレキサートのメチルアミノ結合基（フェンホルミンとAMPQDに存在しない）は、フェンホルミンとAMPQD複合体のように閉塞した立体配座を採用した場合、Met20ループ 本発明者らは、ＡＭＰＱＤがヒトＤＨＦＲ４ ６に対するＥＤＨＦＲの阻害に対して比較的高い優先度（ＩＣ−５ ０およびＫｉの３倍の減少）を示すことを以前に実証した。 Eのためのより高い種特異性。 アミノフェニルテイル基とメチレンリンカーを欠いているAMPQDの親化合物については、ヒトDHFR以上の大腸菌（-30倍）が観察される46。 Ａｍｐｑｄとｅｄｈｆｒの閉塞した複合体の現在の結晶構造は，ヒトＤＨＦＲ対ｅｄｈｆｒの立体配座平衡の違いに起因する種特異性のもっともらしい機械論的説明を提供する。 前者は閉じた立体配座でのみ観察され，後者は閉じた立体配座と閉塞した立体配座の両方でより高い立体配座柔軟性サンプリングを示した。
eDHFRの構造：AMPQD阻害複合体。 FO–FcとAMPQDとのアクティブサイトの相互作用のステレオビューは、3.5ºレベルでマップを省略します。 ＡＭＰＱＤの４Å以内のタンパク質側鎖（シアン）（緑色）は、ｍｅｔ２ ０ループからの２つの残基（黄色）を含む、棒状で示されている。 極の相互作用は破線で示されています。 Ｂ Ａｍｐｑｄ（緑色）、フェンホルミン（黄色、ＰＤＢ：５ＵＩＨ）５ ２、およびメトトレキサート複合体（ＰＤＢ：１Ｒ Ａ３、１ＤＤＳからの薄い棒として示される灰色）の重畳２ ０，４ ７。 Met20ループは棒として、配位子は棒として示されている。 配位子の化学構造は上に描かれています。 NADP(H)は、表示を簡単にするために、どの構造にも表示されません
クラスタリングに基づくDHFR立体配座の比較
Met20ループ骨格Ca原子のRMSDを距離メトリックとして用いたDHFR PDB構造のクラスタリング（図。 図8および補足図。 3）は、ヒトDHFRが排他的に（NADPH結合のための触媒的に有能な）閉じた立体配座を採用しているのに対し、eDHFRは、閉じたと閉塞した立体配座の両方ではるかに柔軟であることを示しています。 閉塞された立体配座は、eDHFR構造ではあまり頻繁に見られない（17％）。 Ｆ Ｈ４との律速生成物放出複合体およびＡＭＰＱＤとの遅発性阻害複合体の両方が、ＥＤＨＦＲの閉塞立体配座を採用する（図１ ０Ａ）。 図9)PDBではほとんど表現されていない(補足図。 3). 興味深いことに、FH4とAMPQDの両方が強く保存された複素環上のキー窒素原子の位置とedhfr35、36、46からナノモル親和性と遅いリリースの特性を共有し、尾部に明ら これは、閉塞したeDHFR立体配座を標的とすることにより、DHFR阻害剤を開発するための新しい戦略を示唆している。 また、薬剤耐性と戦うための戦略を提案します。 図に示すように。 図4に示すように、AMPQDの立体配座をFH4と比較し、トリメトプリムをFH4と比較すると、ファンデルワールス包絡線には微妙な違いがある。 大腸菌のDHFRのtrimethoprim eDHFRの脱出の変形はまたAMPQD57の抑制的な機能を妨げる突然変異を所有しています。 相互作用の違いを研究することによって、FH2およびFH4とのこれらの相互作用の違いを最小限に抑える他の配位子を探索することができる。 これは、阻害剤の結合を減少させる突然変異が、Ｆ Ｈ２およびＦ Ｈ４の結合親和性も減少させることを確実にするかもしれない。
162DHFR構造のクラスタリングは、Met20ループのペアワイズCa RMSDに基づいています。 ＤＨＦＲ構造は、青色（ヒト）、緑色（ＥＤＨＦＲ）、および赤色（本研究では）で満たされた円によって表される。 エッジの長さ（閉塞された立体配座の場合は紫色で、閉じた立体配座の場合は金色で着色）は、Met20ループ立体配座の最大RMSDに比例します。 補足情報のより詳細なクラスタリング図を参照してください
AMPQD（緑）およびFH4複合体（黄色）の重ね合わせ。 Met20ループは棒として、配位子は棒として示されている。 右側のビューは、左側の視点から垂直軸を中心に時計回りに90°回転します
最後に、eDHFR:FH2におけるeDHFR
の三元複合体の特性評価:NADP(H)三元複合体は、共精製された内因性リガンドおよび補因子の両方を有する(Fig. 図10)に示すように、Met20ループが無秩序になることがわかりました。 これは、迅速なリガンド交換のための配座サンプリングを強化するか、またはアロステリック機構を介して生成物放出を促進する際の補因子結合の役割をサポートしている（TS≥2、図。 1)12,13,14,15. ニコチンアミドリボース部分は活性部位から離れてスイングする（図。 10)閉塞されたFH4三元複合体12と同様である。 その酸化還元状態は電子密度に基づいて不明である。 様々な結晶化条件で異なる内因性リガンド結合、バイナリおよび三元eDHFR複合体を単離する能力は、eDHFRは、異なる結合リガンドと配座のアンサンブルを持つ分 ここで適用される結晶学的アプローチの有効性は、長期追求し、化学的に不安定なFH4複合体の結晶構造を単離するために透析ステップを省略するこ これは、微量の内因性リガンドを除去し、サンプルの均質性を増加させる透析によるDHFRサンプルの前処理を含む典型的なプロセスに反対しています。 均一性の向上は、一般的に、関心のある配位子が外因的に導入されるとき、共結晶化または結晶浸漬実験の全体的な成功率を改善する。
DHFR：FH2：NADP（H）三元複合体のステレオビュー。 無秩序なＭｅｔ２ ０ループ（Ｉｌｅ１ ４とＰｒｏ２ １との間の残基）は、黒い破線として示される。 3.0ºレベルでのFo–Fc省略マップは赤いメッシュで示されています。 二次構造は、棒状の表現で配位子と配位子として示される。 原子は、炭素（白）、窒素（青）、酸素（赤）、リン（オレンジ）のように着色されています)