Timeless TCID50:多くのウイルスに対する1つの解決策
今月は、古い古典であるTissue Culture Infectious Dose50assay、またはTCID50をカバーします。 TCID50アッセイは、感染細胞の50％が細胞変性効果（CPE）を示す濃度を決定することにより、ウイルス力価を定量するために使用される。 目的のウイルスが細胞死を引き起こす限り、このアッセイは、ウイルス特異的抗体が利用できない場合にも安価で実施が容易であるという利点を有 実際、ウイルス自体に関する情報はほとんど必要とされておらず、新規および新興の病原体を研究するための重要なツールとなっています。
TCID50アッセイ：それが何であり、どのようにそれを使用するには
TCID50アッセイでは、ウイルスの連続希釈は、細胞の単層上に追加され、CPEが見ることがで この時点で、細胞に対する連続希釈の効果は、不連続的または連続的な方法のいずれかでスコア化することができる。 不連続な方法では、５ ０％の細胞がＣＰＥを示す単一希釈を使用して、元のストック中に存在するウイルスの量をほぼ定量する。 これは非常に簡単であり、さらなる分析を必要としません。 しかし、同じ希釈内で正確に区別することができないため、ある程度の不正確さも伴います。
比色読み出しを使用することにより、より正確な情報を連続的に達成することができます。 取得された信号の量は、生細胞の数に比例している特定の吸光度を有する代謝基質。 次いで、異なる希釈物の吸光度値を、連続非線形回帰用量−応答曲線にプロットすることができ、そこから、より正確なＴＣ５ ０値を外挿することが可能であ 不連続な方法は、正確な力価が必要でない場合、または下流アッセイで特定の割合の感染を得るためにどのウイルス濃度が必要であるかを決定する しかし、このような場合であっても、精度を向上させるために1：2と1：5の間の希釈折り目を使用する方が良いかもしれません。 代わりに、より正確な定量が必要である場合、例えば、ウイルス力価に対する異なる処置または突然変異の効果を比較する場合、比色法が好ましい。
希釈から力価まで
TCID50値は、細胞の50％にCPEを有するために必要なウイルスの量を示します。 しかし、これからmlあたりのウイルスの実際の量にどのように行くのですか？ この式は非常に簡単で、TCID50の値に0.7を掛けることからなります。 これは、ウイルス感染に適用されるポアソン分布に由来し、完全に許容される細胞株では、50％の感染に達する確率は、約0.7の感染の多重度によって達成されると述べている。 これは必ずしも真実ではありませんが、ほとんどのアプリケーションでは良い近似値です。
ウイルスを数えることのトラブル
できる限り正確に、ウイルスを数えることは決して容易ではありません。 第一に、連続希釈は、それ自体の性質上、エラーの原因です。 第二に、これはウイルスの高力価に特に関連しています-ピペットチップの端に付着したままである最も小さい体積でさえ、定量に大きな違いを生 第三に、システムの生物学的変動が高い。 同じ量の細胞をプレートし、同じ量のウイルスを加え、同時に感染を止め、感染の割合は近いかもしれませんが、決してまったく同じではありません。
最後に、その治療を評価するとき（あなたが望むように！）は、ウイルス力価を減少させ、ウイルスの量は、アッセイ検出閾値を下回ることがあります。
ウイルスを数える芸術
良いニュースは、あなたの問題を知っていれば、あなたは解決策から遠くないということです！ 連続希釈の精度は自動化によって低下する可能性がありますが、これが利用できない場合でも、いくつかの小さなヒントが違いを生む可能性があ これらは、ピペットの先端を変更することが含まれ、誤ってちょうど外側のプラスチックに立ち往生してしまったウイルスのいくつかの余分なログ 複製も重要であり、小型化されたアッセイの場合はさらに重要です。 96の井戸の版は低効率方法が(プラークの試金のような)許可しないが、小さい容積が上で論議される問題にさらに敏感であるので付加的な可変性と来 技術的な複製はこれに対処するために何らかの方法で行われますが、VRSでは生物学的に3倍の比色TCID50を必要とする実験を実行しようとしています。 これにより、アプローチのロバスト性が向上し、有意性を失うことなくデータセット内のスプリアスポイントを除外できます。 正確なTC50値は、graphpad Prismのようなプログラムが簡単に生成できる比色データの非線形回帰線量応答を必要とします。 しかし、この種の曲線をプロットするソフトウェアの能力は、データの品質と反復の近い数値に厳密に依存します。 生成された曲線とTC50値の目視検査は、外挿がスプリアスデータポイントによって歪んでいる状況を修正するために強く推奨されます。 とりわけ、我々の経験は、標準的なウイルスストック滴定を超えて、TCID50読み出しを必要とする実験は、ウイルスの再現性のある量の上流の収集を保証する最良の生物学的条件を決定するために、両方の最適化の追加のステップを必要とする可能性があることを示唆している（例えば、 選択された細胞株、プレート形式、感染の多重度、時間点）、およびTCID50アッセイで試験するための最良の濃度範囲（例えば、開始濃度および希釈倍）。
細胞死か素敵な写真？
死んだ細胞を数えることは容易ではなく、非常に頻繁に彼らは最初の洗浄でプレートを放棄するので–彼らは最初の場所にまだそこにいると仮定して！ これは正確さを助けません。 より高価で手間がかかりますが、優れた抗体が入手可能な場合はいつでも、免疫蛍光染色は一般的に選択するアプローチです。 アッセイは細胞死の前に停止することができ、感度は一般に高く、より多くの制御およびより高い精度を可能にする。 さらに、この方法は、CPEを引き起こさない、またはそうするのに長い時間がかかるウイルスに使用することができます（そして、それに直面することがで). 細胞の損傷は、しかし、ほとんどの感染症の商標であり、我々は非常に少し知っているのいくつかの新興ウイルスの。 複数の比色/蛍光レポーターは敏感に異なったタイプの細胞毒性の間で測定し、区別して利用できるようになりました。 この古い古典は、新たな課題のためにアップしているように見えます！