antigif effecten van 1,2,3-triazolen tegen Bothrops jararaca en Lachesis Muta slangen

Abstract

slangengif zijn complexe mengsels van eiwitten van zowel enzymen als niet-enzymen, die verantwoordelijk zijn voor het produceren van verschillende biologische effecten. De menselijke envenomatie door slangenbeten in het bijzonder die van de viperidenfamilie veroorzaakt een complex pathofysiologisch beeld dat door spectaculaire veranderingen in hemostase wordt gekenmerkt en vaak bloeding wordt ook gezien. Het huidige werk rapporteert het vermogen van zes van een reeks 1,2,3-triazoolderivaten om een aantal farmacologische effecten veroorzaakt door de vergiften van Bothrops jararaca en Lachesis muta te remmen. In vitro tests toonden aan dat deze stoffen waren aangetast op een concentratie-afhankelijke manier, de fibrinogeen of plasma stolling, hemolyse, en proteolyse geproduceerd door beide venoms. Bovendien remde deze samenstellingen ook biologische gevolgen in vivo. Muizen behandeld met deze verbindingen waren volledig beschermd tegen hemorragische laesies veroorzaakt door dergelijke giftige stoffen. Maar alleen de B. jararaca-oedeem-inducerende activiteit werd geneutraliseerd door de triazolen. Dus het remmende effect van triazole derivaten tegen sommige in vitro en in vivo biologische assays van slangengif wijst op veelbelovende aspecten die hen kunnen aangeven als moleculaire modellen om de productie van effectieve antigif te verbeteren of om antigifneutralisatie aan te vullen, vooral de lokale pathologische effecten, die gedeeltelijk worden geneutraliseerd door antigifmiddelen.

1. Inleiding

Slangenvenomen zijn complexe mengsels van eiwitten, waaronder enzymen (metalloproteïnasen, serineproteïnasen, fosfolipasen A2 en L-aminozuuroxidase) en eiwitten zonder enzymatische activiteit, zoals desintegrinen, C-type lectinen, cysteïnerijke secretorische eiwitten (CRISP-toxinen), natriuretische peptiden en myotoxinen. De venomous pit adders Bothrops jararaca en Lachesis muta zijn verantwoordelijk voor ongevallen waarbij mensen in verschillende regio ‘ s van Zuid-Amerika. Terwijl B. jararaca wordt gevonden in het zuiden van Brazilië, Paraguay, en Noord-Argentinië, L. muta wordt verspreid in de equatoriale bossen ten oosten van de Andes, variërend van Oost-Ecuador, Colombia, Peru, Noord-Bolivia en Oost-en Noord-Venezuela tot Guyana, Frans-Guyana, Suriname en noord-Brazilië. Binnen hun bereik zijn ze vaak overvloedig en zijn belangrijke oorzaak van slangenbeten . Envenoming door deze slangen wordt voornamelijk gekenmerkt door systemische (gegeneraliseerde bloeden, coagulopathie, nierfalen en shock) en lokale effecten (bloeding, oedeem en necrose) . Zoals elders vermeld, vormen slangenbeten een volksgezondheidsprobleem in Latijns-Amerika en in andere tropische en subtropische landen, waarin ze volgens de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) worden beschouwd als een verwaarloosd gezondheidsprobleem . In Zuid-Amerika induceert B. jararaca een hogere incidentie van beten (95%) dan L. muta (circa 2%); nochtans leiden beten van L. Muta gewoonlijk tot ernstigere envenomende symptomen en is de incidentie van letaliteit driemaal hoger dan B. jararaca . Tegenwoordig is de parenterale toediening van dierlijk tegengif de enige specifieke behandeling voor envenoming door slangenbeten. In Brazilië wordt de intraveneuze toediening van ofwel Bothrops polyvalent antigif gebruikt om de envenoming gevallen veroorzaakt door Bothrops beten of het polyvalent bothropic-lachetic serum voor L. muta en Bothrops (B. atrox) slangenbeten in de Amazone regio ‘ s te behandelen. Zoals hierboven vermeld, matige tot ernstige envenomings toegebracht door Bothrops en Lachesis slangen worden gekenmerkt door een complexe reeks van lokale en systemische veranderingen zoals bloeding, myonecrose, coagulopathie, cardiovasculaire shock, nierfalen, en uiteindelijk de dood . Zoals door andere auteurs is gemeld, kunnen hoge doses antigifmiddelen die soms in Brazilië worden gebruikt voor de behandeling van patiënten met bewezen of vermoede both/Lachesis envenoming bijdragen tot vroege anafylactische en late reacties (serumziekte). De productie van tegengif van voldoende kwaliteit vormt dus een grote uitdaging. Bovendien zijn de prijzen van tegengif gestegen en hebben sommige landen hun productie stopgezet . Sommige tegengif neutraliseren efficiënt de systemische toxische effecten van het GIF; echter, de lokale effecten worden niet geblokkeerd en deze situatie kan leiden tot amputatie of invaliditeit .

vanwege deze problemen werd gezocht naar alternatieve behandelingen en sommige daarvan betroffen het zoeken naar nieuwe moleculen die de systemische en lokale effecten van giftige stoffen konden neutraliseren. Extracten van planten en andere natuurlijke bronnen (zoals die van mariene organismen) zijn getest op hun vermogen om een verscheidenheid aan biologische en toxische effecten van slangengif te neutraliseren. Diverse farmacologisch actieve molecules zijn geà dentificeerd , en vele gevolgen zijn reeds voor hen, met inbegrip van hun antivenom capaciteit vermeld . Tegenwoordig worden veel nieuwe bioprospecting benaderingen onderzocht. In verband hiermee moet echter worden opgemerkt dat de biologische effecten van moleculen die zijn afgeleid van organische synthese nog niet goed zijn onderzocht. De literatuur heeft 1,2,3-triazoolverbinding beschreven als een belangrijke klasse van vijf-leden stikstof heterocyclisch systeem dat verschillende farmacologische profielen vertoont, zoals plaatjesaggregatieremmende activiteit , anticlotting , antiviraal , trypanocide , antimicrobieel , en/of hun gebruik bij de behandeling van schizofrenie en leishmaniasis . Er zijn twee algemene methoden beschikbaar voor de constructie van 1,2,3-triazoolringen: Huisgen 1,3-dipolaire cycloadditiereacties , met name de koper(I)-gekatalyseerde cycloadditie , en de intramoleculaire 1,5-elektrocyclisatie van β-gesubstitueerde α-diazocarbonylverbindingen . Onze vorige studies hebben aangetoond dat zes nieuwe synthetische 1,2,3-triazolverbindingen (1-arylsulfonylamino-5-methyl-1h–triazol-4-carboxylzuur ethylesters) de hemolyse geïnduceerd door L. muta GIF remde . In feite vertoonden dergelijke derivaten een breed scala aan farmacologische activiteiten .

het doel van dit onderzoek was het vermogen van deze zes 1,2,3-triazoolderivaten op basis van –1-(p-chloorfenyl)-1H–triazool-4-carbohydrazide te evalueren tegen in vivo en in vitro activiteiten van both Jararaca en Lachesis Muta-venoms.

2. Materiaal

2.1. Gif en materiaal

Bothrops jararaca, Lachesis Muta gevriesdroogde venoms, en anti-Lachesis of anti-Bothropic antigif werden geleverd uit Fundação Ezequiel Dias, Belo Horizonte, MG, Brazilië, en bewaard bij -20°C tot de tests. Dimethylsufoxide (DMSO), boviene fibrinogeen en azocaseïne werden verkregen uit Sigma Chemical Co. Alle andere reagentia waren van de beste beschikbare kwaliteit.

2.2. Synthetische derivaten

de zes 1-arylsulfonylamino-5-methyl-1H–triazool-4-carboxylzuur ethylesters derivaten werden gesynthetiseerd volgens ons vorige rapport en hun chemische structuren zijn weergegeven in Figuur 1. Deze verbindingen werden opgelost in dimethylsufoxide (DMSO) en opgeslagen bij 4°C, totdat ze nodig waren.

figuur 1

chemische structuren van de zes 1,2,3-triazoolderivaten N’ — 1-(p-chloorfenyl)-1H–triazool-4-carbohydrazide. De zes derivaten werden ontworpen als getallen, zoals weergegeven tussen haakjes na elke afgeleide.

2.3. Dieren

BALB / c muizen (18-20 g) werden verkregen van het Núcleo de Animais de Laboratório (NAL) van de Federal Fluminense University. De dieren werden gehuisvest onder gecontroleerde omstandigheden van temperatuur (°C) en licht. Experimenten werden goedgekeurd door de Uff Institutional Committee for Ethics in Animal Experimentation (protocol nr. 297) die in overeenstemming waren met de richtlijnen van het Braziliaanse Comité voor dierproeven (COBEA) en internationale wetten en beleid.

3. Methoden

3.1. Remming van indirecte hemolyse

de mate van hemolyse veroorzaakt door de vergiften van L. muta en B. jararaca werd bepaald door de indirecte hemolytische test waarbij menselijke erytrocyten en eidooieremulsie als substraat werden gebruikt . De hoeveelheid L. muta en B. jararaca GIF (µg / mL) dat 100% hemolyse veroorzaakte werd aangeduid als minimale indirecte hemolytische dosis (mihd). Remmende experimenten werden uitgevoerd door triazoolderivaten met één MIHD gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te incuberen en vervolgens werd hemolytische activiteit geëvalueerd. Controle-experimenten werden gedaan door het incuberen van venoms met DMSO of zoutoplossing.

3.2. Antistollingsactiviteit

de stollingsactiviteit van L. muta en B. jararaca venoms werd bepaald met behulp van een digitale Amelung coagulometer, model KC4A (Labcon, Duitsland). Verschillende concentraties L. Muta (10 µg/mL) en B. jararaca (40 µg/mL) GIF werden gemengd met boviene fibrinogeenoplossing (2 mg/mL) of met humaan plasma, en de hoeveelheid gif die in 60 seconden fibrinogeen of plasma stolde, werd aangeduid als minimale stollingsdosis (MCD). Om hun remmende effect te evalueren, werden de triazoolderivaten gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met één MCD venoms, waarna het mengsel werd toegevoegd aan fibrinogeen of plasma en de stollingstijd werd geregistreerd. Controle-experimenten werden parallel uitgevoerd door het toevoegen van DMSO of zoutoplossing geïncubeerd met venoms, in plaats van de triazolen.

3.3. Antiproteolytische activiteit

proteolytische activiteit van L. muta en B. jararaca venoms werd bepaald met azocaseïne als substraat (0,2% g/v, in 20 mM Tris-HCl, 8 mM CaCl2, pH 8,8), met kleine modificatie . Een effectieve concentratie (EC) werd gedefinieerd als de hoeveelheid gif (µg/mL) die een variatie bij 420 nm van ongeveer 0,2 kan produceren. De triazoolderivaten werden met één EC van gif gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd en toen werd proteolyse gemeten. Controle-experimenten werden gedaan door het incuberen van venoms met DMSO of zoutoplossing.

3.4. Antihemorragische activiteit

hemorragische laesies geproduceerd door L. muta en B. jararaca venoms werden gekwantificeerd volgens een procedure beschreven door Kondo et al. met aanpassingen. Kort, monsters werden intradermaal geïnjecteerd (i. d.) in de buikhuid van muizen. Twee uur later, werden de dieren geëuthanaseerd door onthoofding, abdominale huid verwijderd, uitgerekt, en geïnspecteerd op visuele veranderingen in het interne aspect om hemorragische vlekken te lokaliseren. Bloeding werd gekwantificeerd als de minimale hemorragische dosis (MHD), gedefinieerd als de hoeveelheid gif (mg/kg) die een hemorragische halo van 10 mm kan produceren . Het remmende effect van triazoolderivaten werd onderzocht door samenstellingen met twee MHD van L. muta of B. jararaca GIF gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te incuberen, waarna het mengsel in muizen werd geïnjecteerd en de bloeding werd gemeten. Hemorragische activiteit werd uitgedrukt als de gemiddelde diameter (in millimeter) van de hemorragische halo geïnduceerd door vergiften in de afwezigheid en aanwezigheid van de triazoolderivaten. Negatieve controle-experimenten werden uitgevoerd door injectie van DMSO of zoutoplossing.

3.5. Antiedematogene activiteit

oedeem-inducerende activiteit van L. muta en B. jararaca venoms werd bepaald volgens Yamakawa et al. met aanpassingen. Groepen van vijf muizen werden subcutaan geïnjecteerd (s. c) in de rechter voet pad met 50 µL GIF, terwijl de linker voedsel pad kreeg 50 µL zoutoplossing. Een uur na de injectie werd oedeem geëvalueerd en uitgedrukt als het percentage van toename van het gewicht van het rechtervoetkussen in vergelijking met het linkervoetkussen. Het remmende effect van triazoolderivaten werd onderzocht door stoffen met L. muta of B. jararaca GIF gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te incuberen en vervolgens werd het mengsel in muizen geïnjecteerd (rechtervoetkussen) en werd oedeem gemeten.

3.6. Statistische analyse

de resultaten worden uitgedrukt als gemiddelden ± SEM verkregen met het aangegeven aantal uitgevoerde dieren of experimenten. De statistische significantie van verschillen tussen experimentele groepen werd geëvalueerd met behulp van de Student-test. Een waarde van ≤ 0,05 werd als significant beschouwd.

4. Resultaten en discussie

de ontwikkeling van effectieve, veilige, goedkopere en toegankelijkere tegengif verdient aandacht, aangezien slangenbeten ernstige handicaps kunnen veroorzaken en ook duizenden mensen kunnen doden. Een groeiend aantal studies is gericht op het zoeken naar remmers van slangengif uit verschillende bronnen, zowel natuurlijke als synthetische. Suramin en benzoyl phenyl benzoate zijn synthetische molecules bekwaam om myotoxicity, stolling, en phospholipase A2 en hyaluronidase activiteiten van slangengif van verschillende families te remmen. Lactonanalogen werden gesynthetiseerd en remde myotoxiciteit, en oedeem-inducerende en enzymatische activiteiten geïnduceerd door een fosfolipase A2 geïsoleerd uit B. jararacussu . Anderzijds hebben mariene bioactieve principes ook aandacht getrokken vanwege hun wijdverspreide farmacologische acties .

in dit onderzoek werd het vermogen van zes 1-arylsulfonylamino-5-methyl-1H–triazool-4-carboxylzuur ethylesters beoordeeld om bepaalde in vitro (hemolyse, stolling en proteolyse) en in vivo (bloeding en oedeem-inducerende) activiteiten veroorzaakt door B. jararaca en L. Muta vergiften, aangezien eerdere resultaten aantoonden dat deze zes derivaten hemolyse geïnduceerd door L. muta GIF remde, maar met verschillende potenties . Om deze reden werd gedacht dat het de moeite waard zou zijn om de acties van dergelijke derivaten op andere belangrijke biologische activiteiten met betrekking tot slangenbeten te onderzoeken, zoals proteolyse, stolling, hemolyse, bloeding en oedeem. Er werd aangetoond dat deze verbindingen de hemolyse remde veroorzaakt door B. jararaca (50 µg/mL) en L. muta (15 µg/mL) GIF (Figuur 2(a)). Het remmende percentage van de derivaten was meer dan 50% tegen beide vergiften. Er werd echter een klein verschil in het remmend profiel waargenomen voor derivaat 6, waarbij een remming van 50% en 90% op de hemolyse werd bereikt voor respectievelijk B. jararaca en L. muta venom. Noch derivaten noch DMSO leidden erytrocyten tot hemolyse, noch interfereerde DMSO in de mate van hemolyse veroorzaakt door giftige stoffen.

(een)

b)

(a)
b)

Figuur 2

Effect van derivaten op hemolyse en proteolyse. Derivaten 1-6 (45 µM) werden gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met B. jararaca (donkere kolommen) of met L. muta (gestreepte kolommen), waarna hemolytische (a) en proteolytische (b) activiteiten werden uitgevoerd. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM van individuele experimenten ().

Envenomatie door deze slangenbeten Veroorzaakt ernstige bloeding als gevolg van het hoge gehalte aan zink-afhankelijke metalloprotease of serineprotease die eiwitcomponenten van de extracellulaire matrix verteren of bloedstollingsfactoren verbruiken . B. jararaca en L. Muta venom hydrolyseerde azocaseïne op een concentratieafhankelijke manier met een EC van respectievelijk 20 µg/mL en 6 µg/mL (gegevens niet getoond). De derivaten remde de door B. jararaca of L. muta geïnduceerde proteolyse (Figuur 2 (b)). De derivaten 1, 2, 3 en 6 remde tot 80% van de proteolyse die door beide vergiften werd geïnduceerd, en het derivaat 5 remde een dergelijke activiteit onder de 50%. Een duidelijk verschil in remmend profiel van derivaten werd waargenomen voor derivaat 4, waarbij het 97% en 25% remde van de proteolyse geïnduceerd door respectievelijk B. jararaca of L. muta GIF (Figuur 2(b)).

zoals te zien is in Figuur 3, remde het derivaat 1, 2, 4, 5 en 6, maar niet het derivaat 3 op een concentratieafhankelijke manier (23-94 µM) de stolling van fibrinogeen geïnduceerd door de vergiften van B. jararaca (40 µg/mL) of L. muta (10 µg/mL). Het leek erop dat derivaten L. muta-inducerende stolling efficiënter remde dan B. jararaca. Bij de hoogste concentratie (94 µM) voorkwamen de derivaten 1, 2, 3, 5 en 6 de stolling van L. muta (Figuur 3(b)), terwijl de derivaten 2 en 6 De B. jararaca één keer voorkwamen (Figuur 3(b)). Bij concentraties tot 200 µM voorkwamen alle 1,2,3-triazoolderivaten effectief stolling van fibrinogeen veroorzaakt door beide venoms, maar bij concentraties onder 10 µM voorkwam geen van deze verbindingen stolling. Echter, wanneer derivaten (10 µM) werden samengevoegd en geïncubeerd met ofwel B. jararaca of L. muta gif, werd de stollingstijd tweevoudig uitgesteld. Er werd opgemerkt dat als derivaat 2 of 6 uit het mengsel werd verwijderd, er geen remmend effect op stolling werd waargenomen. Bovendien voorkwamen de derivaten ook stolling veroorzaakt door venoms wanneer plasma werd gebruikt. Noch DMSO (1% v/v, eindconcentratie) noch zoutoplossing interfereerden met stollingsprocessen.

(een)

b)

(a)
b)

Figuur 3

Effect van derivaten op fibrinogeen bloedstolling. Drieëntwintig µM derivaten (grijze kolommen), 46 µM (witte kolommen), of 94 µM (zwarte kolommen) werden geïncubeerd met 40 µg/mL B. jararaca (a) of met 10 µg/mL L. muta (b) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens werd het mengsel toegevoegd aan fibrinogeen (2 mg / mL) en werd de stollingstijd geregistreerd. De Venoms werden geïncubeerd met zoutoplossing (C1); 1% v/v DMSO (C2); derivaat 1 (kolom 1); derivaat 2 (kolom 2); derivaat 3 (kolom 3); derivaat 4 (kolom 4); derivaat 5 (kolom 5); en met derivaat 6 (kolom 6). # betekent dat fibrinogeen niet stolde tot 600 seconden observatie. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM van individuele experimenten ().

intradermale injectie van B. jararaca (12 mg/Kg) of L. muta (20 mg/Kg) GIF veroorzaakte een bloedingshalo van 20 mm bij muizen. Zo ‘ n halo vertegenwoordigt twee MHD van giftige stoffen. Wanneer elk gif werd gemengd met derivaten (90 µM) en vervolgens geïnjecteerd in muizen, een volledige bescherming tegen bloeding werd gezien (gegevens niet getoond). In tegenstelling, toonden eerdere resultaten aan dat anti-laquetisch serum de bloeding veroorzaakt door L. muta gif niet remde . Injectie van DMSO, derivaten of zoutoplossing veroorzaakte geen bloeding. Oedeem-inducerende is een ander belangrijk effect dat volgt op slangenbeet . Figuur 4 laat zien dat oedeem veroorzaakt door 5 mg/Kg B. jararaca (Figuur 4 (a)) of 8 mg/Kg L. Muta(Figuur 4 (b)) werd significant verminderd door de derivaten (90 µM). De triazoolderivaten 1, 2 en 4 inhibeerden meer dan 80% van het door B. jararaca geïnduceerde oedeem, terwijl de derivaten 3, 5 en 6 ongeveer 70% inhibeerden (Figuur 4(A)). Zoals Gezien, remde alle derivaten minder door L. muta geïnduceerde oedematogene activiteit(Figuur 4 (b)).

(een)

b)

(a)
b)

Figuur 4

Effect van derivaten op oedeem-inducerende activiteit. De derivaten (90 µM) werden geïncubeerd met 5 mg/Kg B. jararaca (a) of met 8 mg/Kg L. muta (b) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, waarna oedeem-inducerende activiteit werd uitgevoerd. Kolommen zijn afgeleide 1 plus venom (1); afgeleide 2 plus venom (2); afgeleide 3 plus venom (3); afgeleide 4 plus venom (4); afgeleide 5 plus venom (5) en afgeleide 6 plus venom (6). De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM van individuele experimenten ().

concluderend kunnen 1-arylsulfonylamino-5-methyl-1H — triazool-4-carboxylzuur ethylesterderivaten nuttig zijn als prototypes voor het ontwerpen van nieuwe moleculen ter verbetering van de huidige behandeling die wordt gebruikt voor slangenbeten van B. jararaca en L. muta. De remmende kracht van deze derivaten kan variëren of kan worden versterkt wanneer ze allemaal samen werden gezet, waarschijnlijk synergetisch werken. Daarom zou een lagere concentratie van hen nodig zijn om een volledige neutralisatie van de biologische effecten veroorzaakt door B. jararaca en L. Muta vergiften te bereiken. Bovendien heeft een eerdere analyse van de structuur-activiteitsrelatie van derivaten al plaatsgevonden . De derivaten werden onderworpen aan de analyse van “Lipinski’ s regel van vijf” die aangeeft dat een chemisch molecuul een oraal actief geneesmiddel bij de mens zou kunnen zijn en een dergelijke regel stelt dat een molecuul die twee van de volgende regels overtreedt waarschijnlijk slecht wordt geabsorbeerd: (1) molecuulgewicht minder dan 500 Da, (2) Aantal waterstofbindingsdonors (oh of NH groepen) gelijk aan of minder dan 5, (3) aantal waterstofbindingsacceptoren minder dan 10, en tenslotte (4) berekend minder dan 5 . De resultaten toonden aan dat alle derivaten aan deze regel voldeden (molecuulgewicht = 296,31–341,30; 2,6–3,4; nHBA = 8-11 en nHBD = 1-3) die wijst op een goede theoretische biodisponibiliteit .

Dankbetuigingen

dit werk werd ondersteund door de International Foundation for Science (IFS Grant F/4571-1) en door de volgende Braziliaanse financieringsinstellingen: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e tecnológico( CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro Carlos Chagas Filho (Faperj), Coordinação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (capes), en Universidade Federal Fluminense/pró-recitoria de Pesquisa e Pós-graduação e inovação (Uff/PROPPi).