Isolatie door kristallisatie van de endogene (6s)-5,6,7,8-tetrahydrofolaat-gebonden E. coli DHFR complexe
De structuur van de eDHFR:FH4 binaire complex werd bepaald door moleculaire vervanging van het gebruik van de eDHFR:Foliumzuur:NADP+ gesloten ternair complex (VOB-ID: 7DFR)50. Zoals in Fig. 2, bevestigt de duidelijke elektronendichtheid het co-gezuiverde endogene ligand als FH4 gebaseerd op de tetrahedrale meetkunde van sp3 C6 consistent met een 6s stereoisomeer. Dit staat in tegenstelling tot de trigonale vlakke geometrie van sp2 C6 in een FH2 binair complex verkregen uit vergelijkbare kristallisatieomstandigheden.
vergelijking van de ligandstructuren van eDHFR:FH4 (groen, bovenste figuur) en eDHFR: FH2 (oranje, onderste figuur) complexen. De FO-Fc weglaten elektronendichtheid kaarten contouren rond de liganden worden weergegeven op 3,0 σ niveau. De uitzichten rechts zijn 90° tegen de wijzers van de klok in om de verticale as gedraaid vanuit de aan de linkerkant getoonde perspectieven. FH4 en FH2 worden weergegeven als sticks. Het C6-koolstofatoom is gekleurd in magenta, en de verschillende hybridisatietoestanden in FH4 en FH2 worden aangegeven met magenta wijzende pijlen. Alle andere atomen zijn als volgt gekleurd: zuurstof in rood, stikstof in blauw, koolstof in groen, en oranje voor FH4 en FH2, respectievelijk. Alleen niet-waterstofatomen worden getoond voor de eenvoud van het bekijken
In een poging om te begrijpen waarom we het FH4-complex verkrijgen, terwijl anderen hebben gefaald, hebben we vastgesteld dat de oorsprong van de twee verschillende ligandcomplexen (FH4 vs.FH2) de timing van het kristal oogsten is, en dus de duur van de kristalgroei. Een studie van de tijd cursus weergegeven in Fig. 3 Dat volgt op de veranderingen van elektrondichtheden van het gebonden ligand op verschillende dagen van kristalgroei bleek dat het verval van FH4 naar FH2 (weerspiegeld in de SP3 naar sp2 overgang op C6 positie) ongeveer 2-3 dagen na kristallisatie ingesteld.
stereoweergave van het verloop van de tijd van Fo-Fc laat veranderingen in de elektronendichtheid weg die overeenkomen met de conversie van FH4 naar FH2. De FO-Fc weglaten elektronendichtheid kaarten contouren rond de liganden worden weergegeven op 3,0 σ niveau. De eDHFR:FH4 binaire complexe kristallen werden gekweekt in het donker bij kamertemperatuur. Op elk tijdstip werd een enkel kristal uit een onafhankelijke kristaldruppel geoogst door het invriezen van de flits voor röntgendiffractie. De ligandstructuren van FH4 en FH2 van volledig verfijnde binaire complexe structuren bij 2 en 14 dagen, respectievelijk, worden getoond in elk cijfer als verwijzingen om met de verandering van elektrondichtheden te vergelijken. De weglatkaarten voor de kristallen geoogst op 3 en 6 dagen werden gegenereerd na initiële structurele verfijning zonder de introductie van liganden of oplosmiddelen. Superpositie van de eiwitstructuren werd uitgevoerd gebruikend PyMOL69
Dit is de eerste keer dat we weten dat een authentiek FH4-gebonden Single-domain DHFR complex is geà soleerd. We hebben het protocol om de kristallisatie van het eDHFR:FH4 complex te reproduceren gevalideerd en het tijdsverloop van FH4 tot FH2 verval bevestigd door ten minste twee onafhankelijke replicaten op elk tijdstip van kristal oogsten (aanvullende Fig. 1). De tussenliggende elektrondichtheden langs het tijdsverloop van het verval van de ligand geven duidelijk de SP3-naar sp2-overgang op de C6-positie en de gelijktijdige rotatie van de benzoylring van de gebonden ligand weer (Fig. 3). Dit kan op de ligandbouw van de overgangsstaat in de voorwaartse katalytische richting lijken. Het waargenomen verval van FH4 tot FH2 tijdens de kristalgroei weerspiegelt waarschijnlijk geen omgekeerde katalyse door DHFR die de omzetting van FH4 in FH2 impliceert. Het wordt ook waarschijnlijk niet veroorzaakt door licht, gezien het feit dat de kristallisatiedruppels werden geïncubeerd bij kamertemperatuur in het donker tijdens de kristalgroei, en het verloop van FH4 tot FH2 verval is op de Orde van dagen. We hebben ook co-kristallisatie Getest met de reducerende stoffen dithiothreitol (DTT) of Tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP) bij 2-3 mM concentratie en DTT of TCEP gedurende maximaal 20 minuten kristal weken voorafgaand aan de oogst op 2 dagen, 3 dagen, 14 dagen tot 7,5 maanden. Nogmaals, deze procedures hadden geen invloed op de reproduceerbaarheid van veranderingen in de ligandelektronendichtheid in kwalitatief opzicht langs de vervaltijd van het eDHFR: FH4 complex in de kristallijne vorm die in deze studie is geïdentificeerd (aanvullende Fig. 1). Het is dus waarschijnlijk dat het huidige kristallisatieprotocol bij voorkeur het endogene FH4-complex co-gezuiverd in de edhfr-eiwitmonsters kristalliseert en het verval in het kristal onomkeerbaar is onder de omstandigheden die we hebben getest, waarschijnlijk als gevolg van oxidatie op een eindig niveau van zuurstof. Hoewel de snelle voorwaartse katalytische reactie van het produceren van FH4 van FH2 thermodynamisch wordt begunstigd in aanwezigheid van bovenmatige hoeveelheid NADPH zoals in vivo, kan het langzame verval van het FH4 complex terug naar een FH2 complex voorkomen zonder een voortdurende levering van NADPH zoals we hier onder de in vitro kristallisatievoorwaarde waarnamen. Het mysterie waarom het lang naderende FH4-complex moeilijk te verkrijgen was, blijkt dus zijn intrinsieke instabiliteit te zijn. Het is zeer waarschijnlijk de sleutel tot ons succes van het verkrijgen van de chemisch labiele FH4 complexe structuur is het tijdig oogsten van goed diffractiekristallen binnen de groei van 2 dagen onder de kristallisatievoorwaarde die hier wordt geà dentificeerd. Bovendien geeft een overzicht van het DHFR-veld aan dat veel kristallografie19,20,24,28,29,32,43,45,47,48,50,51,52 en NMR12,13,15,17,19,25,26 de studies van DHFR hebben dialyse toegepast om endogene ligands te verwijderen alvorens de exogene ligands van belang te introduceren. We identificeerden een kristallisatievoorwaarde die het endogene FH4-gebonden DHFR-complex isoleren zonder dialyse van het eiwitmonster of introductie van extra substraten of producten. We stellen dat de huidige kristallisatievoorwaarde voor eDHFR: FH4 complex de voorkeur geeft aan de FH4-gebonden vorm boven andere vormen zoals het eDHFR: FH2: NADP(H) ternair complex.
structurele karakterisering van het eDHFR: FH4-complex
het FH4-complex heeft een occluded-bouw in eDHFR (zie Fig. 4 en 5). Dit is consistent met de vorige bevindingen die suggereren dat alle grondtoestand FH4 binaire en ternaire complexen van de katalytische cyclus (post hydride-overdracht en SP2 naar sp3-omzetting bij C6) voorkomen in occluded conformaties. Dit is te wijten aan de sterische botsing van de gekantelde pterin ring van FH4 met de nicotinamide ring van NADP(H), die zou optreden in de gesloten bouw van de met20 lus (Fig. 5)12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,35,36,37,38. Zoals aangegeven in Fig. 4, FH4 heeft Van der Waals contacten en gunstige polaire interacties met actieve site residuen en wateren. In het bijzonder verankeren twee bidentaatzoutbruggen met Asp27 en Arg57 de twee uiteinden van FH4, respectievelijk aminopyrimidine (N3 en exocyclisch-NH2) en α-carboxylaat, in vrijwel identieke posities als in substraat/analoge complexen12, 20, 24 en 45.
de actieve site structuur van het eDHFR: FH4 complex weergegeven in stereo views. een zijkettingen (cyaan) binnen 4 Å van FH4 (groen) en de met20 lus (geel) worden weergegeven als stokken. Secundaire structuren worden weergegeven als cartoons in grijs, en wateren binnen 3,5 Å van FH4 als bollen. Polaire interacties met FH4 worden aangegeven met gestippelde lijnen. De kaart van de elektronendichtheid van FH4 wordt weergegeven op een niveau van 3,5 σ in rood en de kaart van de elektronendichtheid van 2Fo–Fc op een niveau van 1,0 σ wordt weergegeven in blauw voor residuen en water. De drie conformers van ile14-Gly15 amide verbindingen worden aangegeven door een gestippelde cirkel en rode pijlen. b een uitgebreid beeld van de ile14-Gly15 koppeling
superpositie van het FH4 complex met FH2 en FH4 analoge complexen. De huidige FH4 -, FH2-en gerapporteerde eDHFR-complexen en het gerapporteerde 5-formyl-FH4-complex samen met hun afgesloten met20-lusconformaties, phe31-residuen en de corresponderende liganden zijn respectievelijk Groen, magenta en geel gekleurd. Alle andere structuren uit PDB ID ‘ s:1dyj (ddFH4)45, 5CCC (ddFH4:NADP+)12, 1RF7 (FH2)24, 4PDJ (FH2:NADPH)20, en 4PSY (folaat: NADP+)20 zijn grijs gekleurd. De rode gestippelde cirkel wijst op voorgestelde π-π interacties tussen Phe31 en de ligand benzoyl groepen die twee verschillende oriëntaties aannemen afhankelijk van de gebonden liganden. FH4 en 5-formyl-FH4 behoren tot één cluster in tegenstelling tot ddFH4, FH2, en folaat, terwijl de phe31 zijkettingen in bijna dezelfde positie in alle uitgelijnde structuren blijven. De met20 lussen zijn onderverdeeld in drie algemene conformationele toestanden, gesloten, gedeeltelijk gesloten en afgesloten. Alleen de gesloten conformaties kunnen structureel de nicotinamidegroep van de NADP(H) – cofactor die de actieve plaats betreedt, Herbergen
er zijn twee watermoleculen die de met20-lus en FH4 overbruggen via een waterstofverbindingsnetwerk dat Gly15 (C = O)-wat1-FH4(N5) en Glu17(NH)-WAT2-FH4(N10) (Fig. 4). Deze interacties zijn afwezig in de eerder gemelde (6R)-5,10-dideazatetrahydrofolaat (ddFH4) complexen12,45 vanwege de n tot C vervanging op de 5 en 10 posities in het analoog. Dit kan het waargenomen verschil in de met20-bouw in het analoog in vergelijking met het FH4-complex veroorzaken (Fig. 5). De enige beschikbare structuren in de PDB die sterk lijken op de met20 loopconstructie in het FH4-complex zijn een 5-formyl-FH4-complex (Fig. 5, PDB ID: 1JOM) 51 en twee edhfr-nanobody allosteric inhibitory complexen die verschillende DHFR epitopes met nanomolar affiniteit (aanvullende Fig. 2, PDB ID ‘ s: 3K74 en 4EIG) 28,29. Het 5-formyl-FH4 complex behoudt het overbruggende water tussen Glu17 (NH) en FH4(N10) zoals in het FH4 complex, ondanks hun verschillende ruimtegroepen P61 en P212121 respectievelijk. 5-Formyl-FH4, ook als folinezuur of leucovorin wordt bekend, is een FDA-goedgekeurde “redding” drug voor het verhinderen van schadelijke gevolgen van methotrexaat tijdens chemotherapy53. De γ-carboxylgroep van FH4 vertoont weinig elektronendichtheid (Fig. 4), suggereert stoornis of meer vrijheid van binding rotatie rond de cß-Cy of Cy-Cδ C-as dan in andere delen van de liganden.
naast het waternetwerk vonden we de structurele oorsprong van de stabiliserende interacties in de FH4 complexe en langzame product release gebaseerd op structurele vergelijking van de huidige FH4 en FH2 binaire complexen en eerder gerapporteerde eDHFR structuren. Ten eerste resulteert het contact van Van der Waals met de Glu17 zijketting in extra afscherming van FH4 tegen oplosmiddel (Fig. 4) die afwezig is in substraat of product analoog (6R)-5,10-dideazatetrahydrofolaat complexen12,20,24,45. Ten tweede suggereert de duidelijke elektronendichtheid van drie alternatieve backbone-conformaties van de geconserveerde ile14-Gly15 amideverbinding een entropische bijdrage aan de stabiliteit van het FH4-complex Vanuit de lokale flexibiliteit bij het met20-lusanker (Fig. 4). Eerdere mutagenesestudies toonden met name aan dat Ile14 cruciaal is om de flexibiliteit van de met20-lus te beheersen, terwijl i14v, I14A en i14g-varianten allemaal een lagere hydride-overdrachtssnelheid vertoonden, een hogere flexibiliteit van de met20-lus zoals waargenomen in een open conformatie in kristalstructuren, een verhoogde temperatuurafhankelijkheid van het primaire kinetische isotopeneffect en een hogere transitie-activeringsenergie berekend uit hybride QM/MM-simulaties23, 40. Ten derde, leidt de omwenteling van de benzoylring tot elektrostatisch gunstige rand–aan-gezicht π-π interactie met behouden Phe31 in complex FH4 in tegenstelling tot Proton-dichtbij-proton (rand-aan-rand) afstotende interactie in complexen FH2, folaat, en ddfh4 ongeacht NADP(H) band (Fig. 5, uitgebreide weergave, Fig. 6)54,55. De functionele implicatie van deze structurele verandering wordt ook ondersteund door de observatie van de gelijktijdige rotatie van de benzoylring en SP3 naar sp2 overgang op de C6 positie van het gebonden ligand gedurende het verloop van FH4 naar FH2 verval in het complex (Fig. 3). De rol van Phe31 bij het beheersen van de productafgifte wordt verder bevestigd door eerdere mutagenesestudies56, die aantoonden dat F31V-en F31Y-varianten van eDHFR een tweevoudige toename van de steady – state snelheidsconstante kcat vertoonden en een geschatte 20 tot 50-voudige toename van de productafgifte naast het effect van mutaties op het vertragen van de hydride-overdracht.
elektrostatische interacties van π-π systemen. Zie refs 54,55 voor details
gezien de dynamische eigenschappen van het specifieke E. coli DHFR-systeem, kan het hier waargenomen stabiele occluded eDHFR:FH4-complex (een intermediair met lage vrije energie in het dynamische landschap) redelijkerwijs ten grondslag liggen aan de langzame kinetiek van de productafgifte (koff-dissociatiesnelheid van FH4, de snelheidsbeperkende stap van de eDHFR-katalytische cyclus). Volgens eerdere NMR-relaxatiedispersie-studies volgt elke stap van de katalytische cyclus van E. coli DHFR een “bouwselectie” in plaats van een “geïnduceerd fit” mechanisme15. Bijgevolg hangt de microscopische snelheid van elke stap langs de reactiecoördinaat af van de conformationele bemonsteringssnelheid van het enzym 15 (bv. de overgangstoestand die bevoegd is voor snelle hydride-overdracht of snelheidsbeperkende productafgifte). Dit impliceert dat hoe stabieler de grondstaat, en hoe meer verschillend het van de opgewekte onderstaat is, hoe groter de vrije energiekosten worden vereist om dergelijke conformaties te bemonsteren. Voor eDHFR, zal dit noodzakelijkerwijs de reorganisatie van de actieve site en de flexibele Met20 loop. Er werd voorgesteld in NMR relaxatie dispersie studies van eDHFR15 dat de subpopulatie opgewonden staat voor de hydride transfer chemische stap neemt een occluded bouw (waarvan de grond toestand Michaelis complex is in een gesloten bouw). Nochtans, keurt de subbevolkte opgewekte staat voor de stap van de productversie een gesloten bouw goed (waarvan het complex van de grondstaat FH4 in een gesloten bouw is). Langs de reactiecoördinaat bevindt het momenteel waargenomen edhfr:FH4 binair complex zich tussen de eDHFR: FH4:NADP+ en eDHFR:FH4: NADPH intermediaire complexen (Fig. 1). Beide keuren occluded conformations goed, waar het nicotinamide-deel van de cofactor van de actieve site15 weg wijst. Om de “closed excited substate” te testen tijdens de snelheidsbeperkende product release step15, moet een actieve site reorganisatie van de occluded ground state plaatsvinden. Dit wordt vertegenwoordigd door de stabiele katalytische intermediaire eDHFR:FH4 die in deze studie is vastgelegd. De dissociatiesnelheid van het product koff van FH4 werd verhoogd na cofactor binding met een tweevoudige toename voor eDHFR: FH4: NADP + vergeleken met eDHFR: FH4, en een achtvoudige toename voor eDHFR: FH4: NADPH vergeleken met eDHFR:FH4 gemeten bij zowel pH 6 als pH 9 door proefexperimenten35. Dit duidt op versnelde productvrijgave en verhoogde conformationele sampling rates wanneer een cofactor gebonden is. Hoewel een authentieke eDHFR: FH4:NADPH ternaire complexe grondstatusstructuur nooit eerder werd gerapporteerd, veronderstellen we dat er een merkbare gelijkenis kan zijn met het edhfr: FH4 binaire complex, aangezien alle FH4-gebonden grondtoestanden een occluded constituatie15 aannemen. We verwachten echter wel dat co-factorbinding de populatie van de aangeslagen substaten, die eerder op basis van NMR-relaxatiedispersiestudies werd voorgesteld, zal doen toenemen in een gesloten bouw15. In overeenstemming hiermee merkten we op dat in een ternair complex van de edhfr:FH2:NADP(H) structuur (ook bepaald in onze studie onder aparte kristallisatieomstandigheden), de met20 lus verstoord raakte. Dit suggereert een algemeen mechanisme van cofactor vergemakkelijkt ligand uitwisseling door het verbeteren van de conformational sampling rate wanneer de cofactor is gebonden met zijn nicotinamide deel wijzend weg van de actieve plaats.
in het FH4–complex is de afstand tussen de benzoylring (C1ʹ) van FH4 en de phe31 (Cz) 4,93 Å, wat significant korter is met (~0,3-0,6 Å) dan de overeenkomstige afstanden in de huidige FH2 en eerder gerapporteerde FH2-complexen (PDB ID: 1RF7, 4PDJ)20,24, die respectievelijk 5,22, 5,55 en 5,32 Å zijn. Een vergelijkbare trend van afstandverkorting langs de reactiecoördinaat van eDHFR werd benadrukt in twee onafhankelijke computationele studies. Een QM / MM-studie berekende dat de overeenkomstige afstand van het Michaelis-complex tot de transitietoestand met ~0,3 Å wordt verkort naarmate de hydride-transferreactie optreedt en dat er weinig verschil is in deze afstand (~0,01 Å) tussen de transitietoestand en het reactieproduct 27. Een andere studie met behulp van gemengde kwantum / klassieke moleculaire dynamica suggereerde een meer dramatische verkorting van de corresponderende afstand met ~1 Å naarmate de reactie evolueert van de reactant naar de transitiestate18. Daarom zijn onze kristallografische waarnemingen in het algemeen overeen met eerdere computationele modellering die suggereert dat het FH4-complex tot op zekere hoogte de fysische aard van de transitietoestand behoudt. Dit is ook in overeenstemming met eerdere observaties over het dynamische energielandschap van eDHFR in kaart gebracht door NMR relaxatiedispersie dat elk tussenproduct in de monsters van de katalytische cyclus laaggelegen opgewekte toestanden waarvan de conformatie lijkt op grondtoestandstructuren van de voorgaande of volgende tussenproducten 15. Aangezien de enzymen de overgangstoestand stabiliseren, kan de langzame productversie van de DHFR-familie aan de overdracht van de fysieke aard van de overgangstoestand aan het complexe reactieproduct worden toe te schrijven. Dit wordt gesuggereerd door het hier vastgestelde FH4-complex, naast soortspecifieke conformationele veranderingen die tijdens de katalytische cyclus nodig zijn32.Karakterisering van een occluded complex van eDHFR met een nanomolaire bindingsaffiniteit slow-onset inhibitor
röntgenkristallografie toont aan dat het complex van eDHFR met een slow-onset tight inhibitor AMPQD46 ook de occluded conformatie vertoont. De met20-lijn nam een bouw in het AMPQD-complex aan dat die van het ternaire complex met een anti-diabetic biguanide phenformin en NADP+ (PDB ID: 5UIH) 52. Anderzijds, werd de FDA-goedgekeurde chemotherapeutic agent methotrexate eerder aangetoond door X-ray kristallography24, 47, NMR48, en single-molecule kinetics49 om in de gesloten dhfr bouw te binden (Fig. 7). Deze discrepantie in eiwitconformaties was onverwacht omdat alle drie de remmers een gemeenschappelijke structurele eigenschap hebben: de biguanidegroep van fenformine, de diaminopyrimidinegroep van AMPQD en de diaminopterinegroep van methotrexaat, elk verbonden met een fenylgroep met een flexibele linker. Echter, een nauwkeurig onderzoek van de structurele superpositie van de overeenkomstige eDHFR-inhibitor complexen (Fig. 7) toonde aan dat de methylamino-koppelingsgroep van methotrexaat (afwezig in phenformine en AMPQD) een positie innam die zou resulteren in een potentiële sterische botsing met de met20-lus als het een occluded conformatie aannam zoals in de phenformine-en AMPQD-complexen. We toonden eerder aan dat AMPQD een relatief hogere voorkeur vertoonde (een drievoudige afname van IC-50 en Ki) voor het remmen van eDHFR boven menselijke DHFR46. Een nog hogere soortspecificiteit voor E. coli over menselijke DHFR (~30-voudig) wordt waargenomen voor de moederverbinding van AMPQD, die de aminofenylstaartgroep en de methyleenlinker46 mist. De huidige kristalstructuur van het occluded complex van eDHFR met AMPQD geeft een plausibele mechanistische verklaring voor zijn soortspecificiteit, toe te schrijven aan verschillen in conformationele evenwichten van menselijke DHFR vs.eDHFR. De eerste wordt uitsluitend waargenomen in gesloten conformaties, terwijl de laatste een hogere conformationele flexibiliteit sampling in zowel gesloten als afgesloten conformaties vertoont, zoals hierna besproken.
structuur van de eDHFR: AMPQD remmend complex. een Stereo weergave van de actieve site interacties met AMPQD met de FO-Fc weglaten kaart op een 3.5 σ niveau. Eiwitzijketens (cyaan) binnen 4 Å van AMPQD (groen) worden weergegeven als sticks, inclusief twee residuen van de Met20-lus (geel). Polaire interacties worden aangegeven met gestippelde lijnen. B superpositie van AMPQD (groen), phenformine (geel, PDB: 5UIH)52, en methotrexaat complexen (grijs weergegeven als dunne sticks uit PDB: 1RA3, 1DDS)20,47. Met20 lussen worden getoond als cartoons en liganden als stokken. De chemische structuren van de liganden zijn bovenop getekend. NADP (H) wordt niet weergegeven in een van de structuren voor de eenvoud van het bekijken
vergelijking van dhfr-conformaties gebaseerd op clustering
een clustering van DHFR PDB-structuren waarbij gebruik wordt gemaakt van de rmsd van de met20 lus backbone Ca-atomen als afstandsmetriek (Fig. 8 en aanvullende Fig. 3) geeft aan dat de menselijke DHFR uitsluitend een gesloten bouw aanneemt (katalytisch bevoegd voor NADPH-binding), terwijl eDHFR veel flexibeler is met zowel gesloten als gesloten conformaties. De occludeconformaties worden minder vaak gezien (17%) in eDHFR-structuren. Zowel het rate-limiting product release complex met FH4 als het slow-onset inhibitory complex met AMPQD nemen een occluded bouw van eDHFR (Fig. 9) dat zelden voorkomt in het VOB (aanvullende Fig. 3). Interessant, delen zowel FH4 als AMPQD de kenmerken van nanomolar affiniteit en langzame versie van eDHFR35,36,46 met de positie van de belangrijkste stikstofatomen op de heterocycles sterk behouden, en verschillen duidelijk in de staarten. Dit stelt een nieuwe strategie voor het ontwikkelen van DHFR-inhibitors voor door occluded edhfr-conformaties te richten. Wij stellen ook een strategie voor om de resistentie tegen drugs te bestrijden. Zoals aangegeven in aanvullende Fig. 4, bij het vergelijken van de bouw van AMPQD aan FH4 en trimethoprim aan FH4, zijn er subtiele verschillen in de Van der Waals enveloppen. De trimethoprim eDHFR ontsnappingsvarianten van E. coli DHFR bezitten mutaties die ook de remmende functie van AMPQD57 blokkeren. Door de verschillen in interactie te bestuderen, kan men naar andere liganden zoeken die deze interactieverschillen met FH2 en FH4 minimaliseren. Dit zou kunnen verzekeren dat de veranderingen, die inhibitorband verminderen, ook de bindende affiniteit van FH2 en FH4 zullen verminderen.
Clustering van 162 DHFR structuren gebaseerd op hun paarsgewijs Ca RMSD van de met20 lussen. DHFR structuren worden vertegenwoordigd door Cirkels gevuld in blauw (mensen), groen (eDHFR), en rood (in deze studie). De randlengte (gekleurd in paars voor de occluded en goud voor de gesloten conformaties, respectievelijk) is evenredig met de maximale RMSD van de met20 loop conformers. Zie een meer gedetailleerde clustering diagram in de aanvullende informatie
superpositie van AMPQD (groen) en FH4 complexen (geel). De Met20 loops worden getoond als cartoons en liganden als stokken. Het zicht rechts wordt 90° met de klok mee om de verticale as gedraaid vanuit het perspectief links
karakterisering van een ternair complex van eDHFR
ten slotte, in een eDHFR: FH2:NADP (H) ternair complex met zowel co-gezuiverde endogene ligand als cofactoren (Fig. 10), vonden we dat de met20-lus wanordelijk wordt. Dit ondersteunt de rol van cofactor binding in het verbeteren van conformational sampling voor snelle ligand uitwisseling of het vergemakkelijken van product release via een allosteric mechanisme (TS‡2, Fig. 1)12,13,14,15. Het nicotinamide ribose deel swingt weg van de actieve plaats (Fig. 10) vergelijkbaar met het afgesloten FH4 ternaire complex12. De redoxtoestand is onbekend op basis van de elektronendichtheid. De mogelijkheid om verschillende endogene ligandgebonden, binaire en ternaire edhfr-complexen te isoleren in variërende kristallisatieomstandigheden suggereert dat eDHFR een mengsel van moleculaire species met verschillende gebonden liganden en een ensemble van conformaties bevat. De doeltreffendheid van de hier toegepaste kristallografische benadering maakt gebruik van de moleculaire inhomogeniteit door de dialysestap weg te laten om een lang nagestreefd en chemisch labiele FH4 complexe kristalstructuur te isoleren. Dit is tegengesteld aan het typische proces dat voorbehandeling van dhfr-steekproeven door dialyse impliceert, die spoor endogene ligands verwijdert en steekproefhomogeniteit verhoogt. De verbeterde homogeniteit verbetert over het algemeen het algemene slagingspercentage van co-kristallisatie of kristal het weken experimenten, wanneer de ligands van belang exogenously worden geïntroduceerd.
Stereo uitzicht op de DHFR: FH2: NADP (H) ternary complex. De wanordelijke met20-lus (resten tussen Ile14 en Pro21) wordt aangegeven als zwarte streepjes. De FO-Fc weglaten kaart op een 3.0 σ niveau wordt weergegeven als rode mesh. Secundaire structuren worden weergegeven als cartoons en liganden in een stok vertegenwoordiging. Atomen zijn als volgt gekleurd: koolstof (Wit), stikstof( blauw), zuurstof (rood) en fosfor (oranje))