rola modyfikacji białka t-Bet w produkcji cytokin i różnicowaniu komórek pomocniczych T

Streszczenie

t-bet (białko T-box wyrażone w komórkach T, zwane także TBX21) zostało pierwotnie sklonowane jako kluczowy czynnik transkrypcyjny zaangażowany w zaangażowanie komórek pomocniczych t (th) w linię Th1. T-Bet bezpośrednio aktywuje transkrypcję genu IFN i wspomaga rozwój komórek Th1. T-Bet jednocześnie moduluje cytokiny IL – 2 i Th2 w sposób niezależny od IFN, co powoduje tłumienie rozwoju komórek Th2. Liczne badania wykazały, że T-bet odgrywa wiele ról w wielu podtypach komórek odpornościowych, w tym w komórkach B, komórkach dendrytycznych, komórkach NK (Natural killer), komórkach T NK i wrodzonych komórkach limfoidalnych. Dlatego T-bet ma kluczowe znaczenie dla rozwoju i koordynacji zarówno wrodzonych, jak i adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych. Aby spełnić te wielorakie role, T-bet przechodzi kilka posttranslacyjnych modyfikacji białek, takich jak fosforylacja w resztach tyrozyny, seryny i treoniny oraz ubikwitynacja w resztach lizyny, które wpływają na zaangażowanie linii podczas różnicowania komórek Th. Niniejszy przegląd przedstawia aktualny przegląd postępów w zrozumieniu roli różnych rodzajów modyfikacji białek T-bet w regulacji produkcji cytokin podczas różnicowania komórek Th.

1. Wprowadzenie

t-bet (białko T-box wyrażone w komórkach T, zwane także TBX21) zostało po raz pierwszy opisane w 2000 roku w raporcie badającym wpływ T-bet na różnicowanie komórek T helper 1 (Th1). W ciągu ostatnich 15 lat wiele badań zbadało funkcje T-bet i ujawniło wiele ról tego białka podczas różnicowania komórek Th, z naciskiem na mechanizmy molekularne, nowe funkcje tego czynnika transkrypcyjnego w wrodzonych komórkach odpornościowych i modulację chorób zapalnych za pośrednictwem t-bet . Wyjaśniono, że T-bet odgrywa kluczową rolę w koordynacji odporności wrodzonej i adaptacyjnej oraz że pełni ważną funkcję w modulowaniu przewlekłych chorób zapalnych, w tym astmy i zapalnych chorób jelit, poprzez kontrolowanie sieci wysoce konserwowanych programów genetycznych . Tak więc optymalna regulacja ekspresji i aktywności T-bet wydaje się być korzystna w zapobieganiu lub leczeniu przewlekłych stanów zapalnych i chorób autoimmunologicznych.

chociaż podjęto próby identyfikacji małych cząsteczek, które kontrolują ekspresję i aktywność T-bet, które wpływają na odpowiedź immunologiczną za pośrednictwem komórek T, do tej pory poczyniono niewielkie postępy. Biorąc pod uwagę znaczenie T-bet w regulacji immunologicznej, Wyjaśnienie mechanizmów funkcjonalnych leżących u podstaw wielu ról T-bet ułatwiłoby rozwój nowych interwencji terapeutycznych w leczeniu przewlekłych chorób zapalnych i autoimmunologicznych. Niniejszy przegląd podsumowuje aktualny stan wiedzy na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wielu ról odgrywanych przez T-bet w rozwoju komórek Th.

2. Struktura T-Bet

T-bet zawiera końcówkę aminową, domenę T-box i końcówkę karboksylową, które wykazują odpowiednio 82%, 100% i 79% homologię pomiędzy myszami (białko reszty aminokwasowej 530) i ludźmi(białko reszty aminokwasowej 535) (Fig. 1). Domena T-box, znajdująca się pomiędzy resztami 135 i 326 w mysim t-bet, jest silnie zachowana u 18 członków rodziny białek T-box (TBX). Wspólne cechy wspólne dla białek T-box obejmują zdolność do wiązania DNA przez domenę T-box i transkrypcyjną aktywność regulatorową, która odgrywa rolę w kontrolowaniu ekspresji genu rozwojowego we wszystkich gatunkach zwierząt.

Rysunek 1

struktura i modyfikacja białka t-bet. Mysz i człowiek t-bet jest w 100% identyczne w domenie T-box. Kilka reszt aminokwasowych jest konserwowanych u myszy i poddawanych modyfikacjom posttranslacyjnym, w tym fosforylacji w pozostałościach seryny, treoniny i/lub tyrozyny oraz ubikwitynacji w resztach lizyny.

domena T-box składa się z około 180 reszt aminokwasowych i jest zarówno wystarczająca, jak i niezbędna do wiązania się z konsensusową sekwencją DNA TCACACCT . Brachyury (T) było pierwszym zidentyfikowanym białkiem T-box i, w postaci dimerycznej, wchodzi w interakcje z głównymi i mniejszymi rowkami DNA poprzez hydrofobowe interakcje i nietypowy kontakt karbonylu z guaniną jako dimerem . TBX1 wiąże się również z sekwencją DNA jako dimer, podczas gdy tbx2 wydaje się wiązać z tą samą sekwencją DNA co monomer . Chociaż TBX1 i TBX2 mają 61% identyczności w domenie T-box, struktura kompleksu wiążącego DNA-T-box wydaje się być inna, ze względu na niską homologię między regionami aminowymi i karboksylowymi. Domena T-box w T-bet wykazuje 50% homologii z odpowiadającą domeną w brachyury (T), TBX1 i TBX2; jednak struktura krystaliczna t-bet związana z sekwencją DNA pozostaje do scharakteryzowania.

3. Regulacja różnicowania komórek Th przez T-Bet

3.1. Stymulacja różnicowania komórek Th1 przez T-Bet

t-bet bezpośrednio wiąże się z sekwencją DNA konsensusu w promotorze IFNG i aktywuje jego transkrypcję. Indukowana przez T-bet ekspresja IFNG wyprowadza komórki prekursorowe th w celu różnicowania się w komórki efektorowe Th1. Podczas gdy egzogenna nadekspresja t-bet u wcześniej nieleczonych komórek TH preferencyjnie zwiększa rozwój komórek Th1, niedobór t-bet prowadzi do braku wytworzenia wystarczającej ilości IFN-γ i tym samym zmniejsza wytwarzanie komórek Th1 . Ekspresja T-Bet jest znacznie zwiększona przez stymulację receptora limfocytów T (TCR) i jest zwiększana przez sprzężenie z IFN-γ i IL-12. IFN-γ wiąże się z receptorem i indukuje aktywację przetwornika sygnału i aktywatora transkrypcji (STAT) 1 oraz transkrypcję genu T-bet (TBX21). Następnie t-bet bezpośrednio stymuluje transkrypcję IFNG oraz IL12RB2. Ekspresja receptora IL-12 (IL-12R) β2 na powierzchni komórki dodatkowo zwiększa produkcję IFN-γ poprzez IL-12 i szlak sygnałowy STAT4, co prowadzi do preferencyjnego różnicowania komórek Th1. Co ciekawe, wymuszona ekspresja t-bet może również przekształcić zróżnicowane komórki Th2 w komórki Th1 . W związku z tym t-bet jest umieszczony w sednie szlaków regulatorowych, które indukują IFN-γ w komórkach Th.

3.2. Tłumienie wytwarzania IL-2 przez T-Bet

oprócz regulacji IFN-γ, T-bet znacząco hamuje ekspresję. Cytokina ta, czynnik wzrostu wczesnych komórek T, jest niezbędna do aktywacji, proliferacji i różnicowania komórek Th i jest obficie wytwarzana po stymulacji TCR. Wprowadzony ektopowo T-bet znacząco hamuje wytwarzanie IL-2 poprzez hamowanie aktywności czynnika jądrowego kB (NF-kB) p65, w Warunkach różnicowania zarówno Th1, jak i Th2 . Podczas różnicowania komórek Th1 transkrypcja IL-2 jest również atenuowana po indukcji T-bet. Hamowanie IL-2 za pośrednictwem t-bet może wpływać na ekspansję komórek Th i znakomicie modulować odpowiedź immunologiczną za pośrednictwem Th1 po ekspozycji na patogenny antygen.

3.3. Hamowanie rozwoju komórek Th2 przez T-Bet

ponadto egzogenne wprowadzenie t-bet do komórek TH hamuje wytwarzanie cytokin Th2, takich jak IL-4, IL-5 i IL-13, poprzez supresję białka wiążącego Gata-3 (GATA-3). W związku z tym brak t-bet indukuje spontaniczny rozwój komórek Th2 in vitro i In vivo . Aktywność hamująca Th2 t-bet została również potwierdzona przy braku IFN-γ, co wskazuje, że T-bet ma dyskretną funkcję hamującą, niezależną od stymulacji IFN-γ.

3.4. Inne funkcje T-Bet

ostatnio wiele badań wykazało, że T-bet moduluje również inne linie komórkowe th, w tym komórki Th17, Treg i pęcherzykowe TH (TFH), w koordynacji z wieloma czynnikami transkrypcyjnymi, takimi jak związany z kwasem retinowym sierocy receptor-yt (RORyt), związany z runt czynnik transkrypcyjny 3 (RUNX3) i chłoniak z komórek B-6 (BCL6) . Wyniki te sugerują, że t-bet jest czynnikiem transkrypcyjnym, który ma kluczowe znaczenie dla dostrajania rozwoju komórek Th.

4. Posttranslacyjna modyfikacja t-Bet

t-bet działa jako wielozadaniowy gracz w regulacji różnicowania komórek Th. Jednak mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw pobudzającej i hamującej aktywności T-bet w regulacji ekspresji genów docelowych, pozostają do wyjaśnienia. Wiadomo, że wiele wielozadaniowych białek podlega modyfikacjom białka posttranslacyjnego i determinuje losy komórek poprzez wywieranie bezpośredniej aktywności stymulującej i pośredniej hamującej na ekspresję docelowego genu .

4.1. Fosforylacja tyrozynowa białek t-Bet

wykrywanie białek t-bet na bazie przeciwciał w blotach zachodnich powoduje powstanie wielu pasm, co sugeruje posttranslacyjną modyfikację T-bet w komórkach TH wyzwalanych przez TCR. Fosforylacja tyrozynowa białka t-bet występuje głównie we wczesnych stadiach (dni 2-3) rozwoju komórek Th, po zaangażowaniu TCR, a następnie spada. Leczenie komórek Th nadwanadanem inhibitora fosfatazy tyrozynowej nasila fosforylację tyrozynową T-bet. T-Bet jest głównie zlokalizowany w jądrze, a jądrowa kinaza TYROZYNOWA indukowana IL2 kinaza tyrozynowa (ITK) została zidentyfikowana jako odpowiedzialna przed kinazą tyrozynową. Niedobór ITK zapobiega fosforylacji tyrozynowej t-bet w komórkach Th po stymulacji TCR i IL-12. Badania mutacyjne wykazały, że pozostałość tyrozynowa 525 (Y525) jest odpowiednim miejscem fosforylacji i że fosforylacja w tym miejscu odgrywa ważną rolę w interakcji z GATA-3. Chociaż domena T-box w T-bet jest ważna dla interakcji DNA i białko-białko, fosforylacja tyrozyny Y525 jest warunkiem wstępnym do tłumienia różnicowania komórek Th2 za pośrednictwem Gata-3. Blokada fosforylacji y525 znosi interakcję i tłumienie GATA-3, powodując upośledzenie supresji Th2 .

ponadto, Inna jądrowa kinaza tyrozynowa, C-Abl, indukuje fosforylację t-bet przy reszt tyrozynowych 219, 265 i 304 w mysim t-bet . Niedobór c-Abl, jak również mutacja t-bet w tych reszt (mutanty y219/265/304F) prowadzi do braku zwiększenia indukcji IFN-γ i zahamowania produkcji cytokin Th2, z powodu utraty fosforylacji tych reszt tyrozynowych. To z kolei powoduje nasilenie alergicznego zapalenia płuc in vivo . Wyniki te sugerują, że fosforylacja tyrozynowa t – bet wywołana przez ITK i C-Abl jest niezbędna do modulacji rozwoju komórek Th2 i alergicznej odpowiedzi immunologicznej.

4.2. Fosforylacja serynowa t-Bet

chociaż zahamowanie rozwoju komórek Th2 za pośrednictwem t-bet jest zaburzone przez mutację y525 i brak kinazy C-Abl, supresja IL-2 jest zachowana z mutantem y525 t-bet, co sugeruje istnienie dodatkowego mechanizmu regulacyjnego dla modulacji IL-2 . Co ciekawe, pojawienie się wielu pasm białka t-bet na zachodnich plamach może zostać wyeliminowane przez dodanie fosfatazy jelitowej cielęcej, która eliminuje głównie fosforylację przy resztach seryny / treoniny. Następnie analiza spektrometryczna wykazała, że seryna 508 (S508) jest kolejnym miejscem fosforylacji w T-bet. Mutacja S508 znosi fosforylację za pośrednictwem kinazy kazeinowej (CK -) i kinazy syntazy glikogenu-3 (GSK-3 -) w t-bet, a także hamującą aktywność białka IL-2. Ponadto fosforylacja S508 jest ważna dla interakcji T-bet z NF-kB p65 i zapobiegania wiązaniu NF-kB p65 z promotorem IL2. Zgodnie z funkcją t-bet jako inhibitora NF-kB P65, komórki T-bet-null th1 podtrzymują aktywność NF-kB p65 podczas różnicowania komórek Th1 i w ten sposób wytwarzają więcej IL-2. Dlatego sugerowano, że T-bet jest fizjologicznym inhibitorem IL-2 podczas różnicowania komórek Th1, poprzez zależną od fosforylacji S508 supresję NF-kB p65.

4.3. Fosforylacja treoniny t-Bet

bardzo niedawno, treonina 302 (T302) została scharakteryzowana jako nowe miejsce fosforylacji w T-bet , chociaż pozostaje niejasne, która kinaza i fosfataza wpływają na fosforylację tej reszty. Jednakże odbudowa komórek T-bet-null th z mutantem t-bet T302 stymulowała produkcję IFN-γ tak samo jak t-bet typu dzikiego; jednak mutant nie hamował IL-2 i innych cytokin Th2. Dalsza analiza wykazała, że fosforylacja T302 jest konieczna do interakcji T-bet z czynnikiem jądrowym aktywowanych komórek T (nfat) i do zmniejszenia regulacji cytokin IL-2 i Th2, takich jak IL-4, IL-5 i IL-13. NFAT nie jest kluczowy dla indukcji produkcji IFN-γ, a T302-zmutowany t-bet jest w stanie wiązać się z promotorem IFNG; tak więc produkcja IFN-γ była porównywalna między dzikim i zmutowanym t-bet. Innymi słowy, mutacja T302 powodowała zahamowanie produkcji cytokin IL-2 i Th2 przez T-bet, ale nie wpływała na Wiązanie DNA i stymulującą aktywność IFN-γ t-bet.

w rzeczywistości T302 znajduje się w polu t wiążącym DNA, podobnie jak Y304 . Domena T-box składa się z kilku powtórzeń β-nici i α-Helis i bierze udział zarówno w dimeryzacji, jak i wiązaniu DNA . Muller i Herrmann przewidzieli, że α-helisy aH3 i aH4 w brachyurze (T) są ważne dla bezpośredniej interakcji tego białka z mniejszymi i większymi rowkami DNA . Jednakże T302 nie może być bezpośrednio związany z rowkami DNA, niezależnie od jego statusu fosforylacji. Interesujące byłoby wiedzieć, która kinaza i fosfataza wyjściowa regulują fosforylację T302 i czy fosforylacja T302 wpływa na inne modyfikacje białka T-bet.

4.4. Ubikwitynacja lizyny 313 w ekspresji t-Bet

ma kluczowe znaczenie dla transkrypcyjnej regulacji IFNG i dla rozwoju komórek Th1, ale sposoby regulacji t-bet na poziomie białka nie zostały jeszcze zidentyfikowane. Jang et al. ostatnio doniesiono, że T-bet ulega degradacji proteasomalnej za pośrednictwem ubikwitynacji w późniejszych stadiach różnicowania się komórek Th1 . Spośród 16 reszt lizyny obecnych w mysim białku t-bet, 11 znajduje się głównie w domenie T-box, a pozostałe 5 znajduje się na końcu karboksylowym (reszty 326 do 530), podczas gdy w końcu aminowym (reszty 1 do 134) nie ma reszt lizyny. Co ciekawe, pozostałości lizyny w domenie T-box są preferencyjnie ubikwitynowane po nadekspresji ubikwityny. Dalsza analiza wykazała, że mutacja lizyny 313 (K313) zmniejsza degradację t-bet za pośrednictwem ubikwitynacji i zwiększa poziom ekspresji t-bet w jądrze i cytoplazmie. Pomimo zwiększonego poziomu mutanta k313, mutacja ta całkowicie anulowała funkcje T-bet obejmujące Wiązanie DNA, transkrypcyjną aktywację IFNG i supresję produkcji cytokin IL – 2 i Th2. Struktura krystaliczna α-Helis domeny T-box związanej z DNA silnie sugeruje, że grupa aminowa K313 jest związana z fosforanem Zasady DNA poprzez interakcję wiązania wodorowego. Ponadto mutacja K313 prowadzi również do braku zahamowania produkcji cytokin IL – 2 i Th2; jednakże interakcja i supresja GATA-3 i NF-kB p65 nie są zmieniane przez mutację K313. Co ciekawe, interakcja nfat jest zniesiona w zmutowanym t-becie k313, co jest również silnie związane z brakiem fosforylacji w T302. Nie jest jeszcze jasne, czy i w jaki sposób K313 reguluje fosforylację T302 i odwrotnie.

5. T-Bet w chorobach zapalnych i autoimmunologicznych

od Mosmann et al. odkryte podgrupy Th1 i Th2, które wytwarzają cytokiny sygnaturowe, IFN-γ i IL-4, IL-5 i IL-13, odpowiednio, i które modulują zapalną i alergiczną odpowiedź immunologiczną, dalsze badania zidentyfikowały nowe podgrupy komórek TH, takie jak komórki Th17, TFH i Treg . Szeroko zakrojone badania scharakteryzowano również szlaki sygnałowe cytokin i czynniki transkrypcyjne zaangażowane w regulację odpowiedzi immunologicznej na patogeny . Co ważne, T-bet odgrywa zasadniczą rolę w kontrolowaniu różnicowania kilku podzbiorów komórek Th oraz w modulowaniu chorób zapalnych i autoimmunologicznych .

T-Bet działa również jako regulator antyastmatyczny. Niedobór T-bet spontanicznie prowadzi do rozwoju objawów astmatycznych, które charakteryzuje się zwiększonym naciekiem eozynofilów do dróg oddechowych, rozrostem komórek kielicha wydzielających śluz i przewlekłą przebudową dróg oddechowych z akumulacją kolagenu i proliferacyjnymi miofibroblastami; cechy te są często obserwowane u pacjentów z astmą . Przywrócenie ekspresji T-bet przesuwa równowagę immunologiczną do odpowiedzi Th1 oraz zapobiega i łagodzi patologiczne zapalenie płuc in vivo .

ponadto T-bet jest chroniony przed wewnątrzkomórkowymi zakażeniami patogennymi. Abrogacja indukowanej przez T-bet produkcji IFN-γ spowodowała większą podatność na wewnątrzkomórkowe patogeny in vivo, w tym Mycobacterium tuberculosis, Leishmania major i Salmonella typhimurium, podkreślając znaczenie produkcji IFN-γ przez komórki T-bet-wyrażające Th1 w obronie przed infekcjami bakteryjnymi. Jednak myszy z niedoborem t-bet są odporne na zakażenie Listeria monocytogenes, ponieważ produkcja INF-γ przez komórki naturalnego zabójcy jest zarówno konieczna, jak i wystarczająca do obrony gospodarza przed L. monocytogenes .

ponadto T-bet może nasilać rozwój chorób zapalnych i autoimmunologicznych, w tym zapalnych chorób jelit, doświadczalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia, zapalnego zapalenia stawów i cukrzycy typu I, ponieważ te choroby zapalne są osłabione w przypadku braku T-bet . Wyniki te sugerują, że dostrojenie odpowiedzi immunologicznej poprzez modulację ekspresji T-bet może mieć korzystny wpływ na pacjentów z przewlekłą astmą, zapalną chorobą jelit, zapaleniem stawów, stwardnieniem rozsianym i cukrzycą.

6. Wnioski i perspektywy

t-bet jest czynnikiem transkrypcyjnym zawierającym domenę T-box, który zazwyczaj bierze udział w regulacji rozwoju, ale pełni wiele funkcji w różnicowaniu komórek TH; transkrypcyjną aktywację komórek th1 wyrażających IFN-γ, pośrednią supresję komórek th2, Th17 i Treg oraz drobną modulację produkcji IL-2 w komórkach Th1. Ta wielozadaniowość nie jest zaskakująca, ponieważ T-bet ulega kilku modyfikacjom posttranslacyjnym. Fosforylacja w y525 odgrywa rolę w supresji GATA-3 podczas regulacji th2, fosforylacja w S508 powoduje supresję NF-kB p65 w kontekście regulacji IL-2 w komórkach Th1, fosforylacja w T302 odgrywa rolę w dostrajaniu produkcji IL-2, a ubikwitynacja w k313 odgrywa rolę w kontrolowaniu stabilności białka t-bet. Tak więc, posttranslacyjna modyfikacja T-bet ułatwia jego różnorodność funkcjonalną i złożoność jego modulacji ekspresji cytokin(ryc. 2). Nie wiadomo, czy różne modyfikacje posttranslacyjne występują sekwencyjnie lub jednocześnie, czy jeden rodzaj modyfikacji białkowej wpływa na inne modyfikacje, czy też zmiany w modyfikacji posttranslacyjnej t-bet są związane z rozwojem zakaźnych i przewlekłych chorób zapalnych. Dalsza identyfikacja nowych modyfikacji białek związanych z funkcjami T-bet zapewni cenny wgląd w rozwój potężnych interwencji terapeutycznych do kontrolowania przewlekłych chorób zapalnych i autoimmunologicznych.

Rysunek 2

wiele funkcji t-bet odgrywa rolę w różnicowaniu komórek Th. Indukcja ekspresji T-bet poprzez aktywację STAT1 i STAT4 bezpośrednio stymuluje transkrypcję genów zawierających element wiążący T-box, takich jak IFNG, IL12RB2 i CXCR3, zwiększając w ten sposób rozwój komórek Th1. T-Bet ulega fosforylacji serynowej przy S508, a następnie obniża produkcję IL-2 w komórkach Th1 poprzez rekrutację NF-kB p65 z promotora IL2. Poziom białka T-bet w komórkach Th1 może być kontrolowany drogą degradacji proteasomalnej za pośrednictwem ubikwityny. Co więcej, białko t-bet podlega dodatkowym modyfikacjom posttranslacyjnym, na przykład fosforylacji w T302 i Y525, co ułatwia jego supresję produkcji cytokin Th2, która jest indukowana przez aktywację nfat i GATA-3.

Wykaz skrótów

konflikt interesów

nie ujawniono potencjalnego konfliktu interesów.

potwierdzenie

ta praca była wspierana przez program mid-Career Researcher poprzez Grant NRF (2013r1a2a2a01068302).