rollen av proteinmodifieringar av T-Bet I cytokinproduktion och differentiering av T-hjälparceller

Abstrakt

T-Bet (t-boxprotein uttryckt i T-celler, även kallad TBX21) klonades ursprungligen som en nyckeltranskriptionsfaktor involverad i engagemanget av T-hjälparceller (TH) till Th1-linjen. T-Bet aktiverar direkt IFN – gentranskription och förbättrar utvecklingen av Th1-celler. T-Bet modulerar samtidigt IL-2 och Th2 cytokiner på ett IFN-oberoende sätt, vilket resulterar i en dämpning av Th2-cellutveckling. Många studier har visat att T-bet spelar flera roller i många subtyper av immunceller, inklusive B-celler, dendritiska celler, naturliga mördarceller (NK), NK-T-celler och medfödda lymfoida celler. Därför är T-bet avgörande för utveckling och samordning av både medfödda och adaptiva immunsvar. För att uppfylla dessa flera roller, t-bet genomgår flera posttranslationella proteinmodifieringar, såsom fosforylering vid tyrosin, serin, och treonin rester, och ubiquitination vid lysinrester, som påverkar härstamning engagemang under TH celldifferentiering. Denna översyn presenterar en aktuell översikt över de framsteg som gjorts för att förstå rollerna för olika typer av t-bet-proteinmodifieringar i regleringen av cytokinproduktion under TH-celldifferentiering.

1. Inledning

T-Bet (T-box protein uttryckt i T-celler, även kallad TBX21) beskrevs först 2000 i en rapport som undersökte effekterna av T-bet på differentieringen av T helper 1 (Th1) celler . Under de senaste 15 åren har många studier undersökt funktionerna hos T-bet och har avslöjat flera roller för detta protein under TH-celldifferentiering, med fokus på de involverade molekylära mekanismerna, de nya funktionerna för denna transkriptionsfaktor i medfödda immunceller och T-bet-medierad modulering av inflammatoriska sjukdomar . Det har klargjorts att T-bet spelar en kritisk roll i samordningen av medfödd immunitet och adaptiv immunitet och att den uppfyller en viktig funktion för att modulera kroniska inflammatoriska sjukdomar, inklusive astma och inflammatorisk tarmsjukdom, genom att kontrollera ett nätverk av mycket konserverade genetiska program . Således verkar optimal reglering av t-bet-uttryck och aktivitet vara fördelaktigt för att förebygga eller behandla kronisk inflammation och autoimmuna sjukdomar.

även om försök har gjorts för att identifiera de små molekylerna som styr uttrycket och aktiviteten hos T-bet som påverkar det t-cellmedierade immunsvaret, har små framsteg gjorts på detta hittills. Med tanke på vikten av T-bet i immunreglering, belysa de funktionella mekanismer som ligger till grund för flera roller av T-bet skulle underlätta utvecklingen av nya terapeutiska ingrepp för behandling av kroniska inflammatoriska och autoimmuna sjukdomar. Denna översyn sammanfattar det nuvarande kunskapsläget om de molekylära mekanismerna bakom de flera roller som t-bet spelar i Cellutvecklingen.

2. Struktur av T-Bet

T-bet innehåller en aminoterminal, en T-box-domän och en karboxylterminal, som visar 82%, 100% respektive 79% homologi mellan möss (530 aminosyrarestprotein) och människor (535 aminosyrarestprotein) (Figur 1). T-box-domänen, som ligger mellan rester 135 och 326 i mus-t-bet, är mycket bevarad i 18 Medlemmar av T-box-proteinfamiljen (TBX). Vanliga funktioner som delas av T-box-proteiner inkluderar en kapacitet för DNA-bindning genom T-box-domänen och transkriptionell reglerande aktivitet, som spelar en roll för att kontrollera uttrycket av utvecklingsgen i alla djurarter.

Figur 1

struktur och proteinmodifiering av T-bet. Mus och mänsklig t-bet är 100% identisk i T-box-domänen. Flera aminosyrarester bevaras hos möss och genomgår posttranslationella modifieringar, inklusive fosforylering vid serin -, treonin-och/eller tyrosinrester och ubiquitinering vid lysinrester.

T-box-domänen består av cirka 180 aminosyrarester och är både tillräcklig och nödvändig för bindning till konsensus-DNA-sekvensen TCACCCT . Brachyury (T) var det första T-box-proteinet som identifierades och interagerar i dimerisk form med de stora och de mindre spåren av DNA genom hydrofoba interaktioner och ovanlig huvudkedjig karbonylkontakt med en guanin som en dimer . TBX1 binder också till DNA-sekvensen som en dimer, medan TBX2 verkar binda till samma DNA-sekvens som en monomer . Även om TBX1 och TBX2 delar 61% identitet i T-box-domänen verkar strukturen hos DNA – t-boxbindningskomplexet vara annorlunda på grund av den låga homologin bland de amino-och karboxylterminala regionerna. T-box-domänen i T-bet visar 50% homologi med motsvarande domän i brachyury (T), TBX1 och TBX2; emellertid återstår kristallstrukturen för T-bet bunden till DNA-sekvensen att karakteriseras.

3. Reglering av th-celldifferentiering med T-Bet

3.1. Stimulering av Th1-celldifferentiering med T-Bet

t-bet binder direkt till konsensus-DNA-sekvensen inom IFNG-promotorn och aktiverar dess transkription. Det T-bet-inducerade uttrycket av IFNG härleder TH-prekursorceller för att differentiera till Th1-effektorceller. Medan exogent t-bet-överuttryck i na-celler ökar företrädesvis utvecklingen av Th1-celler, leder t-bet-brist till ett misslyckande med att producera tillräcklig IFN-GHz och minskar därför genereringen av Th1-celler . T-Bet-uttrycket ökas väsentligt genom stimulering av T-cellreceptorn (TCR) och förstärks genom cotreatment med IFN-Kazaki och IL-12. IFN-Macau binder till dess receptor och inducerar aktivering av signalomvandlare och aktivator för transkription (STAT) 1 och transkription av T-bet-genen (TBX21). Därefter stimulerar T-bet direkt transkriptionen av IFNG såväl som IL12RB2. Uttryck av IL – 12-receptor (IL-12R) 2 på cellytan förbättrar ytterligare produktionen av IFN-12 genom IL-12 och STAT4-signalvägen, vilket resulterar i preferentiell Th1-celldifferentiering. Intressant kan verkställt t-bet-uttryck också konvertera de differentierade Th2-cellerna till Th1-celler . Därför är T-bet placerad vid kärnan i de regulatoriska vägarna som inducerar IFN-bisexuell i Th-celler.

3.2. Dämpning av IL-2-produktion med T-Bet

förutom IFN-regler i Brasilien, undertrycker T-bet signifikant uttrycket. Denna cytokin, en tidig t-celltillväxtfaktor, är väsentlig för aktivering, proliferation och differentiering av Th-celler och produceras rikligt vid TCR-stimulering. Ektopiskt införd t-bet undertrycker signifikant IL-2-produktion genom inhibering av kärnfaktor kB (NF-kB) p65-aktivitet, under betingelser för både Th1 och Th2-differentiering . Under Th1-celldifferentiering dämpas också IL-2-transkription vid induktion av T-bet. Den t-bet-medierade IL-2-hämningen kan påverka cellutvidgningen och utsökt modulera det Th1-medierade immunsvaret vid exponering för ett patogent antigen.

3.3. Undertryckande av Th2-cellutveckling av T-Bet

vidare undertrycker exogen t-bet-introduktion i Th-celler produktionen av Th2-cytokiner, såsom IL-4, IL-5 och IL-13, via undertryckande av GATA-bindande protein-3 (GATA-3). Följaktligen inducerar en brist på T-bet spontan Th2-cellutveckling in vitro och in vivo . Den Th2-suppressiva aktiviteten hos T-bet bekräftades också i frånvaro av IFN-GHz, vilket indikerar att T-bet har en diskret hämmande funktion, oberoende av stimulering av IFN-SAS.

3.4. Andra funktioner hos T-Bet

nyligen har många studier rapporterat att T-bet också modulerar andra TH-celllinjer, inklusive Th17 -, Treg-och follikulära Th-celler (TFH), i samordning med många transkriptionsfaktorer, såsom retinsyra-relaterad orphan receptor-yt (RORyt), runt-relaterad transkriptionsfaktor 3 (RUNX3) och B-celllymfom-6 (BCL6) . Dessa fynd tyder på att T-bet är en transkriptionsfaktor som är kritisk för finjustering av cellutvecklingen.

4. Posttranslational modifiering av T-Bet

t-Bet fungerar som en multitasking spelare i regleringen av th celldifferentiering. De molekylära mekanismerna som ligger till grund för den stimulerande och hämmande aktiviteten hos T-bet vid reglering av målgenuttryck återstår emellertid att klargöras. Många multitasking-proteiner är kända för att genomgå posttranslationella proteinmodifieringar och för att bestämma cellöden genom att utöva direkt stimulerande och indirekt hämmande aktivitet på målgenuttryck .

4.1. Tyrosinfosforylering av T-Bet

Antikroppsbaserad detektion av t-bet-proteiner i västra blottar resulterar i flera band, vilket tyder på posttranslationell modifiering av T-bet i TCR-utlösta Th-celler. Tyrosinfosforylering av t-bet-protein sker främst under de tidiga stadierna (dag 2 till 3) av th-cellutvecklingen, vid TCR-ingrepp och minskar efteråt. Behandling av Th-celler med tyrosinfosfatashämmaren pervanadat ökar tyrosinfosforyleringen av T-bet. T-Bet är huvudsakligen lokaliserat i kärnan, och det nukleära tyrosinkinaset IL2-inducerbart tyrosinkinas (ITK) identifierades som det ansvariga uppströms tyrosinkinas. ITK-brist förhindrar tyrosinfosforylering av T-bet i Th-celler efter stimulering med TCR och IL-12. Mutationsforskning har visat att tyrosinrest 525 (Y525) är det relevanta fosforyleringsstället och att fosforylering på denna plats spelar en viktig roll i interaktionen med GATA-3. Även om t-boxdomän i T-bet är viktig för DNA-och protein-proteininteraktion, tyrosinfosforylering av Y525 är förutsättning för undertryckande av GATA-3-medierad Th2-celldifferentiering. Blockad av y525-fosforylering upphäver interaktionen med och undertryckandet av GATA-3, vilket resulterar i försämring av Th2-undertryckning .

dessutom inducerar ett annat nukleärt tyrosinkinas, c-Abl, fosforylering av T-bet vid tyrosinrester 219, 265 och 304 i mus T-bet . En brist i c-Abl såväl som mutation av T-bet vid dessa rester (y219/265/304F mutanter) leder till ett misslyckande med att öka IFN-bronkialinduktion och att undertrycka Th2-cytokinproduktion på grund av förlusten av fosforylering vid dessa tyrosinrester. Detta resulterar i sin tur i förvärring av allergisk lunginflammation in vivo . Dessa fynd tyder på att ITK – och c-Abl-inducerad tyrosinfosforylering av T-bet är väsentlig för moduleringen av Th2-cellutveckling och det allergiska immunsvaret.

4.2. Serin fosforylering av T-Bet

även om T-bet-medierad undertryckning av Th2-cellutveckling försämras genom mutation av Y525 och frånvaron av c-Abl-Kinas, behålls IL-2-undertryckning med en Y525-mutant T-bet, vilket tyder på förekomsten av en ytterligare regleringsmekanism för IL-2-modulering . Intressant kan utseendet på flera band av t-bet-protein på västra blottar elimineras genom tillsats av kalvtarmsfosfatas, vilket övervägande eliminerar fosforylering vid serin/treoninrester. Masspektrometrisk analys avslöjade sedan serin 508 (S508) som ett annat fosforyleringsställe i T-bet. Mutation av S508 avskaffar kaseinkinas – (CK -) och glykogensyntaskinas-3 (GSK-3 -) medierad fosforylering i T-bet, liksom den IL–2-undertryckande aktiviteten hos proteinet. Dessutom är S508-fosforylering viktig för interaktionen mellan T-bet och NF-kB p65 och för att förhindra bindning av NF-kB p65 till IL2-promotorn. I enlighet med funktionen av T-bet som en NF-kB p65-hämmare upprätthåller t-bet-null Th1-celler NF-kB p65-aktivitet under Th1-celldifferentiering och producerar därmed mer IL-2. Därför har det föreslagits att T-bet är en fysiologisk hämmare av IL-2 under Th1-celldifferentiering, genom S508 fosforyleringsberoende undertryckning av NF-kB p65.

4.3. Treonin fosforylering av T-Bet

mycket nyligen karakteriserades treonin 302 (T302) som ett nytt fosforyleringsställe i T-bet , även om det fortfarande är oklart vilket Kinas och fosfatas som påverkar fosforyleringen av denna Rest. Återställandet av t-bet-null Th-celler med en t302-mutant T-bet stimulerade emellertid IFN-Macau-produktion lika mycket som wild-Typ T-bet; emellertid misslyckades mutanten att undertrycka IL-2 och andra Th2-cytokiner. Ytterligare analys visade att t302-fosforylering krävs för interaktionen mellan T-bet och kärnfaktor för aktiverade T-celler (NFAT) och för nedreglering av NFAT-medierade IL-2-och Th2-cytokiner, såsom IL-4, IL-5 och IL-13. NFAT är inte avgörande för induktion av produktion av IFN-megapixlar och t302-mutant T-bet kan binda till IFNG-promotorn; således var IFN-hawaiiproduktionen jämförbar mellan vildtyp och mutant T-bet. Med andra ord upphävde mutation av T302 den T-bet-medierade undertryckningen av IL-2 och Th2-cytokinproduktion men påverkade inte DNA-bindningen och IFN-Kazaki-stimulerande aktiviteten hos T-bet.

faktum är att T302 ligger i DNA-bindande T-box, liksom Y304 . T-boxdomänen består av flera upprepningar av strängar och spiraler för att förstärka och binda DNA . Muller och Herrmann förutspådde att AH3 och aH4 i brachyury (t) är viktiga för den direkta interaktionen mellan detta protein och DNA: s mindre och större spår . T302 kan emellertid inte associeras direkt med DNA-spåren, oavsett dess fosforyleringsstatus. Det skulle vara intressant att veta vilket uppströms Kinas och fosfatas reglerar t302 fosforylering och om t302 fosforylering påverkar andra proteinmodifieringar av T-bet.

4.4. Ubiquitination av lysin 313 i T-Bet

t-bet-uttryck är avgörande för transkriptionsreglering av IFNG och för utveckling av Th1-celler, men sättet att reglera T-bet på proteinnivån är ännu inte identifierat. Jang et al. har nyligen rapporterat att T-bet genomgår ubiquitinationsmedierad proteasomal nedbrytning under de senare stadierna av Th1-celldifferentiering . Av de 16 lysinrester som finns i mus-t-bet-protein är 11 övervägande belägna inom T-box-domänen och de återstående 5 är belägna vid karboxylterminalen (rester 326 till 530), medan inga lysinrester finns i amino-terminalen (rester 1 till 134). Intressant är att lysinrester inom t-boxdomänen företrädesvis ubiquitineras vid överuttryck av ubiquitin. Ytterligare analys har identifierat att mutation av lysin 313 (K313) minskar ubiquitinationsmedierad t-bet-nedbrytning och förbättrar expressionsnivån för T-bet i kärnan och cytoplasman. Trots de ökade nivåerna av k313-mutanten upphävde denna mutation fullständigt t-bet-funktioner som involverade DNA-bindning, transkriptionsaktivering av IFNG och undertryckande av IL-2-och Th2-cytokinproduktion. Kristallstrukturen hos T-boxdomänens t-spiraler bundna till DNA antyder starkt att aminogruppen K313 är associerad med fosfatet i en DNA-bas via vätebindningsinteraktion. Dessutom leder mutation av K313 också till misslyckande att undertrycka IL-2 och Th2 cytokinproduktion; interaktionen med och undertryckandet av GATA-3 och NF-kB p65 förändras emellertid inte genom mutation av K313. Intressant är att nfat-interaktion avskaffas i K313-mutant T-bet, vilket också är starkt förknippat med en frånvaro av fosforylering vid T302. Det är ännu inte klart om och hur K313 reglerar t302 fosforylering och vice versa.

5. T-Bet vid inflammatoriska och autoimmuna sjukdomar

sedan Mosmann et al. upptäckt Th1-och Th2-delmängder som producerar signaturcytokiner, IFN-bronkialoch IL-4, IL-5, och IL-13, respektive , och som modulerar inflammatoriska och allergiska immunsvar, ytterligare studier har identifierat nya delmängder av Th-celler, såsom Th17, TFH och Treg-celler . Omfattande studier har också karakteriserat cytokinsignaleringsvägarna och transkriptionsfaktorerna som är involverade i reglering av immunsvar mot patogener . Viktigt är att T-bet spelar en grundläggande roll för att kontrollera differentiering av flera delmängder av Th-celler och för att modulera inflammatoriska och autoimmuna sjukdomar .

t-Bet fungerar också som en antiastmatisk regulator. En brist i T-bet leder spontant till utvecklingen av astmatiska symtom, som kännetecknas av ökad eosinofilinfiltrering i luftvägarna, slemutsöndrande bägge cellhyperplasi och kronisk luftvägsremodellering med kollagenackumulering och proliferativa myofibroblaster; dessa egenskaper ses ofta också hos astmatiska patienter . Återställande av t-bet-uttryck förskjuter immunbalansen till ett Th1-svar och förhindrar och dämpar patologisk lunginflammation in vivo .

dessutom är T-bet skyddad mot intracellulära patogena infektioner. Abrogation av t-bet-inducerad IFN -tusiliproduktion resulterade i högre mottaglighet för intracellulära patogener in vivo, inklusive Mycobacterium tuberculosis, Leishmania major och Salmonella typhimurium, betonar vikten av IFN -tusiliproduktion genom att t-bet-uttrycka Th1-celler i försvaret mot bakterieinfektioner. T-bet-bristfälliga möss är emellertid resistenta mot infektion av Listeria monocytogenes, eftersom INF-askorbinproduktion av naturliga mördarceller är både nödvändig och tillräcklig för värdförsvaret mot L. monocytogenes .

Dessutom kan T-bet förvärra utvecklingen av inflammatoriska och autoimmuna sjukdomar, inklusive inflammatorisk tarmsjukdom, experimentell autoimmun encefalomyelit, inflammatorisk artrit och typ i-diabetes, eftersom dessa inflammatoriska sjukdomar dämpas i frånvaro av T-bet . Dessa resultat tyder på att finjustering av immunsvaret genom modulering av t-bet-uttryck kan ha fördelaktiga effekter för patienter med kronisk astma, inflammatorisk tarmsjukdom, artrit, multipel skleros och diabetes.

6. Slutsatser och perspektiv

T-bet är en T-box-domäninnehållande transkriptionsfaktor som vanligtvis är involverad i utvecklingsreglering men utövar flera funktioner i th-celldifferentiering; transkriptionsaktivering av IFN-exporterande Th1-celler, indirekt undertryckande av Th2 -, Th17-och Treg-cellutveckling och finmodulering av IL-2-produktion i Th1-celler. Denna multitasking är inte förvånande, eftersom T-bet genomgår flera posttranslationella modifieringar. Fosforylering vid Y525 spelar en roll i GATA – 3-undertryckning under Th2-reglering, fosforylering vid S508 orsakar NF-kB p65-undertryckning i samband med IL-2-reglering i Th1-celler, fosforylering vid T302 spelar en roll vid finjustering av IL-2-produktion och ubiquitination vid K313 spelar en roll för att kontrollera t-bet-proteinstabilitet. Således underlättar posttranslationell modifiering av T-bet dess funktionella mångfald och komplexiteten i dess modulering av cytokinuttryck (Figur 2). Det är inte känt om de olika posttranslationella modifieringarna sker sekventiellt eller samtidigt, om en typ av proteinmodifiering påverkar annan modifiering eller om förändringar i posttranslationell modifiering av T-bet är relaterade till utvecklingen av infektiösa och kroniska inflammatoriska sjukdomar. Ytterligare identifiering av nya proteinmodifieringar relaterade till T-bet-funktioner skulle ge värdefull insikt i utvecklingen av kraftfulla terapeutiska ingrepp för att kontrollera kroniska inflammatoriska och autoimmuna sjukdomar.

Figur 2

Flera t-bet funktioner spelar en roll i th celldifferentiering. Induktion av t-bet-uttryck genom aktivering av STAT1 och STAT4 stimulerar direkt transkriptionen av T-box-bindande elementinnehållande gener, såsom IFNG, IL12RB2 och CXCR3, vilket förbättrar Th1-cellutvecklingen. T-Bet genomgår serinfosforylering vid S508 och nedreglerar sedan IL-2-produktion i Th1-celler genom att rekrytera NF-kB p65 från IL2-promotorn. Proteinnivåer av T-bet I Th1-celler kan kontrolleras av den ubiquitinmedierade proteasomala nedbrytningsvägen. Dessutom genomgår t-bet-protein ytterligare posttranslationella modifieringar, exempelvis fosforylering vid T302 och Y525, vilket underlättar dess undertryckande av Th2-cytokinproduktionen som induceras genom aktivering av NFAT och GATA-3.

lista över förkortningar

intressekonflikt

ingen potentiell intressekonflikt avslöjades.

bekräftelse

detta arbete stöddes av Mid-Career Researcher Program genom NRF Grant (2013r1a2a2a01068302).